Metastatic disease remains the main cause of death from cancer. Few therapeutic options for patients have demonstrated potential in curing metastatic disease. The molecular mechanisms underlying site-specific metastasis and the factors mediating tumor cell homing remain largely unknown. Based on a murine Lewis lung carcinoma tumour model of site-specific metastasis mediated by the expression of the insulin-like growth factor - I receptor (IGF-IR), we identified ECM components that show particular promise in regulating metastasis to a specific site. Specifically, we identified collagen IVα1 and α2 as differentially expressed in liver- and lung-colonizing cells. The overexpression of these genes caused major changes to cell structure and function including differences in cellular morphology, anchorage-independent growth, and resulted in a switch from a lung- to a liver-metastasizing phenotype. These changes were at least in part due to α2-integrin-mediated activation of focal adhesion kinase (FAK) and protection from anoikis. Collagen IV α1 suppression resulted in increased anoikis and decreased tumour cell colonization of the liver, making it an essential and sufficient gene in liver metastasis in our model. Moreover, type IV collagen overexpression resulted in major changes to ECM and ECM-degradation genes decreasing MMP-3, MMP-9, MMP-13, and collagen type III. Uveal melanoma cells with distinct metastatic phenotypes also showed major changes to these genes. Finally, by analyzing human specimens of metastatic disease, collagen IV was shown to be expressed only in metastatic and specifically hepatic metastases when compared to primary tumours and metastases to other organs. Collectively, these findings implicate collagen IV as a clinically relevant marker and potential target against site-specific metastasis to the liver. / Le cancer métastatique ne présente que peu d'options thérapeutiques et de ce fait constitue la cause principale de décès chez les patients qui en sont atteints. Par ailleurs, les mécanismes moléculaires responsables de l'atteinte d'organes-cibles de la métastase par les cellules cancéreuses demeurent largement méconnus. La thèse qui suit présente l'identification d'un marqueur moléculaire qui apparait comme étant un facteur crucial dans l'atteinte des organes-cibles par les cellules métastatiques. En effet, la constituante de la matrice extracellulaire collagene IVα1 et α2, semble être exprimée de manière distinctive chez les cellules colonisant le foie et les poumons. Nous basant sur un modèle murin de métastase provenant de carcinome pulmonaire et véhiculée par l'expression de IGF-IR, nous avons identifié des changements majeurs quant à la structure et à la fonction des cellules cancéreuses, suite à la surexpression des gènes du Collagene IVα1 et α2. Ces changements comprennent, entre autre, des différences au niveau de la morphologie et la croissance cellulaire et ont aussi pour résultat la mutation du phénotype métastatique de pulmonaire à hépatique. Ces changements sont en partie conséquence de l'activation de la kinase d'adhésion focale (FAK) et de la protection de l'anoikis. Par contre, la suppression de l'expression du Collagène IV accroit l'anoikis et diminue la colonisation du foie par les cellules cancéreuses. En outre, la surexpression du Collagène IV apporte des changements majeurs au niveau de la matrice extracellulaire et aux gènes de dégradation de celle-ci, diminuant MMP-3, MMP-9, MMP-13 et le collagène III. Les cellules de mélanome uvéale à phénotype métastatique distinct présentent aussi des changements importants quant à l'expression ces gènes. Finalement, après analyse de spécimens humains, le collagène IV semble être exprimé exclusivement au niveau des tumeurs métastatiques et en

Cellular regulation and signalling can occur at numerous levels and post-translational modification by phosphorylation is a method of regulating these pathways. This reversible phenomenon requires a strict balance between kinases and phosphatases at various steps along a signalling pathway. One phosphatase that has gained increasing interest in cytoskeleton regulation and cellular signalling is the protein tyrosine phosphatase PTP-PEST. Much of these investigations have uncovered numerous binding partners and key interactors of PTP-PEST that were found to be regulated in part by their phosphorylation status. Our goal was to examine and expand the role of PTP-PEST in applying the technique of affinity-purification coupled with mass spectrometry (AP-MS) and constructing an interactive network. Our previous work involved identifying putative substrates in utilizing a modified yeast two-hybrid method with PTP-PEST. Several of which were determined to be true interactors by this method, including p130Cas, paxillin, and a novel substrate termed Skap-Hom. We applied the AP-MS technique to screen for novel PTP-PEST interactions. Herein, we've identified two new interactors of PTP-PEST, Arhgap26 and PPM1A. Both may be involved in regulating migration or cytoskeletal changes which may correlate with PTP-PEST function. AP-MS is proving itself to be a useful method and other potential targets will be further confirmed. In addition, we applied a bioinformatics approach using the Cytoscape visualization software to generate a first PTP protein-protein interaction map; the PTP-PEST interactome. An understanding of the substrates that are regulated by PTP-PEST and their associated roles in the cell allows us to elucidate mechanisms and develop potential therapeutic targets for various malignancies, especially that of cancer. / La signalisation cellulaire et sa régulation prennent place à plusieurs niveaux dans la cellule. Ici nous avons étudié le mécanisme des modifications post-transcriptionnelles par phosphorylation. Ce phénomène réversible nécessite un équilibre entre les kinases et les phosphatases à plusieurs niveaux d'une voie de signalisation. PTP-PEST est une phosphatase qui suscite de plus en plus d'intérêt dans la régulation du cytosquelette et la signalisation cellulaire. Plusieurs études ont identifié de nombreuses protéines d'interactions et de liaisons de PTP-PEST qui sont régulées par leur statut de phosphorylation. Notre but est d'examiner et d'élargir nos connaissances sur le rôle de PTP-PEST en utilisant des techniques de purification par affinité ainsi que la spectrophotométrie de masse (PA-SM) afin de construire un réseau d'interaction des protéines.Nous avons précédemment identifié des substrats putatifs de PTP-PEST avec la méthode modifiée de double-hybride dans la levure. Plusieurs substrats identifiés sont des protéines de liaison de PTP-PEST, incluant p130Cas, paxillin et un nouveau substrat appelé Skap-Hom. Grâce à la méthode PA-SM, pour le criblage de nouvelles protéines d'interactions, nous avons identifié 2 nouveaux partenaires de liaison de PTP-PEST : Arhgap26 et PPM1A. Ces deux protéines pourraient être impliquées dans la régulation de la migration ou dans les changements cytosqueletiques avec PTP-PEST. La méthode PA-SM a prouvé son utilité et d'autres cibles de PEST seront analysées de cette façon. Avec le logiciel bioinformatique Cytoscape visualization, nous avons généré la première carte d'interactions protéine-protéine : l'intéractome de PTP-PEST. Comme les protéines d'intéractions de PEST identifiées ici sont impliquées dans la migration cellulaire, il y aura une possibilité d'une corrélation avec le cancer. Ceci nous permettrons de l'expansion sur le développement de cibles thérapeutiques potentielles pour le cancer.

The proto-oncogene ErbB2 is overexpressed and amplified in 20-30% of human breast cancers, and was identified as the causal agent through the use of mouse models. However, these models required the use of, or the acquisition of an activated form of ErbB2 in order for tumour formation. There are no activating mutations in human ErbB2 breast cancers, but proteolytic cleavage and alternative splicing of ErbB2 can generate activated forms. To study the biology conferred by extracellular domain shedding and the alternative splicing deletion of exon 16, a set of physiologically relevant NMuMG explant cell lines were created. A non-cleavable mutant cell line was used to examine the role of extracellular domain shedding on receptor down-regulation, signaling and tumourigenesis. To confirm the role of the alternatively spliced form, ErbB2∆Ex16, in mammary tumourigenesis a doxycycline inducible transgenic mouse model was created in order to study the protein in vivo. / Le proto-oncogène ErbB2 est surexprimé et amplifié dans 20-30% des cancers du sein humain, et a été identifié comme l'agent causal par l'utilisation de modèles de souris. Cependant, ces modèles a nécessité l'utilisation de, ou l'acquisition d'une forme de ErbB2 activé pour que la formation de tumeurs. Il n'ya pas de mutations activatrices de l'homme des cancers du sein ErbB2, mais clivage protéolytique et l'épissage alternatif de ErbB2 peut générer des formes activées.Pour étudier la biologie conférés par domaine extracellulaire l'excrétion et la suppression épissage alternatif de l'exon 16, un ensemble de lignes physiologiquement pertinents NMuMG cellule explant ont été créés. Une lignée cellulaire non clivable mutant a été utilisé pour examiner le rôle du domaine extracellulaire du récepteur verser sur une régulation, de signalisation et la tumorigenèse. Pour confirmer le rôle de la forme épissage alternatif, ErbB2ΔEx16, dans la tumorigenèse mammaire un modèle de souris transgénique inductible doxycycline a été créé afin d'étudier la protéine in vivo.

The main objective of this thesis is to characterize the mechanisms of nuclear transport of the cytosolic yeast heat shock protein 70 Ssa4p upon ethanol stress and the effect of stress and nutrient availability on transport carriers. / Heat shock protein 70 (Hsp70) plays an important role in cell damage recovery and transport of proteins across intracellular membranes. Upon stress, trafficking of the majority of proteins is inhibited with the exception of Hsp70 that accumulates in the nucleus. Using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as model, this thesis specifically demonstrates that Ssa4p transiently and reversibly accumulates in nuclei upon ethanol stress and exports to the cytoplasm during ethanol recovery. The cNLS-mediated classical nuclear import pathway is not required for stress-induced Ssa4p nuclear trafficking, and the N-terminal 236 amino acid residues are sufficient for Ssa4p nuclear accumulation. The importin beta family member Nmd5p forms import complexes with its cargo Ssa4p and translocates cargo into the nucleus. Upon withdrawal of ethanol stress, Ssa4p exports to the cytoplasm by binding to the exporter Msn5p. Transport of Ssa4p in both directions requires the Gsp1p system. Pkc1p and the cell integrity pathway sensors are involved in Ssa4p nuclear import upon ethanol treatment. / The thesis also states that ethanol stress regulates Ssa4p nuclear transport by enhancing the import complex Ssa4p/Nmd5p formation and the docking of Nmd5p at the NPC. Stresses regulate Ssa4p nuclear export by regulating exporter Msn5p cellular localization and formation of the export complex Ssa4p/Msn5p. Therefore, the carrier-mediated nuclear trafficking might also be regulated by the transport carrier localization. Furthermore, intracellular localization of yeast nuclear exporters is sensitive to different stresses and regulated by Snf1 kinase and cell nutrient availability. / In summary, this thesis defines the nuclear import and export mechanisms for the Hsp70 Ssa4p and their regulation in stressed cells. The novel finding of how the nutritional state and Snf1 kinase regulate exporter localization in general may provide a better understanding of protein transport regulation and the multiple levels cells use to adjust to environmental changes.

Muscle wasting is a significant complication of many diseases. Previous work has shown that USP19 mRNA expression is increased in muscle undergoing atrophy in rodents [1]. To further explore the role of USP19 in muscle, siRNA-mediated silencing was used in L6 muscle cells. Depletion of USP19 resulted in increased major myofibrillar protein levels [2]. These effects of silencing USP19 on myofibrillar protein expression may be due to the effects of USP19 on the differentiation of muscle cells. Therefore, in this thesis I further characterized the mechanism by which depletion of USP19 enhances expression of myofibrillar proteins. MHC and tropomyosin mRNA levels were increased upon USP19 silencing, suggesting that the observed increases in protein levels were due to increased transcription. Myogenin, a transcription factor in the myogenic regulatory factor family that regulates muscle differentiation, was increased by more than two fold at both mRNA and protein levels when USP19 was silenced and found to be responsible for mediating the increase in myofibrillar protein expression. The negative role of USP19 in muscle differentiation was confirmed as overexpressing USP19 resulted in decreased myogenin and major myofibrillar protein expression at the molecular level and decreased myotube fusion at the morphological level. The regulation of USP19 itself during muscle differentiation was then investigated. The mRNA levels were found to increase by ~ 4 fold from day 0 to day 5 of differentiation, while there was a ~ 1.5 fold increase in protein levels. USP19 is localized in both the cytosol and the nucleus but there was increased localization in the nucleus on day 4 of muscle cell differentiationd. In conclusion, USP19 negatively regulates muscle differentiation. Since new myoblast fusion and myofiber formation may occur during recovery from wasting, an inhibitor to USP19 could be a new approach to the treatment of muscle wasting. / L'atrophie musculaire est une complication considérable de plusieurs maladies. Des études antérieures ont démontré que l'expression de l'ARN messager de USP19 est régulé à la hausse dans plusieurs modèles d'atrophie musculaire chez les rongeurs [1]. Afin de mieux comprendre le rôle de USP19 dans les muscles, nous avons utilisé des ARN interférents dans des cellules musculaires L6. La réduction des niveaux de USP19 a conduit à une augmentation des niveaux des protéines myofibrillaires prédominantes [2]. Les conséquences d'une réduction des niveaux de USP19 sur l'expression des protéines myofibrillaires pourrait être dû à l'effet de USP19 sur la différentiation des cellules musculaires. Par conséquent, dans cette thèse, j'ai caractérisé plus en profondeur le mécanisme par lequel une réduction de USP19 mène à une augmentation de l'expression de protéines myofibrillaires. Nous avons observé que les niveaux d'ARN messagers de MHC et de la tropomyosine sont augmenté suite à la réduction de USP19 par ARN interférent, ce qui suggère que la hausse des niveaux protéiques est dû à une augmentation de la transcription. Le facteur de transcription myogénine fait partie de la famille des facteurs de régulation myogénique impliqués dans la différentiation musculaire et est responsable de l'augmentation de l'expression des protéines myofibrillaires. Nous avons observé que le niveau de ces protéines sont augmentés de plus de deux fois autant au niveau de l'ARN messager qu'au niveau protéique quand USP19 est réduit par ARN interférent. Le rôle de USP19 dans la différentiation musculaire a aussi été démontré en surexprimant USP19 dans des cellules musculaires. Une augmentation des niveaux de USP19 a conduit à une réduction de l'expression des principales protéines myofibrillaires ainsi que la myogénine au niveau moléculaire et à une réduction de la différentiation des myotubes au niveau morphologique. La regulation de USP19 pendant la différentiation musculaire a donc été étudié. Les niveaux d'ARN messagers de USP19 sont augmentés ~4 fois durant les 5 premiers jours de différentiation alors que les niveaux protéiques sont augmentés ~1.5 fois. De plus, USP19 est localisé autant dans la partie cytosolique que dans le noyau cellulaire. Une augmentation de la localisation de USP19 dans le noyau au 4ème jour de différentiation a été observé. En conclusion, USP19 est un régulateur négatif de la différentiation musculaire. Puisque la formation de nouveau fibres musculaires peut apparaître suite à la récupération de l'atrophie, un inhibiteur de USP19 pourrait être une approche intéressante pour le traitement de l'atrophie musculaire.

Infections caused by antibiotic-resistant bacteria can cause severe problems in patients with a weak immune system, such as those with cystic fibrosis. One such bacterium, Pseudomonas aeruginosa, is extremely difficult to eradicate and is the leading cause of mortality in individuals with cystic fibrosis. One mechanism that Pseudomonas aeruginosa employs to become resistant against antibiotics is biofilm formation. The protective mechanisms present in biofilms appear to be different from those that are responsible for conventional antibiotic resistance. Genetic and biochemical details of the biofilm forming mechanism are only just emerging and genes that contribute to this resistance are a major target for the development of new chemotherapeutic agents. The aminoglycoside response regulator (Arr) protein plays a crucial role in the induction of biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa upon exposure to the antibiotic tobramycin. In this thesis, I present the three-dimensional 30 Å resolution structure of Arr, which was obtained using single particle reconstruction, a transmission electron microscopy method (TEM). Preliminary results have also been obtained with additional methods that provide clues regarding Arr's structure: electron crystallography was used to grow two-dimensional crystals of Arr and crystallization trials for X-ray crystallography have been carried out for one of Arr's soluble domains. / Les infections provoquées par les bactéries résistantes aux antibiotiques posent de graves problèmes aux patients qui ont un système immunitaire faible, en particulier ceux qui souffrent de la fibrose kystique. Une de ces bactéries, la Pseudomonas aeruginosa, est extrêmement difficile à supprimer et, de plus, est la principale cause de mortalité chez les individus atteint de la fibrose kystique. Un des mécanismes que la Pseudomonas aeruginosa emploie pour résister contre les antibiotiques est sa capacité à former des "biofilmes". Les détails génétiques et biochimiques de ces biofilmes émergent seulement récemment et donc la découverte des gènes responsables pour ce mécanisme de résistance est un but important à atteindre avant de pouvoir développer de nouveaux agents chémotherapeutiques contre les infections causées par Pseudomonas aeruginosa. La protéine régulatrice d'aminoglycoside (Arr) joue un rôle important dans la formation de biofilmes dans la bactérie Pseudomonas aeruginosa, une fois que la bactérie à été exposée à l'antibiotique tobramycine. Dans la thèse de maîtrise qui suit, je présente la structure tridimensionnelle de la protéine Arr à une résolution de 30 Å qui a été obtenu utilisant la "single particle reconstruction", qui est une méthode qui utilise la microscopie à transmission électronique (TEM). Des résultats préliminaires qui aident à élucider la structure de Arr ont également été obtenus avec des méthodes supplémentaires: la cristallographie d'électron a été employée pour générer des cristaux bidimensionnels de Arr et puis des essais de cristallisation par cristallographie à rayon X ont été effectuées sur un des domaines solubles de Arr.

Multi-cellular organisms generate functional and morphological diversity in their cells through spatiotemporal regulation of gene expression. Gene expression is regulated through multiple mechanisms at the levels of transcription, translation, and degradation. During my PhD studies, I examined transcription factor-induced somatic-to-induced pluripotent stem cell reprogramming. For this, I adopted two different strategies that are based on transcriptional regulation by post-translational modification and translational control by the translational repressor 4E-BP. Specifically, in the project described in Chapter III, I studied the role of sumoylation in controlling the transcriptional activity of KLF4, KLF2, and KLF5 during reprogramming and adipocyte differentiation. I also explored the role of Ubc9, the sole SUMO-conjugating enzyme, in reprogramming and adipogenesis. These results and a comprehensive review of related studies, presented in Chapter I, have helped me propose a model for the functional specificity of KLF family proteins. In the research project described in Chapter IV, I investigated the role of translational control in somatic cell reprogramming. This investigation uncovered a functional duality in 4E-BP-dependent translation during reprogramming that is controlled by the p53-p21 pathway. To introduce this chapter and to provide insights for future research, I summarize in Chapter II the current findings regarding the role of the PI3K/AKT/mTOR pathway--the main control of eIF4E-dependent translation--in regulating embryonic stem cell self-renewal and somatic-to-stem cell reprogramming. The results of this thesis may lead to a better understanding of the mechanism underlying cell type determination that has important application in regenerative medicine. / Les organismes multicellulaires génèrent la diversité fonctionnelle et morphologique de leurs cellules par une régulation spatiotemporel de l'expression de leur gène. L'expression de ces gènes est régulée par de multiples mécanismes au niveau de la transcription, de la traduction et de la dégradation. Pendant mon PhD, j'ai étudié la reprogrammation par des facteurs de transcription de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes. Pour ce faire, j'ai adopté deux stratégies basées sur le control de la transcription par des modifications post-traductionnelles et le control de la traduction par le répresseur 4E-BP. Spécifiquement, dans le projet décrit dans le Chapitre III, j'ai étudié le rôle de la sumoylation dans l'activité transcriptionnelle de KLF4, KLF2, et KLF5 pendant la reprogrammation et la pendant la différentiation des adipocytes. J'ai aussi exploré le rôle d'Ubc9, la seule enzyme capable de conjuguer un groupe SUMO à une protéine, dans la reprogrammation et l'adipogenèse. Les résultats de cette étude et la révision d'études connexes présentés dans le Chapitre I m'ont aidé à proposer un modèle pour la spécificité fonctionnelle de la famille de protéines KLF. Dans le projet de recherche présenté au chapitre IV, j'ai étudié le rôle du contrôle de la traduction dans la reprogrammation somatique. Cette étude m'a permis de découvrir la dualité fonctionnelle de la traduction eIF4E-dépendante durant la reprogrammation cellulaire contrôlée par la voie p53/p21. Pour introduire ce chapitre et pour discuter de recherches futures possibles, j'ai résumé dans le chapitre II les connaissances actuelles concernant le rôle de la voie de signalisation PI3K/AKT/mTOR—la principale voie qui contrôle la traduction eIF4E-dépendante--dans la régulation de la reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches et dans la régulation de l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires. Les résultats de cette thèse pourraient mener à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la détermination cellulaire qui aura d'importantes applications dans la médecine régénérative.

The human fungal pathogen Candida albicans is a diploid organism that lacks a complete sexual cycle, thus making functional genetics challenging. Consequently, linking a function to a gene often relies on predictions from other model organisms. In this thesis, I have explored different genetic strategies to address two important aspects of the biology of C. albicans, drug resistance and morphology, which are associated with virulence. Using a reverse genetics approach based on the model Saccharomyces cerevisiae, I first identify and validate a new drug target in C. albicans. Next, I use forward genetics screening directly in the pathogen to identify genes regulating morphology by showing that the Arp2/3 complex is required for the yeast-to-hyphae switch as well as virulence. Lastly, I follow up on the Arp2/3 complex and demonstrate how this fungus can be used to study some unique cell biological aspects regarding actin dynamics and endocytosis. Collectively, this thesis illustrates how various genomic techniques can be applied to understand different aspects of this human fungal pathogen. / La levure pathogène Candida albicans est un organisme diploïde n'ayant pas de cycle sexuel complet, ce qui rend difficile la génétique fonctionnelle. Par conséquence, la liaison d'un gène à une fonction repose souvent sur des prévisions à partir d'autres organismes modèles. Dans cette thèse, j'ai exploré différentes stratégies génétiques afin d'étudier deux aspects importants de la biologie de C. albicans, la résistance aux médicaments et la morphologie, qui est associée à la virulence. Avec l'aide d'une approche de génétique inverse basée sur l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae, j'ai d'abord identifié et validé une nouvelle cible thérapeutique chez C. albicans. Ensuite, j'ai utilisé la génétique directe de C. albicans pour identifier des gènes qui régulent sa morphologie. Ceci m'a permis de montrer que le complexe Arp2/3 est requis pour la formation des hyphes ainsi que la virulence. Enfin, je me suis concentré sur le complexe Arp2/3 et j'ai démontré que cette levure peut être utilisée pour étudier certains aspects unique de sa biologiques cellulaire, en particulier, la dynamique de l'actine et l'endocytose. Collectivement, cette thèse montre comment diverses techniques de génétique et de génomique peuvent être appliquées afin de comprendre différents aspects de ce pathogène fongique humain.

FKBP65 is a 65-kDa protein with four peptidyl-prolyl cis-trans isomerization domains followed by two Ca2+-binding domains and ending in a C-terminal HEEL sequence, a putative ER-retention sequence. It is encoded by the gene Fkbp10. Our lab first became interested in FKBP65 when it was found to be associated with tropoelastin in the secretory pathway of fetal bovine chondrocytes. Further investigation showed that Fkbp10 is expressed in a large number of developing tissues but did not correlate with tropoelastin gene (Eln) expression, suggesting additional ligands. Further experiments determined that FKBP65 associates with type-I collagen in the cell and that it is very highly expressed in developing bone. Recently, human mutations in FKBP10 have been linked to Osteogenesis Imperfecta (OI). This finding further implicates FKBP65 in the synthesis and/or assembly of collagen, especially in bone. To investigate the localization of FKBP65 in developing bone, immunohistochemistry was conducted. FKBP65 was found inside the osteoblasts, but also in the osteoid outside the cell. Western blotting of MC3T3 cells, an osteoblast cell line, showed that FKBP65 was not only present in the lysate, but also in the media, indicating that the protein was indeed being secreted. Using α,α'-dipyridyl to disrupt collagen processing and folding, the presence of FKBP65 in the media increased, suggesting that FKBP65 distribution in the lysate, media and matrix was dependent on the folding state of collagen. To determine if FKBP65 could be localized to post-ER compartments, MC3T3 cells were stained by immunofluorescence for FKBP65, HSP47 and type-I collagen in the absence or presence of secretion disrupting agents. α, α-dipyridyl was also used to cause mis-folding of the collagen. Results showed that FKBP65 did not take on the same pattern as the secreted type-I collagen. Finally, the type-I collagen matrix of primary cells from both OI patients and an FKBP65 knockout mouse were visualized to determine the effect of the absence of FKBP65 on type-I collagen assembly. The extracellular collagen matrix was not largely disrupted by the absence of FKBP65. Overall, these results demonstrate that FKBP65 is a secreted chaperone in type-I collagen synthesis. / FKBP65 est une protéine de 65kDa formée de quatre domaines peptidyl prolyl cis-trans isomérases, de deux domaines interagissant avec du calcium et d'une séquence présumée de rétention du réticulum endoplasmique HEEL dans le C-terminus. Cette protéine est encodée par le gène Fkbp10. Notre laboratoire a précédemment observé l'association de FKBP65 avec tropoélastine dans la voie de sécrétion des chondrocytes bovins fœtaux. D'autres études ont démontré l'expression de FKBP10 dans de nombreux tissus en développement. Puisque l'expression tissulaire de FKBP10 et de tropoélastine ne correspondent pas, d'autres ligands doivent interagir avec FKBP65. Comme FKBP65 interagit intracellulairement avec collagène de type I, qu'il est fortement exprimé dans les os en formation et que des mutations du gène FKPB10 ont été récemment associées avec la maladie ostéogenèse imparfaite, nous émettons l'hypothèse que FKBP65 joue un rôle dans la synthèse et/ou l'assemblée du collagène, en particulier dans le tissus osseux. Pour confirmer notre hypothèse, nous examinons par immunohistochimie la localisation de FKBP65 dans le tissue osseux. FKBP65 est présent dans les ostéoblastes, mais aussi à l'extérieure des cellules dans l'ostéoide. L'immuno-buvardage de type Western des cellules de lignée ostéoblastique MC3T3 a démontré la présence de FKBP65 non seulement dans le lysat mais aussi dans le milieu, indiquant que la protéine est sécrétée. La perturbation du traitement et du pliage de collagène I par α, α'-dipyridyl cause une augmentation du niveau de FKBP65 dans le milieu suggérant que la distribution de FKBP65 dans le lysat, le milieu et la matrice dépend de l'état du pliage de collagène I. Pour déterminer si FKBP65 est localisé dans les compartiments post-réticulum-endoplasmiques, une immunofluorescence en présence ou absence d'agents perturbant le pliage de collagène I (dont α, α'-dipyridyl) a été réalisée pour les protéines FKBP65, HSP47 et collagène I. Nos résultats démontrent que FKBP65 a un comportement diffèrent de collagène I. Finalement, des fibroblastes primaires provenant de patients souffrant d'ostéogenèse imparfaite et de souris knock-out pour FKBP65 ont été testés par immunofluorescence pour déterminer quels effets à l'absence de FKBP65 sur la matrice extracellulaire collagénique. La formation de la matrice n'est pas affectée par l'absence de FKBP65. En conclusion, ces résultats démontrent que FKBP65 est un chaperon sécrété lors de la synthèse du collagène de type I.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin 1 (Ang-1) are critical regulators of angiogenesis. Additionally, both have been found to participate in inflammatory processes: VEGF as a pro-inflammatory and Ang-1 as an anti-inflammatory mediator. Nur77 is a member of a family of orphan receptors (NR4A) that includes Nurr1 and Nor1 and plays a role in regulating vascular inflammation; however, this has yet to be fully understood. The aim of this study was to evaluate whether Nur77 expression in endothelial cells (ECs) serves as a negative feedback mechanism designed to inhibit NFkappaB induction, dampen VEGF-induced E-selectin and VCAM1 expression and enhanced leukocyte adhesion to ECs, and mediate the suppression of EC activation induced by Ang-1 treatment.Treatment of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with either VEGF or Ang-1 significantly and transiently induced Nur77 expression and enhanced PKD-dependent HDAC7 phosphorylation and mobilization from the nucleus to the cytosol. HUVECs transduced with adenoviruses expressing mutated HDAC7 or a dominant-negative PKD1 inhibited VEGF-, but not Ang-1-, induced Nur77 expression. Inhibition of PI3K and ERK1/2 resulted in the suppression of Ang-1-induced Nur77 expression whereas the inhibition of JNK resulted in significantly greater induction of Nur77 by Ang-1. NFκB binding activity and gel shift assays revealed that Nur77 inhibits VEGF-induced NFκB activity. Overexpression of Nur77 showed titre-dependent upregulation of IκBα mRNA and protein expressions that was not evident in HUVECs transduced with viruses expressing a dominant-negative form of Nur77 (Ad-dnNur77). Functionally, Nur77 was found to suppress VEGF-induced mRNA and protein expressions of the adhesion molecules E-selectin and VCAM1. Importantly, the role of Nur77 in cytokine-induced leukocyte adhesion to ECs was examined. Adherence of U937 cells to HUVECs activated by VEGF was suppressed by overexpressing Nur77 whereas the loss of Nur77 by siRNA interference resulted in augmentation of adhesion. Interestingly, Ang1 was able to dampen VEGF-induced monocyte adhesion to HUVEC monolayers. I conclude that Nur77 plays an important role in providing a negative feedback mechanism designed to attenuate VEGF-induced pro-inflammatory responses through selective inhibition of NFκB activation. Furthermore, Nur77, in part, may be vital to the Ang-1 anti-inflammatory response. / Les facteurs de croissance endothélials vasculaires (VEGF) et l'angiopoïétine 1 (Ang-1) sont de régulateurs essentiels de l'angiogénèse. En outre, tous les deux ont été découverts pour leur participation dans le processus d'inflammation: VEGF comme pro-infammatoire et Ang-1 comme médiateur anti-inflammatoire. Nur77 est un membre de la famille des récepteurs orphelins (NR4A) qui comprend Nurr1 and Nor1 et jouent un rôle dans la régulation de l'inflammation vasculaire; toutefois cela n'est pas encore totalement compris. Le but de cette étude était d'évaluer si l'expression de Nur77 dans les cellules endothéliales (ECs) sert de mécanisme de rétroaction négatif conçu pour inhiber l'induction de NFκB en réduisant l'expression de la E-selectin et de VCAM1 induite par VEGF, ainsi que l'adhésion des leucocytes aux ECs, et pour agir en médiateur de la suppression de l'activation des ECs induite par le traitement avec Ang-1. Le traitement des cellules endothéliales humaines de la veine ombilicale (HUVECs) soit avec VEGF ou Ang-1 induit de façon significative et transitoire l'expression de Nur77 et augmente la Phosphorylation de HDAC7 PKD dépendante et la mobilisation du noyau vers le cytosol. Les HUVECs transduits avec les adénovirus exprimant HDAC7 muté ou un dominant négatif PKD1 inhibent VEGF, mais pas l'expression de Nur77 induit par Ang-1. L'inhibition de la PI3K et de ERK1/2 aboutit à la suppression de l'expression de Nur77 induit par Ang-1 alors que l'inhibition de JNK résulte de façon significative en une plus grande induction de Nur77 par Ang-1. L'essai d'activité de liaison de NFκB ainsi que celui du gel de retardation révèlent que Nur77 inhibe l'activité de NFκB induit par VEGF. La surexpression de Nur77 a montré une sur-régulation dépendante de la titration de l'ARNm et de l'expression protéique de IκBα, pas évidente avec les HUVECs transduites avec les virus exprimant la forme dominante négative de Nur77 (Ad-dnNur77). J'ai trouvé que Nur77 réprimait l'ARNm et l'expression protéique de E-selectin and VCAM1 induit par VEGF. De façon importante, le rôle de Nur77 dans l'adhésion des leucocytes aux ECs induits par les cytokines a été examiné. L'adhérence des cellules U937 aux HUVECs activées par VEGF était réprimée par la surexpression de Nur77 alors que la perte de Nur77 par l'ARNsi d'interférence résulte dans une augmentation de l'adhésion. De manière intéressante, Ang-1 était capable d'amortir l'adhésion aux monocouches de HUVECs induite par VEGF. Je conclus que Nur77 joue un rôle important en fournissant un mécanisme de rétroaction négatif conçu pour atténuer la réponse pro-infammatoire induite par VEGF à travers l'inhibition sélective de l'activation de NFκB. Par ailleurs Nur77 en partie, peut être vital pour les réponses anti-inflammatoires d'Ang-1.