The autophosphorylating protein kinase CheA plays a central role in the chemotaxis signal transduction system of Escherichia coli. CheA receives information regarding the chemical composition of the extracellular milieu from transmembrane chemoreceptor proteins and conveys this information to CheY, a cytoplasmic protein that directly influences the swimming behaviour of the cell. The research presented in this thesis focused on understanding the interaction of CheA with ATP and ADP; it led to our development of a minimal kinetic model describing CheA autophosphorylation and dephosphorylation and enabled determination of kinetic constants describing CheA-nucleotide interactions and phospho-transfer. This information was utilized to study the nature of two activating mutations generated in CheA; isolation and characterization of these mutants are described. Our results support the notion that modulation in CheA's autokinase activity may arise from conformational shifts in the protein that result in enhancements in CheA's affinity and intrinsic reactivity with ATP. Further studies were performed to examine the contribution of each CheA protomer to the mechanism of autophosphorylation that involves CheA dimers. Our results indicated that trans-phosphorylation between CheA protomers may involve catalytic residues that act both in cis and in trans to the autophosphorylation site and that the two protomers of a dimer make non-equivalent contributions to the ATP binding site. The effect of pH on CheA's kinase activity was also examined. The presence of two distinct proton dissociation events that affect CheA's activity in the absence of chemoreceptors is discussed in the context of the pH-taxis response of E.coli.

The adenoviral Early Region 4 open reading frame 4 (E4orf4) protein has been shown to induce p53-independent apoptosis in transformed human cell lines. In rodent cells, E4orf4 has been shown to mediate apoptosis in the presence of a caspase inhibitor. These early results suggested that E4orf4 triggers a novel, non-classical form of apoptosis that may be independent of the core death machinery. A series of experiments were performed to analyze the activation of apoptotic machinery in response to the expression of E4orf4 in human cell lines. The analysis of E4orf4-induced cell death focused on a detailed examination of molecular mechanisms involved in the induction and execution of classical apoptosis. The results showed that E4orf4 induces moderate levels of cell killing of human cancer cells and causes some externalization of phosphatidylserine. However, E4orf4-mediated cell death is not associated with the activation of caspases or with the release of cytochrome c from mitochondria. Furthermore, poly(ADP-ribosyl) polymerase (PARP) is not proteolytically processed, mitochondrial membranes are not depolarized, and reactive oxygen species (ROS) are not generated. Thus, E4orf4 seems to induce an aberrant type of apoptosis characterized by no apparent activation of the classic molecular apoptotic machinery.

The products of Hox genes are homeodomain-containing transcriptional regulators that function during development to specify positional identity along embryonic axes. Differences in the ability of HOX proteins to regulate the transcription of target genes are critical for patterning. The ability of the Hoxd4 gene product to autoregulate expression, which is dependent on TAAT-containing sites in the Hoxd4 promoter, is specific in at HOXA1 fails to recognize these sites. By chimaeric analysis, this specificity was shown to be due to sequence differences in the N-terminal arm. Substitution of the lysine and arginine residues found at positions two and three in HOXD4 into the HOXA1 homeodomain conferred strong DNA binding. Identity at these two positions varies between HOX subfamilies with distinct functions, suggesting that these differences relevant for HOX specificity in vivo. These results are also consistent with the hypothesis that monomeric DNA binding is not sufficient to confer functional specificity. For example, we were unable to detect a high affinity recognition sequence for HOXA1, despite conservation in HOXA1 and its paralogs of numerous residues which contribute to DNA binding in other homeoproteins. We determined that a predicted HOX cofactor, PBX, greatly increased the DNA binding activity of numerous HOX proteins, including HOXA1, to the consensus site TGATTGAT. For both HOXD4 and HOXA1, interaction with PBX is dependent on the pentapeptide, a conserved region N-terminal to the homeodomain. Analysis of HOX/PBX specificity revealed that preferences for the sixth position in consensus site vary depending on the HOX protein used. This position is predicted contacted by the N-terminal arm of the HOX protein via the minor groove. We showed that a conserved arginine (Arg5) in the HOX N-terminal arm contributes to DNA binding in both monomeric and heterodimeric complexes. However, the identity of positions two and three, which distinguish the binding of HO

<p>Spermatogenesis is the process by which diploid stem cells differentiate into haploid male gametes, spermatozoa. As haploid cells differentiate into spermatozoa, they undergo profound changes in morphology and physiology, including total reorganization of chromatin in the nucleus which results in the inability to synthesize new mRNAs about one week before the differentiation of sperm is complete. Consequently, many mRNAs, such as the protamine 1 (Prm1) mRNA and sperm mitochondria-associated cysteine rich-protein (Smcp) mRNA, are transcribed in early haploid spermatogenic cells and stored as translationally inactive messenger ribonucleoprotein particles (free-mRNPs) for several days to a week before the mRNA is translated to make protein in late haploid spermatogenic cells. The initial translational repression is critical for normal sperm development, since premature activation of translation leads to deformed spermatozoa and male subfertility or infertility. The mechanisms that regulate mRNA translation in haploid spermatogenic cells are poorly understood. My research explores the mechanisms of translational regulation of Prm1 and Smcp mRNAs. The goal of my research is to identify factors and elements that repress the translation of Prm1 and Smcp mRNAs in round spermatids and activate their translation in late spermatids. Prm1 and Smcp mRNA are the only two mRNAs extensively studied through mutations in transgenic mice. Mutation in transgenic mice is the best method of identifying cis-elements in spermatogenic cells. Previous studies of mutations in transgenic mice have identified cis-elements which are necessary to repress the Prm1 mRNA and Smcp mRNAs in transgenic mice. Using UV-crosslinking RNA binding assays, RNA affinity chromatography and mass spectrometry sequencing, my research demonstrates that Y-box protein 2 (YBX2) binds both elements suggesting that YBX2 is an important mRNA specific translational repressor. UV-crosslinking assays also reveal that YBX2 is less specific in its binding specificity than was previously known, implying that YBX2 represses many mRNAs. My research also demonstrates that proper repression of the Smcp mRNA in early haploid cells requires interactions between multiple elements in the 5'UTR and the 3'UTR.

With an increasing incidence over the past decades, breast cancer is the most common cancer in women worldwide. However, improved therapies allowed for a decrease in mortality. One breast cancer subtype called triple-negative lacks three different molecular markers has no effective treatments. The Transforming Growth Factor β (TGFβ) superfamily of growth factors comprises a large set of pluripotent cytokines involved in numerous biological processes and is of critical importance in cancer where it can play a dual role. Indeed, in normal cells and in early stage cancers TGFβ retains its ability to maintain tissue homeostasis and acts therefor as a tumor suppressor. After further mutations affect TGFβ signaling, some of the responses are lost and TGFβ favors progression to metastasis. As explained in the introductory chapter of this present work, numerous approaches have been attempted to block TGFβ signaling. However the different methods have failed as they led to non-negligible side effects. A novel class of small non-coding RNAs called microRNA and its deregulation in cancer cells, led to hope for a new "miRNA correction therapy". Early works indicated that in vivo modulation of miRNA levels altered cellular behavior. This thesis focuses on elucidating the role of TGFβ-regulated miRNA in breast cancer progression. This work illustrates the use of 2'O-methyl-modified oligonucleotides to modulate miRNA in order to interfere with downstream TGFβ deleterious effects. Metastatic breast cancers typically are not suitable for surgery and moderate responsive to chemotherapy treatments. Metastatic triple-negative breast cancers are not treatable and have a high mortality rates. In the second and third chapter of this work, using a triple-negative breast cancer model in which TGFβ induced miR-181 activity, I showed that inhibiting this downstream miRNA decreased TGFβ-mediated pro-metastatic effects in vitro as measured by both cell migration and invasion without altering the beneficial tumor suppressive effects of TGFβ. In another triple-negative breast cancer model in, which TGFβ inhibited miR-30 activity, I showed that overexpression of miR-30 activity interfered with TGFβ. MicroRNA correction therapy can be a promising new therapeutic strategy to treat a currently untreatable disease. In the fourth chapter of this work, a broader screen revealed that a large subset of targetable miRNA was regulated by TGFβ in triple-negative breast cancer cells. Since TGFβ mediates breast cancer progression, exogenic 2'O-methyl-modified RNA can interfere with TGFβ signaling suggesting new therapeutic insights. This work is intended to show the potential of miRNA-based technologies to modulate cell behavior. In the last decade, cancer cells have been shown to be highly dependent on oncogenes, I believe to oncomiRs such as miR-181 as well. Synthetic miRNA will perhaps be generated to target selected oncogenic pathways. Such crucial master regulators of the transcriptome may be major actors in the next generations of cancer therapies. / Le cancer du sein, le cancer féminin le plus répandu au monde, dont l'incidence augmente au cours des dernières décennies a eu une baisse de mortalitégrace aux nouvelles thérapies. Le sous-type de cancer du sein, répondant différemment aux traitements. Le sous-type triple-négatif, du à l'absence de trois marqueurs moléculaires, de dispose actuellement d'aucun traitement efficace. Le "transforming growth factor β" (TGFβ) est impliquée dans de nombreux processus biologiques allant du dévelopement embryonnaire à la croissance, la différentiation, à l'homéostasie et a un rôle majeur dans le cancer où il joue un rôle double. Dans les cellules normales et dans les cancers de stade précoce, le TGFβ conserve son aptitude à maintenir l'homéostasie et agit ainsi tel un suppresseur de tumeur. Suite à d'autres mutations, certaines de ses réponses biologiques sont perdues et le TGFβ favorise alors la progression tumorale et les métastases. La cytokine TGFβ joue alors un rôle majeur puisqu'elle promeut la progression tumorale vers les stades métastatiques.Le chapitre d'introduction explique les diverses approches tentées pour bloquer la voie de signalisation du TGFβ. Toutes ont échoué suite aux effets secondaires non négligeables. Après la découverte des microARN, et leur dérégulation dans le cancer, l'espoir d'une nouvelle thérapie à base de microARN est née. Des études initiales ont revelé in vivo que la modification de leurs taux d'expression modifiait le comportement cellulaire. Ce travail de doctorat a pour but d'élucider le rôle des microARN régulés par le TGFβ.Ce travail illustre l'utilisation d'oligonucléotides modifiés afin d'interférer avec les effets délétères du TGFβ. Les cancers du sein métastatiques sont souvent inopérables et peu répondants aux traitements systémiques. Les cancers métastatiques triple-négatifs entrainent une forte mortalité. Dans les deuxième et troisième chapitres de ce mémoire, j'ai demontré que l'inhibition du miR-181 et la surexpression du miR-30, à l'aide d'oligonucléotides synthétiques, diminuaient les effets du TGFβ in vitro. Ces résultats indiquent que la thérapie à base de microARN est une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse pour les sous-types actuellement intraitables. Une étude plus vaste révele qu'une grande proportion des miARN est regulée par le TGFβ. Ces miARN sont potentiellement des cibles d'intérêt thérapeutique comme le suggère les résultats préliminaires détaillés dans le quatrième chapitre de ce travail. J'ai testé l'effet du TGFβ sur le microRNome, identifié une cinquantaine de miARN régulés par la cytokine et ai commencé à les caractériser fonctionnellement. Ce travail servira de base pour de nombreux projets à venir sur la voie de signalisation du TGFβ.Cette recherche doctoratale démontre que le TGFβ est moteur de la progression tumorale du cancer du sein et que l'utilisastion d'ARN exogènes peut ralentir la progression cancéreuse. J'ai montré à deux reprises que le fait de cibler les miARN interférait avec la signalisation du TGFβ. Cette étude contribute au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Au cours de la derniere décennie, il a été montré que les cellules cancéreuses étaient souvent dépendantes d'oncogènes. Je pense qu'elles le sont également d'oncomiARN tels le miR-181. Lorsque notre compréhension des relations entre miARN et leurs messagers cibles s'affinera, il sera possible de créer des miARN synthétiques capables de cibler les voies oncogéniques particulières. De tels régulateurs majeurs du transcriptome vont être des acteurs clefs des nouvelles générations de thérapies du cancer.

Tumour formation is characterized by a series of well-defined events that occur in virtually all human cancers, including the ability of cells to attain immortalization, sustain proliferation and evade apoptosis. These cell growth and cytostatic processes are normally regulated by various growth factors that act in concert to maintain proper cellular homeostasis. As a result, deregulation of these growth factor signalling pathways leads to uncontrolled cell growth and tumour formation. In particular, transforming growth factor-β (TGFβ) exerts a central role in preventing tumour formation in virtually all cell types and tissues. TGFβ tumour suppressive effects are mainly illustrated by its ability to inhibit cell growth, induce cell death and prevent cell immortalization. TGFβ-mediated prevention of cell immortalization relies on inhibition of telomerase activity. While expression of hTERT, the protein component of telomerase, is increased in most cancer cells, studies from our laboratory revealed that TGFβ efficiently represses hTERT gene expression in both normal and cancer cells through multiple signalling pathways. We further found that the inhibition of hTERT by TGFβ requires the synthesis of an intermediate molecule that we identified as the transcription factor E2F1, and showed that interfering with E2F1 activity impedes the TGFβ inhibitory effect on telomerase activity. The E2F family of transcription factors plays a central role in regulating cell-cycle progression. Deregulation of these factors is a common event in most human cancers. Interestingly, E2F1 has been shown to have the ability to induce both cell cycle progression and apoptosis, though the mechanisms of E2F-mediated apoptosis have not been fully elucidated. TGFβ itself is a potent pro-apoptotic factor, as it modulates the expression of multiple apoptotic genes in various tissues. However, a common and central signalling pathway, acting downstream of TGFβ and leading to cell death, had yet to be uncovered. Interestingly, recent work from our laboratory highlighted E2F1 as a central factor downstream of TGFβ-induced apoptosis in cancer cells. Using the E2F1 knockout mouse model, we found E2F1 to be required for TGFβ-mediated apoptosis in normal cells as well. We further investigated the molecular mechanisms by which E2F1 contributes to TGFβ-mediated apoptosis and found that TGFβ treatment led to the formation of a transcriptionally active E2F1–pRb–P/CAF complex on multiple pro-apoptotic target gene promoters, thereby activating their transcription. These findings define a novel process of gene activation by the TGFβ-E2F1 signalling axis, and uncover the pRb/E2F1 pathway as a wide-ranging and critical mediator of the TGFβ apoptotic programme in multiple target tissues. We further determined that TGFβ induces pRb/E2F1-dependent transcriptional activation of several autophagy-related genes, potentially leading to autophagic cell death. Together, our studies support a role for the pRb/E2F pathway as a potent co-transducer of TGFβ signalling and highlight the pivotal role for pRb/E2F in mediating TGFβ tumour-suppressive effects. / La formation de tumeurs est caractérisée par une série d'évènements bien définis qui sont communs à tous les cancers, notamment l'habileté des cellules à atteindre l'immortalisation, maintenir la prolifération, et éviter l'apoptose. Ces procédés cytostatiques et de croissance cellulaire sont normalement régulés par divers facteurs de croissance qui agissent de concert pour maintenir l'homéostasie cellulaire. De ce fait, un dérèglement dans la signalisation de ces facteurs mène à une croissance incontrôlée et à la formation de tumeurs. Plus particulièrement, le facteur de croissance β (TGFβ) exerce un rôle central en agissant comme suppresseur de tumeurs dans quasiment tous les types cellulaires et tissus. Les effets en tant que suppresseur de tumeurs du TGFβ sont illustrés par son habileté à inhiber la croissance cellulaire, induire la mort cellulaire, et prévenir l'immortalisation cellulaire. La capacité du TGFβ à prévenir l'immortalisation cellulaire s'appuie sur le fait qu'il inhibe l'activité de la télomérase. Bien que l'expression de hTERT, la protéine faisant partie du complexe de la télomérase, soit accrue dans la plupart des cellules cancéreuses, des études de notre laboratoire ont révélé que le TGFβ peut réprimer l'expression du gène codant pour hTERT dans les cellules autant normales que cancéreuses à travers des voies de signalisation multiples. Nous avons de plus trouvé que l'inhibition de hTERT par le TGFβ requiert la synthèse d'une molécule intermédiaire que nous avons identifié comme étant le facteur de transcription E2F1, et avons démontré que d'interférer avec l'activité du E2F1 empêche les effets inhibiteurs du TGFβ sur l'activité de la télomérase. La famille des facteurs de transcription E2F joue un rôle central dans la régulation de la progression du cycle cellulaire. La dérégulation de ces facteurs est un évènement commun dans la plupart des cancers. Il a été démontré que le E2F1 possède l'habileté d'induire autant la progression du cycle cellulaire que l'apoptose, cependant, le mécanisme par lequel le E2F1 induit l'apoptose n'est pas complètement élucidé. Le TGFβ est lui-même un facteur pro-apoptotique puissant, car il module l'expression de plusieurs gènes apoptotiques dans une variété de tissus. Cependant, une voie de signalisation commune et centrale, agissant en amont du TGFβ et amenant à la mort cellulaire, reste toujours à démontrer. Des travaux récents de notre laboratoire soulignent le E2F1 comme étant un facteur central en amont de l'apoptose médiée par le TGFβ dans les cellules cancéreuses. En utilisant un modèle de souris où le E2F1 a été inhibé, nous avons pu déterminer que le E2F1 est requis pour l'apoptose médiée par le TGFβ également dans les cellules normales. Nous avons investigué plus en profondeur les mécanismes moléculaires par lesquels le E2F1 contribue à l'apoptose médiée par le TGFβ et avons trouvé qu'un traitement par le TGFβ mène à la formation du complexe transcriptionellement actif E2F1-pRb-P/CAF sur le promoteur de plusieurs gènes pro-apoptotiques pour activer leur transcription. Ces découvertes définissent un nouveau procédé d'activation des gènes par l'axe de signalisation TGFβ-E2F1, et a permis d'élucider la voie pRb/E2F1 comme un médiateur critique et à grande portée du programme apoptotique du TGFβ et ce, dans plusieurs tissus cibles. Nous avons de plus déterminé que le TGFβ induit l'activation de la transcription de gènes autophagiques par le complexe pRb/E2F1. Collectivement, nos études supportent un rôle pour le complexe pRb/E2F1 dans la voie de signalisation du TGFβ et dans ses effets en tant que suppresseur de tumeurs.

In the human body as in all mammals, iron is an essential trace element. Despite its required presence for many biological functions, it is also toxic because of its labile oxidation states and ability to catalyze reactions. For this reason, tight control must be exerted to maintain iron in a bioavailable yet redox inert state. Also since mammals possess no regulated iron excretion mechanism, the dietary uptake of the metal must be tightly controlled as well. This ensures that there is enough iron for the body's needs yet not too much as to result in iron overload and the complications which arise from it.On a systemic level, mechanisms have evolved to safely move iron throughout the body, between cells that utilize, recycle, and store it. At the forefront of this process is hepcidin, a peptide hormone orchestrating the body's systemic iron homeostasis. Hepcidin is in turn controlled via iron, such that a balance is achieved between utilization and storage of the metal. Despite the number of safeguards that have evolved to maintain homeostasis, complications can arise, which allow researchers to ask questions and find answers.It was investigated in Chapter 2 how a serine protease inhibitor, SERPIN B3, is affected by iron in vitro. A causative link was determined in vivo in a mouse model between iron overload and hepatic SERPIN B3 expression. However, in vitro, the results could not be recapitulated at the level of transcription, despite looking at both primary and secondary effects of iron. Furthermore, it was not possible to prove or disprove that SERPIN B3 plays a role in hepcidin expression.In Chapter 3, the investigation of the role of two proteins which are well established in the hepcidin regulatory pathways was conducted. A novel knockout mouse was generated combining deletions in both the hereditary hemochromatosis (HFE) and hemojuvelin (HJV) proteins and iron accumulation and hepcidin expression in this double knockout (DKO) were investigated. It was shown that the DKO mice are phenotypically like HJV single knockout mice and that there is crosstalk between the two iron sensing pathways. / Comme chez tous les mammifères, le fer est un élément essentiel au corps humain. Malgré sa présence nécessaire à de nombreuses fonctions biologiques, il est également potentiellement toxique à cause de ses états d'oxydation labiles et de sa capacité à catalyser des réactions. Pour cette raison un contrôle sévère doit être exercé pour maintenir le fer dans un état redox inerte tout en étant disponible biologiquement. Les mammifères ne possédant pas de mécanisme régulé d'excrétion du fer, l'apport alimentaire de ce métal doit également être étroitement contrôlé. Cela permet de combler adéquatement les besoins du corps en fer tout en évitant la surcharge en fer et les complications qui en résultent.Au niveau systémique, des mécanismes ont évolué pour déplacer le fer correctement partout dans le corps entre des cellules qui utilisent, recyclent ou stockent cet élément. En première ligne de ce processus se trouve l'hepcidine, un peptide hormone, orchestrant l'homéostasie du fer au niveau systémique. L'hepcidine est à son tour régulée par l'intermédiaire du fer, de manière telle que la balance est atteinte entre l'utilisation et le stockage de ce métal. Malgré la présence de nombreux systèmes de contrôle responsables de la maintenance de l'homéostasie, des complications peuvent apparaître qui permettent aux chercheurs de poser des questions et de trouver des réponses.Dans le chapitre 2, il a été étudié comment la SERPINE B3, un inhibiteur de protéase à serine, est affectée in vitro par le fer. Un lien de cause à effet avait été déterminé entre la surcharge en fer et l'expression hépatique de la SERPINE B3 in vivo dans un modèle murin. Cependant, les résultats au niveau de la transcription n'ont pas pu être récapitulés in vitro, malgré la recherche d'effets primaires et secondaires du fer. De plus, il n'a pas été possible de prouver ou d'invalider que la SERPINE B3 joue un rôle dans l'expression de l'hepcidine.Dans le chapitre 3, l'investigation du rôle de deux protéines qui sont bien établies dans les voies de régulation de l'hepcidine a été conduite. Un nouveau modèle de souris knock-out a été généré combinant les délétions de HFE (héréditaire hemochromatose protein) et de l'hémojuveline (HJV). L'accumulation du fer et l'expression de l'hepcidine ont été étudiées dans ce double knock-out (DKO). Il a été montré que les souris DKO sont phénotypiquement similaires aux souris knockout HJV et qu'il existe un lien entre les deux systèmes de détection du fer.

Preterm birth is one of the most important causes of neonatal mortality and morbidity. Recent evidence suggests that proinflammatory cytokines play a role in a variety of reproductive processes including preterm birth as well as normal parturition. Using immortalized human myometrial cells, we showed that interleukin-1 beta (IL-1 beta) rapidly induces avian muscoloaponeurotic fibrosarcoma homologue F (MAFF) transcription factor expression in a concentration and time dependent manner. We performed MAFF siRNA mediated knockdown using RNA interference in the presence and absence of IL-1 beta. Using RNA sequencing (RNAseq) analysis, we identified a series of genes, whose expression is controlled by the MAFF transcription factor and/or IL-1 beta. Inhibition of MAFF expression in the presence/absence ofIL-1 beta resulted in a series of expression changes in groups of genes involved in activation of several pathways as well as modulation of genes linked to parturition. We found that prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), a key regulator of labor and parturition, was upregulated in the absence of MAFF, suggesting negative control of the expression of this enzyme by MAFF. Using a luciferase reporter under the control of the PTGS2 promoter, we showed that this regulation is, at least in part, mediated at the transcriptional level. Moreover, other genes that have been associated with normal birth, thrombospondin-1 (THBS1) and tissue metallopeptidase inhibitor 3 (TIMP3), are also modulated by MAFF. Our studies providevaluable insights into the MAFF dependent transcriptional network governing myometrial cell function in the presence and absence of proinflammatory stimuli. / La prématurité est une des causes les plus importantes de mortalité et de morbidité néonatale. Des données récentes suggèrent que les cytokines pro-inflammatoires jouent un rôle dans divers processus de reproduction, y compris dans l'accouchement prématuré ainsi que dans l'accouchement normal. En utilisant des cellules humaines immortalisées du myomètre, nous avons montré que l'IL-1 beta induit rapidement l'expression du facteur de transcription aviaire musculo-aponeurotic fibrosarcome homologue F (MAFF) d'une manière dépendante de la concentration et du temps. Nous avons utilisé des petits ARN interférents (siRNA) afin de diminuer l'expression de MAFF en présence et en absence d'IL- 1 beta. Grâce à une analyse de séquençage de l'ARN, nous avons identifié une série de gènes dont l'expression est contrôlée par le facteur de transcription MAFF et/ou l'IL- 1 beta. L'inhibition de l'expression de MAFF en présence/absence d'IL- 1 beta a conduit à une série de changements d'expression de gènes impliqués dans l'activation de plusieurs voies de signalisation ainsi que dans la modulation de gènes liés à la parturition. Nous avons constaté que l'expression de la prostaglandine endoperoxyde synthase 2 (PTGS2), un régulateur clé de la parturition et de l'accouchement, a été augmentée en l'absence de MAFF, suggérant que MAFF exerce un contrôle négatif sur l'expression de cet enzyme. A l'aide d'un gène rapporteur de la luciférase sous le contrôle du promoteur PTGS2, nous avons montré que la modulation est, au moins en partie, médiée au niveau transcriptionnel. De plus, d'autres gènes qui ont été associés à un accouchement normal comme la thrombospondine-1 (THBS1) et l'inhibiteur des métallopeptidases 3 (TIMP3) sont aussi modulés par MAFF. Nos études fournissent ainsi des informations précieuses sur le réseau transcriptionnel de MAFF, régissant la fonction des cellules du myomètre en présence et en absence de stimuli pro-inflammatoires.

Vitamin B12, or cobalamin, is a water soluble vitamin required as cofactor for two mammalian enzymatic processes: homocysteine remethylation to methionine in the cytoplasm using methionine synthase (MS), and fatty acid/amino acid metabolism in the mitochondrion using methylmalonyl-CoA mutase (MCM). Whereas the molecular nature of intracellular cobalamin metabolism in mammals remains poorly understood, the proteins MMACHC, MMADHC, LMBD1 and ABCD4 are implicated in its early uptake and processing. Due to the inherent challenges associated with the cellular utilization of cobalamin, we propose that these proteins mediate its early intracellular channeling; the objective of this thesis was to characterize the protein-protein interactions that coordinate this process.To gain insight into the function of MMADHC, recombinant isoforms were purified and low-resolution structural features were determined. MMADHC is monomeric and, in solution, adopts an extended conformation, with regions of disorder identified at the N-terminal domain. Panning combinatorial phage libraries against recombinant MMADHC allowed the mapping of putative sites of interaction on MMACHC. Kinetic analyses using surface plasmon resonance (SPR) confirmed a sub-micromolar affinity for the MMACHC–MMADHC interaction. Based on these studies, we propose that the function of MMADHC is exerted through its structured C-terminal domain via interactions with MMACHC in the cytoplasm.Clinical phenotypes and subcellular location of MS and MCM dictate that MMACHC functions in the cytoplasm while MMADHC functions at a branch point in the pathway in both the cytoplasm and the mitochondrion. To demonstrate that the MMACHC–MMADHC interaction is physiologically plausible, we used immunofluorescence and subcellular fractionation to confirm that MMACHC is cytoplasmic while MMADHC is dual-localized to the cytoplasm and mitochondria. Protein interaction analyses were extended by describing the recombinant production of the lysosomal membrane proteins LMBD1 and ABCD4. Detergent-solubilized LMBD1 and ABCD4 each formed homodimers in solution. SPR provided direct in vitro binding data for an LMBD1–ABCD4 interaction with low nanomolar affinity. Consistent with our phage display predictions, MMACHC interacted with LMBD1 and ABCD4 with high affinity.Our results support a model whereby membrane-bound LMBD1 and ABCD4 regulate the vectorial delivery of lysosomal cobalamin to cytoplasmic MMACHC, preventing cofactor dilution to the cytoplasmic milieu and protecting against inactivating side reactions. Subsequent formation of a cytoplasmic MMACHC–MMADHC complex then processes and partitions this cofactor to the downstream enzymes MCM and MS. These studies identify and characterize multiprotein complexes, advancing our basic understanding of early intracellular cobalamin metabolism. / La vitamine B12, ou bien la cobalamine, est une vitamine soluble requise pour deux processus enzymatiques distincts chez les mammifères; la production de l'acide aminée méthionine par la méthionine synthase (MS), et le métabolisme d'acides gras et d'acides aminées par la méthylmalonyl-CoA mutase (MCM). Malgré le fait que les procédées métaboliques intracellulaires de la cobalamine restes peu bien caractérisés, les protéines dont MMACHC, MMADHC, LMBD1, et ABCD4 jouent un rôle dans l'acquisition et le traitement de ce cofacteur. Vu les difficultés intrinsèques de l'utilisation cellulaire de la cobalamine, nous proposons que ces protéines assurent l'efficacité de son canalisation. Cette thèse avait pour objectif de caractériser les interactions protéine-protéine impliquées dans ce processus.Pour pouvoir caractériser la fonction de MMADHC, des isoformes protéiques ont été purifiées et leurs traits structurales ont étés déterminés à basse résolution. MMADHC se trouve à être monomérique et adopte une conformation étendue en solution, avec des régions non structurées dans la terminaison aminée de la protéine. Ensuite, des librairies combinatoires de phages ont été utilisées comme substrats pour tracer des sites d'interactions potentiels avec MMADHC. Les analyses kinésiques des interactions MMACHC–MMADHC ont été faites à l'aide de la résonance plasmonique de surface (SPR) et ont confirmées une intéraction d'affinité sub-micromolaire. Avec ces résultats, nous proposons que la fonction de MMADHC se fasse par sa terminaison acidique en interagissant avec MMACHC dans le cytoplasme.Les phénotypes cliniques et la localisation subcellulaire de MS et de MCM envisagent que MMACHC joue un rôle dans le cytoplasme et que MMADHC se trouve à être impliquée dans le processus au niveau de la mitochondrie et du milieu cytoplasmique. Pour démontrer que l'interaction MMACHC–MMADHC est physiologique, nous avons utilisé l'immunofluorescence et la fractionnement subcellulaire pour confirmer que MMACHC est cytoplasmique et que MMADHC se retrouvent au cytoplasme et au mitochondrie.Des analyses protéiques ont également engendré LMBD1 et ABCD4. Solubilisés à l'aide de détergent, ces deux protéines prennent la conformation d'homodimères en solution. Une interaction d'affinité nanomolaire entre LMBD1 et ABCD4 a été confirmée en SPR. En lien avec nos analyses de phages, MMACHC interagit avec haute affinité avec LMBD1 et ABCD4.Nos résultats supportent un modèle dans lequel LMBD1 et ABCD4, tous deux liés dans la membrane, régularisent l'octroi de la cobalamine lysosomale à MMACHC en prévenant la dilution de ce cofacteur dans le milieu cytoplasmique et en protégeant contre des réactions inactivant. La dissociation et le recrutement de la MMADHC cytoplasmique à MMACHC facilitent le transfert de la cobalamine vers les réactions enzymatiques catalysées par MCM et MS. L'identification et la caractérisation de ces complexes multiprotéiques font en sorte d'avancer nos connaissances générales sur le métabolisme de la cobalamine.

Higher plants are hierarchical structures with several integrated levels of organization. Column-like stems support beam-like petioles, both of which often display high twist-to-bend ratios (EI/GJ). This anisotropy allows the structure to support its leaves against gravity while twisting to avoid wind. Rheum rhabarbarum (rhubarb) was selected as a practical model species for macroscale petiole mechanics. Torsion and bending tests were developed for the rhubarb petiole, as were tension and compression tests for its constituent bark and core tissues, respectively. Petioles displayed a mean EI/GJ of 3.83, approaching the 4.03 ratio predicted by a macroscale beam model. This moderate ratio may result from the combination of a D-shaped cross-section with a hydrostatic behaviour; these tend, respectively, to increase and decrease EI/GJ. The core was found to be a hydrostatic tissue composed mainly of large, thin-walled parenchyma cells. The bark was found to be a thin, stiff layer of epidermal and collenchyma cells that contains the core under pressure, rigidifying the petiole. Further dissecting its anatomy, as well as testing its response to turgor change, can shed more light on the mechanics of the rhubarb petiole. Similar mechanical techniques were also developed for the stem and hypocotyl of Arabidopsis thaliana, a genetic model species useful for probing plant micromechanics. Additionally, the Philodendron melinonii petiole was identified as a structure of unique interest. Its peculiar cross-section and porous core make this petiole a possible template for a lightweight and anisotropic biomimetic beam. / Les plantes vasculaires sont des structures hiérarchiques avec plusieurs niveaux d'organisation intégrés. Les tiges sont comme des colonnes qui soutiennent les pétioles, qui sont comme des poutres. Les deux organes présentent souvent des ratios élevés de torsion à flexion (EI/GJ), qui leur permettent de soutenir les feuilles contre la gravité tout en tordant pour éviter le vent. Rheum rhabarbarum (rhubarbe) a été choisi comme une espèce modèle pratique pour la mécanique macroscopique des pétioles. Des techniques de torsion et de flexion ont été développés pour le pétiole, de même que des techniques de tension et de compression pour ses tissus d'écorce et de noyau, respectivement. Les pétioles ont exposé une moyenne EI/GJ de 3,83, proche du ratio de 4,03 prédit par un modèle de poutre macroscopique. Ce ratio modéré peut être causée par la géométrie en forme de D du pétiole, ce qui augmente normalement le EI/GJ, lorsque sa nature hydrostatique le diminue normalement. Le noyau est un tissu hydrostatique composée principalement de grandes cellules du parenchyme à parois minces. L'écorce est une couche mince et rigide des cellules épidermiques et collenchyme qui contient le noyau sous pression, rigidifiant le pétiole. En disséquant plus son anatomie, ainsi qu'en développant les essais pour éclaircir sa réponse aux changements de turgescence, on pourrait mieux comprendre la mécanique du pétiole de rhubarbe. Des techniques mécaniques équivalentes ont été simultanément mis au point pour les tiges d'Arabidopsis thaliana, une espèce modèle utile pour élucider la micromécanique des plantes. De plus, le pétiole de Philodendron melinonii a été identifié comme une structure intéressant. Sa section transversale particulière et son noyau poreuse font de ce pétiole un modèle possible pour un poutre biomimétique léger et anisotrope.