Muscle wasting is a common complication of aging and a number of chronic and degenerative diseases. Previous work has demonstrated that the deubiquitinating enzyme (DUB) USP19 is induced at the mRNA level in atrophying rat skeletal muscle under various conditions of catabolism [1]. To further explore USP19's role in muscle, loss of function approaches were employed. siRNA-mediated silencing of USP19 in L6 muscle cells enhanced the expression of a panel of major myofibrillar proteins and the myogenic regulatory factor myogenin that regulates muscle differentiation [2]. The enhanced expression of MHC and tropomyosin upon USP19 depletion was found to be dependent on USP19's regulation of myogenin. The effects observed upon USP19 depletion may be due to an effect on muscle cell differentiation. USP19 is expressed as two major isoforms, one with and the other without a C-terminal transmembrane domain (TMD) that confers ER localization. Therefore, I characterized the mechanism by which USP19 modulates muscle cell differentiation and examined the structure-function relationship of USP19 in regulation of this process. The negative role of USP19 in muscle cell differentiation was confirmed as adenovirus-mediated overexpression of wild type USP19 in C2C12 muscle cells suppressed the protein levels of MHC, tropomyosin, and myogenin at the molecular level and inhibited myotube fusion morphologically. These effects are dependent on USP19's DUB catalytic activity and localization to the ER as overexpression of a catalytically inactive mutant or the non-ER localized USP19 isoform abolished these molecular and morphological effects. USP19 N-terminal domains appear to be important for suppression of myotube fusion, as overexpression of USP19 mutants lacking various N-terminal regions weakened the fusion defect observed in wild type USP19 expressing cells, but did not affect myogenin expression. The inhibition of myoblast fusion upon overexpression of wild type USP19 coincided with a decrease in the induction of ER stress required for myogenesis as assessed by the number of CHOP positive cells and ER stress treatment of wild type USP19 expressing cells recovered the fusion defect, suggesting a differentiation-dependent role for USP19 at the ER. The regulation of USP19 was investigated to observe if USP19 isoforms are uniquely regulated during myogenesis. Total USP19 protein expression in C2C12 cells increased ~ 1.6 fold over six days of differentiation, while the mRNA levels of the USP19ΔTMD and USP19TMD isoforms increased ~ 2.5 fold and ~ 1.4 fold, respectively. USP19 was also demonstrated to interact with USP9X and suppress IGF1/PI3K/mTOR/Akt growth signaling. Collectively, these results implicate USP19 as a negative regulator of muscle cell differentiation dependent on its DUB catalytic activity and ER localization. Dysregulated or suppressed myogenesis contributes to muscle atrophy as well as a delayed recovery following injury, identifying USP19 inhibition as a novel therapeutic intervention for the treatment of muscle atrophy. / La perte musculaire est une complication fréquente du vieillissement et d'un grand nombre de maladies chroniques et dégénératives. Des travaux antérieurs ont démontré que l'enzyme de déubiquitination (DUB) USP19 est induite au niveau de l'ARNm durant l'atrophie du muscle squelettique de rat dans diverses conditions cataboliques [1]. Pour explorer davantage le rôle de USP19 dans les muscles, des approches de perte de fonction ont été employées. En utilisant le silençage génique médié par des siRNA contre USP19 dans des cellules musculaires L6, une augmentation de l'expression de plusieurs protéines myofibrillaires ainsi que de la myogénine, un facteur de régulation de la différenciation musculaire, a été observée [2]. L'expression accrue de la MHC et de la tropomyosine suite à l'inhibition de USP19 s'est révélée être dépendante de la régulation de la myogénine par USP19. Les effets observés suite a l'appauvrissement de USP19 pourrait être dû à un effet sur la différenciation des cellules musculaires. USP19 est exprimée sous forme de deux isoformes majeures, l'une avec et l'autre sans domaine transmembranaire C-terminal (TMD) qui confère la localization dans le réticulum endoplasmique (ER). Par conséquent, j'ai caractérisé le mécanisme par lequel USP19 module la différenciation des cellules musculaires et examiné la relation structure-fonction de USP19 dans la régulation de ce processus. Le rôle négatif de USP19 dans la différenciation des cellules musculaires a été confirmé par la surexpression de USP19 de type WT en utilisant des adénovirus dans les cellules musculaires C2C12. La surexpression de USP19 a provoqué la suppression des niveaux de protéines de la MHC, de la tropomyosine et de la myogénine et inhibé morphologiquement la fusion des myotubes. Ces effets dépendent de l'activité catalytique et de la localisation de USP19 dans le ER puisque la surexpression d'un mutant catalytiquement inactif ou d'un isoforme non-ER localisé aboli ces effets moléculaires et morphologiques. Les domaines N-terminaux de USP19 semblent aussi être importants pour la suppression de la fusion des myotubes, étant donné que la surexpression de mutants USP19 dépourvus de diverses régions N-terminales atténue l'effet de la fusion cellulaire observée dans les cellules exprimant le USP19 de type WT, mais n'a pas d'incidence sur l'expression de la myogénine. L'inhibition de la fusion des myoblastes exprimant le USP19 de type WT coïncide avec une diminution de l'induction du stress relié au réticulum endoplasmique démontré par le nombre de cellules positives pour CHOP qui est nécessaire à la myogenèse. Le traitement de cellules exprimant USP19 de type WT avec un inducteur du stress relié au ER récupère le défaut de fusion, ce qui suggère un rôle pour USP19 dans la differentiation cellulaire relié au stress du ER. La régulation de USP19 a été étudiée pour observer si les isoformes USP19 sont modulés uniquement pendant la myogenèse. L'expression protéique globale de USP19 dans des cellules C2C12 est augmentée ~1,6 fois sur six jours de différenciation, tandis que les taux d'ARNm de ΔTMD et TMD sont augmentés ~2,5 et ~1,4 fois, respectivement. Il a été également démontré que USP19 peut interagir avec USP9X et peut supprimer la voie de signalisation de la croissance IGF1/PI3K/mTOR/Akt. Collectivement, ces résultats impliquent USP19 comme un régulateur négatif de la différenciation cellulaire du muscle, dépendant de son activité catalytique et de sa localisation dans le ER. Une myogénèse mal régulée ou supprimée contribue à l'atrophie musculaire ainsi qu'à une convalescence prolongée suite à une blessure, identifiant ainsi l'inhibition de USP19 comme une intervention thérapeutique potentielle pour le traitement de l'atrophie musculaire.

Although eIF4E plays an important role in the development and progression of cancer, the mechanism through which it acts has not been directly characterised. In order to aid in the progression of this knowledge, an in vivo eIF4E-mRNA immunoprecipitation assay was developed and validated in NIH 3T3 cells. This assay demonstrates its ability to specifically pull down capped mRNAs bound to ectopically expressed 3X-FLAG tagged eIF4E. Mutations in eIF4E that affected cap binding and/or interaction with eIF4G or 4E-BP were also evaluated for their RNA binding potential. Elution of mRNAs from eIF4E with m7GTP competition was not observed following cell lysis, indicating that post-lysis association did not affect the immunoprecipitated mRNA pool. Our assay was able to document small molecule inhibition of eIF4E activity in cells ex vivo. The assay demonstrated a significant, reproducible decrease in mRNA binding following treatment with mTOR kinase inhibitor PP242, and will be useful in the evaluation of the eIF4E-interactome as well as assessing small molecule inhibitors of eIF4E-cap interaction. / Bien que le facteur de traduction eIF4E joue un rôle important dans le développement et la progression des cellules cancéreuses, le mécanisme avec lequel il y participe reste encore très méconnu. Afin d'aider à élucider ce rôle, nous avons développé une méthode d'immunoprécipitation vérifiant l'interaction entre eIF4E et les ARNm in vivo à partir de cellules NIH 3T3. Cette méthode permet l'isolement spécifique des ARNm qui sont liés à la protéine eIF4E exprimée de manière ectopique et qui contient une séquence 3X-FLAG. Le mutant eIF4E-W56A, qui empêche la liaison de la protéine au cap, le mutant G139D, qui bloque son interaction à eIF4G ou 4E-BP, ainsi qu'un double mutant ont été utilisés afin de valider la méthode. Notre méthode à permis de démontrer que l'ajout de composés bloquant l'interaction entre eIF4E et les ARNm induit une perte significative d'ARNm recouvré suite à la purification. Par contre, nous n'avons pas observé de pertes d'ARNm lorsque nous avons ajouté le compétiteur de la liaison au cap, le m7GTP, suite à la lyse cellulaire, indiquant que l'interaction potentielle entre eIF4E et les ARNm qui pourrait avoir lieu suite à la lyse est négligeable. De plus, nous avons démontré en utilisant notre méthode qu'une diminution reproductible dans la liaison d'eIF4E aux ARNm est détectée en utilisant l'inhibiteur de la kinase mTOR PP242. Cet inhibiteur, ainsi que les composés qui bloquent l'interaction entre eIF4E et les ARNm seront maintenant utilisés afin d'évaluer la totalité de l'interactome entre eIF4E et les ARNm cellulaires.

Manipulating the DNA repair mechanisms involved in the repair of Topoisomerase-I (Top I) mediated DNA damage may enhance the therapeutic benefits of Top I poisons. Poly-ADP ribose polymerase (PARP) inhibitors can increase the cytotoxicity of several anticancer agents by inhibiting various DNA repair pathways including homologous recombinational repair (HRR)(1). However, inhibition of PARP may result in compensatory activation of the ATR pathway partially limiting the sensitization of chemotherapeutic agents seen with PARP inhibitors. Recently, a specific ATR inhibitor, VE-821 has demonstrated excellent sensitization to various chemotherapeutic agents with preferential antitumor activity in tumor cells as compared to normal cells(2).Colon cancer cell lines: HCT116, Lovo (p53 wild type) and HT29 (p53 mutated) were treated with SN38 (the active metabolite of irinotecan, a topoisomerase I inhibitor), the PARP inhibitor (ABT-888) and/or the ATR inhibitor (VE821) at different concentrations. The SRB cytotoxicity assay was used to determine the IC50 of each drug separately and in combination. DNA damage caused by these agents was quantified by phosphorylated-H2AX. Cell cycle alterations and protein levels (western analysis) were determined after drug treatment. / Manipuler les mécanismes de réparation de l'ADN impliquées dans la réparation de dommage de l'ADN médiatisé de la topoisomérase-1 (Top I) peut renforcer les bienfaits thérapeutiques des poisons Top I. Les inhibiteurs de polymérase poly-ADP ribose (PARP) peuvent augmenter la cytotoxicité de plusieurs agents anticancéreux en inhibant différentes voies de réparation de l'ADN comprenant la réparation par recombinaison homologue (HRR)(1). Cependant, l'inhibition de la PARP peut entraîner une activation compensatoire de la voie ATR, limitant partiellement la sensibilisation des agents chimiothérapiques observés avec les inhibiteurs de PARP. Récemment, un inhibiteur de l'ATR spécifique, VE-821 a démontré une excellente sensibilisation à divers agents chimiothérapiques avec une activité antitumorale préférentielle dans les cellules tumorales par rapport aux cellules normales (2).Lignes cellulaires du cancer du côlon : HCT 116, Lovo (type sauvage de p53) et HT29 (p53 muté) ont été traités avec SN38, l'inhibiteur de la PARP (ABT-888) et/ou l'inhibiteur de l'ATR (VE821) à différentes concentrations. Le dosage de cytotoxicité SRB a été utilisé pour déterminer IC50 de chaque médicament séparément ou en combinaison. Les dommages DNA causés par ces agents ont été quantifiés par phosphorylée-H2AX. Les altérations du cycle cellulaire et des protéines (analyse de l'ouest) ont été déterminées après un traitement médicamenteux.

In response to the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, granulosa cells of ovulating follicles undergo luteinization resulting in the formation of the corpus luteum (CL). During this process granulosa cells acquire the steroidogenic ability to synthesize progesterone, which is an energetically demanding process. Indeed, LH is known to increase glucose uptake in the luteinized rat ovary, but the mechanisms have not been explored. Glucose uptake by cells is mediated by a family of facilitative glucose transporter (GLUT) proteins. These proteins facilitate the bi-directional passive transport of glucose. Of the 14 GLUTs, isoforms 1-4 are the best characterized. Glucose transporter isoforms have been identified in ovarian cells, but there remains controversy and uncertainty as to which isoforms are expressed in granulosa cells. The developmental profiles of GLUTs throughout the follicular and luteal phases, along with their transcriptional regulation have not been explored in granulosa cells. This research aimed to identify GLUT isoforms found in granulosa cells at specific stages of ovarian development using the mouse model. Preliminary experiments showed that the glucose transporter 1 isoform displayed an interesting profile and consequently this isoform is the focus of this study.Immature female mice were superstimulated using the exogenous hormones equine chorionic gonadotropin (eCG) and human CG (hCG), which promote follicular development and ovulation, respectively. Granulosa cells were collected by follicular puncture at specific time-points during superovulation. The mRNA profiles for the 4 Glut isoforms was carried out using quantitative PCR (qPCR). Following the identification of Glut1 in granulosa cells, the Fluorescent glucose cell-based uptake kit (Cayman Chemicals) was used to determine the glucose uptake of granulosa cells in primary culture. Pharmacological inhibition of the MAPK and mTOR pathways was carried out to identify the signaling cascade involved in Glut1 expression. Comparative bioinformatic analysis was used to determine transcriptional regulation of the mouse Glut1 promoter region, followed by chromatin immunoprecipitation (ChIP) to validate the in silico results. This study confirms the LH-stimulated glucose uptake, shows for the first time in granulosa cells that Glut1 is potentially responsible for increased glucose uptake after the LH surge and outlines the signaling pathways involved in Glut1 expression and transcription. / En réponse à l'augmentation pré-ovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH) , les cellules de la granulosa des follicules ovulatoires subissent la lutéinisation et forment le corps jaune (CL). Au cours de ce processus, les cellules de la granulosa acquièrent la capacité de synthétiser le progestérone, un processus qui nécessite beaucoup d'énergie. En effet, la LH est connu pour sont effet stimulant sur l'absorption du glucose dans l'ovaire lutéinisé chez le rat, mais les mécanismes n'ont pas été explorés. L'absorption du glucose par les cellules est médiée par une famille de transporteurs de glucose (GLUT) qui permettent le transport passif de glucose. Les isoformes Glut 1-4 sont les mieux caractérisées. Les isoformes de Gluts ont été identifiées dans les cellules ovariennes, mais il n'est pas clair quelles isoformes sont exprimées dans les cellules de la granulosa. Les profils d'expression des isoformes Gluts au cours du développement folliculaire et lutéale, aussi bien que leur régulation transcriptionnelle, n'ont pas été explorés dans les cellules de la granulosa. La présente recherche vise à identifier les isoformes des Gluts trouvées dans les cellules de la granulosa à des étapes spécifiques de la dynamique de l'ovaire chez la souris. L'eCG et l' hCG qui favorisent le développement folliculaire et l'ovulation, respectivement, ont été administrées à des souris femelle immatures. L'abondance de l'ARNm des quatre isoformes Glut dans des cellules de la granulosa ont été recueillies aux points de contrôle spécifiques au cours du cycle oestral. Suite à l'identification de Glut1 dans les cellules de la granulosa, le kit Fluorescent glucose cell-based uptake kit (Cayman Chemicals) a été utilisé pour déterminer l'absorption du glucose par les cellules de la granulosa en culture primaire.L'inhibition pharmacologique de MAPK et mTOR a été effectuée afin d'identifier la cascade de signalisation impliquée dans l'expression de Glut1. L'analyse bioinformatique a été utilisée pour déterminer la régulation transcriptionnelle du promoteur de Glut1 de la souris, suivie par l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour valider ces résultats in silico. Cette étude confirme que l'absorption de glucose est en effet stimulée par la LH, montre pour la première fois dans les cellules de la granulosa que Glut1 est potentiellement responsable de l'augmentation de l'absorption du glucose après le pic de LH et décrit les voies de signalisation impliquées dans l'expression et la transcription de Glut1.

Asthma is one of the most common chronic diseases that are considered as an important cause of morbidity and mortality worldwide. The morbidity of asthma stems from several factors, including but not limited to, the structural changes that occur in the lung of asthmatics known as airway remodeling. Thickening of airway smooth muscle (ASM) mass area is a fundamental feature of airway remodelling in asthma, which has been long discovered. Although airway smooth muscle cells (ASMCs) have been and still are extensively investigated for their major role in the increase in ASM mass, the reason behind this increase and the mechanisms mediating it are yet to be elucidated. In recent years, the functions of ASMCs as a source of inflammatory mediators and their migration ability have become a prominent subject in the investigation of asthma. Believing that ASMCs are a key effector in the pathogenesis of airway remodeling, we aimed to examine the inflammatory mediators derived from ASMCs, after IL-17 stimulation, and the extent of their influence on ASMC migration. Indeed, we found that IL-17/ASMC-derived mediators enhance ASMC migration through production of growth-related oncogene chemokines (GROs; GRO-α, GRO-β and GRO-γ). In addition, we investigated the regulatory mechanisms, the receptors responsible and the signaling pathways activated during ASMC migration induced by GRO-α, GRO-β and GRO-γ. We reported that GRO-γ requires two receptors, CXCR1 and CXCR2, and two signaling pathways, p38 and ERK 1/2 MAPK, to induce ASMC migration. We also demonstrated that GRO-α acts as a negative regulator of ASMC migration, alone or in combination with GRO-β and/or GRO-γ, via the decoy receptor; Duffy antigen receptor for chemokines (DARC). Interestingly, we found that the presence of DARC leads GRO-α to inhibit ASMC migration through preferential activation of ERK 1/2 MAPK pathway and dampening the activation of p38 MAPK pathway, whereas its absence leads GRO-α to enhance ASMC migration through binding to CXCR2 and activation of p38 MAPK pathway.Collectively, our results demonstrate that the interaction between IL-17 cytokines and ASMCs is capable of enhancing ASMC migration in an autocrine fashion through GRO production and suggest that GROs may play a role in the pathogenesis of airway remodeling in asthma. / L'asthme, une des maladies chroniques les plus communes, est considéré comme une importante cause de morbidité et de mortalité dans le monde. La morbidité de l'asthme découle de plusieurs facteurs, incluant des changements structurels qui se produisent dans les poumons des asthmatiques connu sous le nom de remodelage bronchique. Découverte il y a longtemps, l'épaississement de la masse de muscle lisse (ASM) dans les voies aériennes est une caractéristique fondamentale du remodelage des voies aériennes dans l'asthme. Bien que les cellules musculaires lisses des voies respiratoires (ASMCs) ont été et sont encore largement étudiées pour leur rôle majeur dans l'augmentation de la masse musculaire lisse, la raison et les mécanismes médiateurs de cette augmentation restent à élucider. Au cours des dernières années, l'étude des ASMCs en tant que source de médiateurs inflammatoires ainsi que leur capacité de migration a pris une place importante dans l'investigation du remodelage bronchique dans l'asthme. Croyant que les ASMCs sont des acteurs clés du remodelage bronchique, nous avons examiné les médiateurs inflammatoires produits par les ASMCs après une stimulation par IL-17 ainsi que l'influence de ces médiateurs sur la migration des ASMCs. Nous avons démontré que les médiateurs sécrétés par ASMCs sont des Growth-related Oncogènes chimiokines (GROs : GRO-α, GRO-β et GRO-γ) qui promeuvent la migration des ASMCs. Nous avons également décrit les mécanismes de régulation de la migration des ASMCs par GRO-α, GRO-β et GRO-γ, les récepteurs chargés de transmettre l'effet ainsi que les voies de signalisation activées. Nous avons montré que pour inciter la migration des ASMCs, GRO-γ nécessite la présence de deux récepteurs CXCR1 et CXCR2, et deux voies de signalisation, p38 et ERK 1/2 MAPK. Aussi, nous avons mis en évidence que GRO-α agit comme un régulateur négatif de la migration des ASMCs, seul ou en combinaison avec GRO-β et/ou GRO-γ. Cet effet inhibiteur de GRO-α est arbitré par un récepteur atypique, DARC (Duffy Antigen Receptor of Chimiokines) via l'activation spécifique de la voie de signalisation de ERK 1/2 MAPK alors que la voie de p38 MAPK est inhibée. De plus, nous avons aussi constaté qu'en l'absence du récepteur DARC, GRO-α récupère sa capacité de liaison à CXCR2 et augmente la migration des ASMCs via l'activation de la voie de p38 MAPK.Par conséquent, nos résultats montrent que l'interaction entre les interleukines-17 et les ASMCs est capable d'induire la migration des ASMCs par un mécanisme de régulation autocrine impliquant les sécrétions de GROs. Nos résultats suggèrent également que les GROs pourraient jouer un rôle important dans la pathogenèse du remodelage bronchique dans l'asthme.

The combined actions of various inorganic phosphate ion (Pi) regulators in bone, intestine and kidney are crucial for overall Pi homeostasis. Regulation of Pi levels is mediated by the activity of various sodium-phosphate (Na-Pi) co-transporters. Among the three families of Na-Pi co-transporters, Type-III transporters (PiT1 and PiT2) are ubiquitously expressed, but these are the sole functional Pi-transporters in osteoblasts, thus implicating them in the regulation of bone mineralization where very high Pi levels are required for apatitic (calcium-phosphate) mineral deposition in the extracellular matrix. While examined in bone, very little is known about the role of PiT co-transporters in cartilage. In the present study, we hypothesized that PiT1 in particular plays an important role in chondrocyte biology and in cartilage extracellular matrix mineralization. PiT1 co-transporters were identified in chondrocytes of developing mouse cartilage and in ATDC5 chondrogenic cells in culture. PiT1 was the major Na-Pi transporter expressed by differentiating ATDC5 cells. Treatment of the cultures with phosphonoformic acid (FoscarnetTM) ‒ an inhibitor of phosphate transporters ‒ resulted in a dose-dependent decrease in mineralization. Foscarnet-mediated impairment of Pi-transport in differentiated ATDC5 cell cultures was confirmed by a marked down-regulation of osteopontin (Spp1), whose expression is an indicator of intracellular Pi levels. Since PiT1 is the predominant Pi transporter expressed in ATDC5 cells, these data suggest that Foscarnet prevents extracellular matrix mineralization by inhibiting intracellular Pi transport via PiT1. These results were confirmed using shRNA-mediated specific knockdown of PiT1 in ATDC5 cells, resulting in significantly reduced mineral deposition and cell proliferation, thus demonstrating a critical role for PiT1 in chondrocyte biology and cartilage mineralization. / Les actions combinées de divers ions de phosphate inorganique (Pi) au sein d'organismes de régulation dans les os, les intestins et les reins sont cruciales pour l'homéostase globale Pi. La régulation de niveaux Pi est équilibrée par l'activité de divers co-transporteurs de phosphates de sodium (Na+Pi). Parmi les trois familles de co- transporteurs Na+Pi, les transporteurs de type III (PiT1 et PiT2) sont exprimés de manière ubiquitaire, mais ceux-ci sont les seuls transporteurs Pi fonctionnels dans les ostéoblastes, ce qui les implique dans la régulation de la minéralisation osseuse où de très hauts niveaux de Pi sont nécessaires pour le dépôt apatitique (phosphate de calcium) de minéraux dans la matrice extracellulaire . Bien qu'il ait été examiné au niveau des os, on sait très peu sur le rôle de co- PiT transporteurs au niveau du cartilage. Dans la présente étude , nous avons supposé que PiT1 en particulier jouerait un rôle important dans la biologie des chondrocytes et dans la minéralisation du cartilage de la matrice extracellulaire. Les co-transporteurs PiT1 ont été identifiés dans les chondrocytes du cartilage en développement de la souris et en cellules chondrogéniques ATDC5 dans la culture. PiT1 était le principal transporteur Na+Pi exprimé par la différenciation des cellules ATDC5. Le traitement des cultures avec de l'acide phosphonoformique (FoscarnetTM) -un inhibiteur des transporteurs de phosphate - traduit par une diminution de la minéralisation, selon la dose . L'obstruction du transport de Pi dans des cultures de cellules différenciées ATDC5 par médiation Foscarnet a été confirmée par une régulation à la baisse de l'ostéopontine (Spp 1) considérable, dont l'expression est un indicateur de niveaux Pi intracellulaires. Etant donné que le transporteur de Pi prédominant est le PiT1 exprimé dans les cellules ATDC5, ces données suggèrent que le Foscarnet empêcherait la minéralisation extracellulaire de la matrice, en inhibant le transport intracellulaire de Pi par l'intermédiaire du PiT1. Ces résultats ont été confirmés en utilisant un renversement du PiT1 spécifique à la médiation shRNA dans les cellules ATDC5, ce qui entraîne le dépôt de minéraux sensiblement réduit et la prolifération des cellules, démontrant ainsi le rôle critique du PiT1 en biologie des chondrocytes et la minéralisation du cartilage .

Solute carrier family 11 member 1 protein (SLC11A1), also known as natural resistance-associated macrophage protein 1 (NRAMP1), plays an important role in the host immune defense and inflammatory response. It is a highly conserved transmembrane protein which transports divalent metal cations in a proton-dependent manner. It regulates iron homeostasis in macrophages and exerts pleiotropic effects on macrophage activation. In mice, natural resistance or susceptibility to a range of intracellular pathogens is controlled by the Slc11a1 gene. In human, genetic polymorphisms of the SLC11A1 gene have been shown to be associated with a susceptibility to a variety of infectious and autoimmune diseases. The expression of the SLC11A1 gene is strictly regulated during myeloid differentiation. The human promyelocytic leukemia cell lines such as HL-60 and U937 cells are useful models to study the regulation of SLC11A1 gene expression during experimentally induced granulocytic, monocytic, or macrophage-like differentiation. Herein, we demonstrated that during the PMA-induced differentiation of HL-60 cells and human monocytes toward macrophages, β-actin translocates from the cytoplasm to the nucleus where it is associated with RNA polymerase II and binds to the promoter of the SLC11A1 gene. β-actin knockdown inhibits the SLC11A1 promoter-driven transcription, and neutralization of nuclear actin by in vivo microinjection of antibodies against β-actin into nuclei significantly blocks the expression of SLC11A1 mRNA. Further studies revealed that an AP-1-like element present in the proximal region of the SLC11A1 gene promoter is essential for PMA-induced transcriptional activation of this gene. β-actin, as a subunit of the SWI/SNF complex, and another subunit BRG1 are associated with the transcription factor ATF-3 and are recruited to the AP-1 like element in an ATF-3-dependant manner . ATF-3 cooperates with BRG1 and β-actin to activate the SLC11A1 promoter. Furthermore, a proximal (GT/AC)n repeat (t(gt)5ac(gt)5ac(gt)9g) region adjacent to the AP-1-like element is converted into a Z-DNA structure in response to PMA treatment, and BRG1 is involved in this process. Our results suggest that recruitment of the SWI/SNF complex initiates Z-DNA formation and subsequently helps to transactivate the SLC11A1 gene. Previous studies have shown that SLC11A1 is extensively glycosylated and phosphorylated, and is localized at the membrane of late endosomes/lysosomes in macrophages. The present study revealed that SLC11A1 is tyrosine-phosphorylated during the differentiation of U937 cells into macrophages induced by PMA. Using the kinase inhibitor PP2 and RNA interference experiments, we demonstrated that Src family kinases including c-Src are required for the tyrosine phosphorylation of SLC11A1 protein. In vitro phosphorylation assays showed that SLC11A1 is a direct substrate for active c-Src kinase. Furthermore, tyrosine 15 is identified as the tyrosine phosphorylation site by Src family kinases and phosphorylation of tyrosine 15 modulates SLC11A1-mediated nitric oxide production. We also showed that the Src family kinases including c-Src are also involved in lysosomal targeting of SLC11A1. These results suggest an important role of Src family kinases in subcellular localization and function of SLC11A1 in macrophages. Overall, our studies contributed important information on the regulation of expression of SLC11A1 in macrophages and its role in regulation of macrophage functions. / La protéine « Solute carrier family 11 member 1 » (SLC11A1), aussi connue sous le nom « natural resistance associated macrophage protein 1 » (NRAMP1), jour un rôle important dans la défense immunitaire et réponse inflammatoire de l'hôte. C'est une protéine transmembranaire hautement conservée qui transporte des cations divalents métalliques d'une manière dépendent des protons. Elle régularise l'homéostasie du fer dans les macrophages et a des effets pléiotropiques sur l'activation de ces cellules. Chez les souris, le gène Slc11a1 contrôle la resistance naturelle ou la susceptibilité aux pathogènes intracellulaires. Chez les humains, les polymorphismes génétiques de SLC11A1 sont associés à une susceptibilité à une variété de maladies infectieuses ou auto-immunitaires. L'expression du gène SLC11A1 est strictement régularisée pendant la différenciation myéloïde. Les lignées cellulaires humaines dérivées de la leucémie aiguë promyélocytaire, telles que la HL-60 et l'U937, sont des modèles utiles pour étudier le contrôle de l'expression du gène SLC11A1 pendant la différenciation de type granulocytaire, monocytaire ou de macrophage induite expérimentalement. Ici, nous avons démontré que durant la différenciation induite par PMA des cellules HL-60 et des monocytes humains aux macrophages, β-actine passe du cytoplasme au noyau où il s'associe avec l'ARN polymérase II et se fixe sure le promoteur du gène SLC11A1. Le « knock-down » de la β-actine inhibe la transcription menée par le promoteur de gène SLC11A1. Dans le noyau, l'expression de l'ARN de SLC11A1 est bloqué significativement en neutralisant l'actine par la microinjection in vivo des anticorps contre β-actine. Autres études ont démontré qu'un élément « semblable à AP-1 » est présent dans la région proximale du promoteur de SLC11A1 et celui-ci est essentiel pour l'activation transcriptionnelle de ce gène induite par PMA. β-actine, étant une sous-unité du complexe SWI/SNF, et la sous-unité BRG1 sont associés avec le facteur de transcription ATF-3. Ensemble, elles sont recrutées à l'élément semblable à AP-1 en une manière qui dépendante sur ATF-3. ATF-3 coopère avec BRG1 et β-actine pour activer le promoteur de SLC11A1. De plus, la région du répète proximale (GT/AC)n [t(gt)5ac(gt)5ac(gt)9g] adjacent au élément semblable à AP-1 est convertit en une structure de Z-ADN en réponse au traitement de PMA, un processus dans lequel BRG1 est impliqué. Nos résultats suggèrent que le recrutement du complexe SWI/SNF amorce la formation de Z-ADN et aide à transactiver le gène SLC11A1. Des études précédentes ont démontrés que SLC11A1 est extensivement glycosylée et phosphorylée, et que cette protéine se trouve chez les macrophages dans les membranes des endosomes tardifs ou des lysosomes. L'étude présentée ici a révélé que SLC11A1 est phosphorylée sur les tyrosines pendant la différenciation des cellules U937 aux macrophages par PMA. En utilisant l'inhibiteur de kinase PP2 et des essais d'interférence d'ARN, nous avons démontré que les kinases de la famille Src, incluant c-Src, sont requises pour la phosphorylation de tyrosine de la protéine SLC11A1. Les essais in vitro de phosphorylation ont montré que SCL11A1 est un substrat direct pour la kinase active c-Src. De plus, la tyrosine 15 a été identifiée comme étant le site de phosphorylation de kinases de la famille Src. La phosphorylation de tyrosine 15 fait moduler la production de l'oxyde nitrique de laquelle SLC11A1 fait parti. Nous avons aussi montré que les kinases de la famille Src ont un rôle important dans la localisation subcellulaire et dans le fonctionnement de SLC11A1 dans les macrophages. Globalement, nos études ont contribué d'information importante sur la régularisation de l'expression de SCL11A1 dans les macrophages et son rôle dans le fonctionnement des macrophages.

Upon encountering harsh environmental conditions, Caenorhabditis elegans larvae are able to alter their developmental program and enter the dauer diapause, an alternative developmental stage that enables larvae to endure long periods of stress. During this arrested state, the germ line stem cells, which normally divide during reproductive development, halt their proliferation and are consequently rendered quiescent. Previous work has implicated a role for PAR-4/LKB1 in germ line stem cell quiescence. Inactivating mutations in par-4 result in aberrant germ line stem cell proliferation during the dauer diapause, suggesting that PAR-4 is required for germ cell cycle arrest. LKB1 is a tumor suppressor protein kinase that is implicated in the rare, autosomal dominant disease Peutz-Jeghers syndrome (PJS). In order to better understand its function in tumorigenesis, we characterized its role in regulating cellular quiescence in developmentally arrested larvae using a genome-wide, RNA interference-based screen to identify suppressors of PAR-4-dependent germ line hyperplasia. We identified 50 genes whose loss-of-function was found to rescue the germ line hyperplasia observed in par-4 dauer larvae, suggesting that their expression is misregulated in the absence of PAR-4/LKB1. In addition, we demonstrated the importance of PAR-4-dependent germ line arrest by characterizing the post-dauer, reproductive capacity of par-4 mutants, which was significantly reduced. Future endeavors include the characterization of key candidates—many of which impinge on the cytoskeleton and the extracellular matrix—as well as the post-dauer germ line defects observed in par-4 animals. / Lors de conditions environnementales hostiles, la larve Caenorhabditis elegans est capable d'altérer son programme de développement. Elle entre en phase dauer diapause, un stade alternative de développement qui permet d'endurer des longues périodes de stress. Durant ce stade, les cellules souches germinales, qui normalement se divisent durant leur développement reproductif, arrêtent leur prolifération et deviennent quiescentes. Plusieurs études ont impliqués PAR-4/LKB1 comme acteur dans l'arrêt du cycle des cellules germinales. Lorsqu'on inactive par-4 à l'aide d'une mutation, les cellules souches germinales prolifèrent de façon anormales lors de la dauer diapause, ce qui suggère que PAR-4 est nécessaire pour l'arrêt du cycle des cellules germinales. LKB1 est une protéine kinase impliqué dans le syndrome Peutz-Jeghers (PJS). Pour comprendre la fonction de LKB1 dans la tumorogenèse, nous avons caractériser son rôle dans la régulation de la quiescence cellulaire des larves en arrêt développemental, utilisant un crible ARNi global, afin d'identifier les suppresseurs de l'hyperplasie germinale induite par PAR-4. Nous avons identifiés 50 gènes dont la perte de fonction était capable de empêcher l'hyperplasie observée chez les larves dauer par-4, suggérant que leur expression est dérégulé en l'absence de PAR-4/LKB1. De plus nous avons démontré l'importance de PAR-4 dans l'arrêt du cycle des cellules germinales en caractérisant la capacité reproductive nettement diminuée des larves mutantes en post dauer. Dans le future, nous recommandons que des recherches supplémentaires caractérisent les gènes clés qui ont le potentiel de empêcher l'hyperplasie observée chez les larves dauer par-4.

Vesicular stomatitis virus (VSV) replication and oncolytic potential is reversibly stimulated in combination with epigenetic modulators such as the histone deacetylase inhibitor (HDI) Vorinostat (SAHA). Based on this reversible effect of Vorinostat on viral oncolysis, we reasoned that critical host genes involved in oncolysis may be reversibly regulated in prostate cancer PC3 cells following removal of Vorinostat. A transcriptome analysis in PC3 cells identified a subset of NF- κB target genes that were reversibly regulated by Vorinostat and involved in regulation of inflammatory and stress-responses. Consistent with the induction of NF- κB target genes, Vorinostat-mediated enhancement of VSV oncolysis correlated with hyper-acetylation of the NF- κB transcription factor subunit RELA/p65; furthermore, VSV replication and cell killing were suppressed when NF- κB signaling was inhibited using pharmacological or genetic approaches. Additional bioinformatics analysis revealed that stimulation of NF- κB signaling also resulted in the increased expression of several autophagy-related genes. Inhibition of autophagy by 3-methyladenine led to an increase in expression of IFNβ-stimulated genes, and both 3-methyladenine treatment and genetic ablation of autophagy led to a decrease in VSV replication and oncolysis. Together, these data demonstrate that Vorinostat stimulates NF- κB activity in a reversible manner via modulation of RelA/p65 signaling, leading to induction of autophagy and enhancement of VSV replication and oncolysis. These studies thus positively correlate NF- κB signaling and autophagy with VSV replication and oncolysis. / La réplication et l'activité oncolytique du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sont stimulées d'une manière réversible lorsque le VSV est combiné avec des modulateurs épigénétiques tels que le vorinostat (SAHA), un inhibiteur de l'histone déacétylase (IDH). En se basant sur cette observation, nous avons émis l'hypothèse que les gènes importants de l'hôte impliqués dans l'oncolyse peuvent-être eux aussi réversiblement régules dans les cellules du cancer de la prostate PC3 après le retrait du vorinostat. En effet, une analyse du transcriptome des cellules PC3 a identifié un set de gènes impliqués dans la voie NF-κB, plus précisément dans la réponse inflammatoire et aux réponses au stress, qui est régulé par le vorinostat. Conformément à l'induction des gènes cibles de la voie NF-κB, l'amélioration de l'effet oncolytique du VSV par le vorinostat corrèle avec une hyper-acétylation du NF-κB RELA/p65; En outre, la réplication du VSV et la mort des cellules ont été supprimées lorsque la voie signalétique NF-κB a été inhibée par des approches pharmacologiques et géniques. Nous avons également observé que l'expression de plusieurs gènes impliqués dans l'autophagie a été augmentée par la stimulation de la voie NF-κB. De plus, une analyse supplémentaire bioinformatique a révélé que l'expression de plusieurs gènes impliqués dans l'autophagie était également augmentée par la stimulation de NF-κB. En addition, l'inhibition de l'autophagie par le 3-méthyladénine a entrainé une amplification de l'expression des gènes stimulés par l'IFN-β. En outre, le traitement avec le 3-méthyladénine et l'inhibition génique de l'autophagie a résulté en une diminution de la réplication du VSV et de l'oncolyse. Ensemble, ces résultats démontrent que le vorinostat stimule l'activité du NF-κB de manière réversible via la modulation de RelA/p65, conduisant à l'induction de l'autophagie et à l'amélioration de la réplication du VSV et l'oncolyse. Ainsi, cette étude met en évidence le lien entre l'activation de l'axe NF-kB- autophagie et la réplication du VSV et son effet oncolytique.

Many genetic aberrations contribute to the aggressive phenotype of Glioblastoma Multiforme (GBM), a heterogenous tumor which consists of four major subtypes with distinct molecular characteristics. The differential activity of oncogenic and tumor suppressive networks between these subtypes makes targeted therapy difficult as not all subtypes will be affected to the same degree. As well, the genetic complexity of GBM allows for compensatory signaling to sustain malignancy and resist apoptosis. During the last decade evidence has accumulated about the importance of mRNA translation initiation in tumorigenesis. Over 10 translation initiation factors are implicated in oncogenesis, acting as either proto-oncogenes or tumor suppressors, the most well described being the eIF4F initiation complex, consisting of eIF4E, eIF4G and eIF4A. Increased complex formation results in mRNA discrimination, leading to an increased translation of a subset of "weak" oncogenic mRNAs with highly structured 5'UTRs. Thus, inhibition of translation initiation can simultaneously target many oncogenic pathways. However it is unclear what role translation initiation plays in GBM biology, and whether its inhibition may have anti-neoplastic properties. In this study, we used 4EGI-1 and silvestrol, small-molecule inhibitors of eIF4E and eIF4A respectively, to target translation initiation in three GBM cell lines U87, U251N and the more aggressive U87ΔEGFR. Here, we show in U87 cells that 4EGI-1 blocks the eIF4E/eIF4G interaction which is necessary for eIF4F complex formation. This coincides with a reduction in cell proliferation and survival, in a dose and time-dependent manner, with <1% of U87 and U251N cells and 17.5% of U87∆EGFR cells remaining after a 96 hour treatment with 80µM 4EGI-1. There is marked induction of apoptosis at 48 hours, with increased annexin V+/7AAD- staining and Capsase-9/PARP cleavage, accompanied by a decrease in the protein expression of several oncogenes, with highly structured 5'UTRs, involved in proliferation and survival such as c-Myc, Cyclin D-1, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 and Survivin. Additionally 4EGI-1 inhibited the migration of U87 and U87∆EGFR cells in response to chemotactic stimuli, as well as anchorage –independent growth of all three cell lines. Silvestrol showed similar effects as 4EGI-1 in inhibiting cell proliferation, survival, oncogenic protein expression and inducing apoptosis, although at nanomolar concentrations and at earlier time points, indicating superior pharmacokinetics.Our results demonstrate the sensitivity of GBM towards inhibition of translation initiation and its ability to induce a robust apoptotic response. This further highlights translation regulation control as a strong force in cancer therapy, particularly in GBM where therapeutic options are limited. / Un grand nombre d'aberrations génétiques contribuent au phénotype virulent du glioblastome multiforme (GBM), un cancer hétérogène en quatre sous-types principaux qui présentant des caractéristiques moléculaires distinctes. L'activité différentielle des réseaux suppressifs oncogènes et tumoraux complique le traitement ciblé puisque il n'aura pas la même effet sur chacun des sous-types. De même, la complexité génétique du GBM permet une signalisation compensatrice favorisant l'entretien de la tumeur et une résistance à l'apoptose.Au cours de la dernière décennie, plusieurs données probantes ont été recueillies portant sur l'importance de l'initiation de la traduction des ARNm dans la tumorigenèse. Plus de 10 facteurs d'initiation de la traduction, agissant comme proto-oncogènes ou suppresseurs de tumeur, interviennent dans l'oncogenèse. De ces facteurs, le complexe d'initiation eIF4F, qui est composé de l'eIF4E, de l'eIF4G et de l'eIF4A est le mieux décrit. La formation accrue de complexes entraîne une discrimination de l'ARNm, ce qui augmente la traduction d'un sous-groupe d'ARNm oncogènes « faibles » dotés de séquences 5' non traduites (5'UTR) très structurées. Par conséquent, l'inhibition de l'initiation de la traduction peut simultanément cibler de nombreuses voies oncogènes. Toutefois, le rôle de l'initiation de la traduction dans la biologie du GBM est incertain tout comme les propriétés anti-néoplastique que pourraient entraîner son inhibition. Lors de cette étude, nous avons utilisé le 4EGI-1 et le silvestrol, inhibiteurs des molécules eIF4E et eIF4A, respectivement, afin de cibler l'initiation de la traduction dans les trois lignées cellulaires du GBM, soit U87, U251N et la plus virulente U87ΔEGFR. Ici, nous montrons que le 4EGI-1 inhibe l'intéraction eIF4E/eIF4G qui est essentielle à la formation du complexe eIF4F dans les cellules U87. Cette inhibition entraîne une diminution de la prolifération et de la survie cellulaires en fonction de la dose et du temps traitement. Moins de 1 % des cellules U87 et U251N et de 17,5% des cellules U87∆EGFR étant toujours présentes après un traitement de 4EGI-1 à 80 µM d'une durée de 96 heures. Une induction marquée de l'apoptose est observée après 48 heures, ainsi qu'une augmentation du marquage à de même qu'une l'annexine V+/7AAD et le clivage de la capsase-9/PARP. Ceci est s'accompagné d'une diminution de l'expression des protéines de plusieurs oncogènes dotés de 5'UTR très structurées, qui sont impliquées dans la prolifération et la survie, tels que c-Myc, cycline D-1, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 et survivine. De plus, le 4EGI-1 inhibe la migration des cellules U87 et U87∆EGFR en réponse aux stimuli chimioattractifs ainsi que la prolifération des trois lignées cellulaires dans un milieu en suspension solide. Les effets du silvestrol sont similaires à ceux de 4EGI-1 à l'égard de l'inhibition de la prolifération cellulaire, de la survie, de l'expression des protéines oncogènes et de l'induction de l'apoptose, bien qu'à des concentrations nanomolaires et à des points d'analyse différent, ce qui indique une pharmacocinétique supérieure.Nos résultats montrent la sensibilité du GBM en ce qui concerne l'inhibition de l'initiation de la traduction et sa capacité de déclencher une réponse apoptique solide. Ceci corrobore que la maîtrise de la régulation de la traduction constitue un élément puissant du traitement du cancer, particulièrement du GBM, où les options thérapeutiques sont limitées.