HIV-1 genomic RNA trafficking is an important event which remain unclear. Different cellular proteins are involved in this process and the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 (hnRNP A2) is suggested to play a role by its potential implication in ribonucleoprotein complex which is related with the microtubule network. We identified heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 (hnRNP A2) is involved in this process. To investigate the potential function of hnRNP A2 in the trafficking, protein expression was decreased using small interfering RNA and the impact on RNA localization, protein expression patterns and levels of genomic RNA in new virions was looked at. The results obtained suggested that hnRNP A2 knockdown impedes transport of the genomic RNA and causing its accumulation at the MTOC (microtubule organizing center). These data show the importance of the hnRNP A2 protein in genomic RNA trafficking and its role in HIV-1 RNA localization.

In human cells, histones bind DNA and form chromatin, a nucleoprotein complex important for various cellular processes. Abnormal histone modification is known to play causal roles in the development of cancer. Monocytic leukemia zinc finger protein (MOZ) is a MYST-family histone acetyltransferase whose gene is rearranged in chromosomal translocations giving rise to acute myeloid leukemia. This acetyltransferase functions as a potent transcriptional coactivator of Runx1 and Runx2, two homologous transcription factors that are important for definitive haematopoiesis and osteoblast maturation, respectively. Mouse knockouts have demonstrated that MOZ is required for the maintenance of hematopoetic stem cells, and is important for erythroid and myeloid cell differentiation. / Chapter I reviews the importance of chromatin regulation, MYST histone acetyltransferases and ties them together to explain how gene regulation is achieved. Chapter II addresses the characterization of the tetrameric MOZ complex, and suggests that its activity can be modulated by the presence of associated subunits such as BRPF1, and ING5. We show by histone acetyltransferase assays that MOZ and MORF activity is indeed enhanced by associated proteins. We have mapped the interaction domains of BRPF1 required for binding by MOZ, ING5, and Eaf6 in an effort to understand the mechanism of activation. Given that MOZ and ING proteins contribute to oncogenesis by chromosomal translocations and loss of function respectively, the characterization of the multisubunit complex provides novel mechanistic insights into its function in normal human cells and under conditions of leukemia or other cancers.

CDP/Cux, a transcription factor involved in cell cycle regulation, has been shown to play a significant but currently ill-defined role in cancer development, including breast cancer, leiomyomas and myeloid leukemia. Recently, Tandem Affinity Purification (TAP)/Mass Spectrometry (MS) experiments revealed that CDP/Cux may interact with hRev1, a translesion polymerase known to play an important role in damage-induced mutagenesis. To study this interaction, we generated polyclonal antibodies against hRev1. These antibodies were found to be capable of detecting recombinant and endogenous hRev1 through Western blotting, and endogenous hRev1 through immunofluorescence. We also confirmed the interaction of CDP/Cux with hRev1 in vivo in several cell lines using coimmunoprecipitation, affinity purification and immunofluorescence experiments. From these studies it appears that full-length hRev1 binds to a p110 isoform of CDP/Cux, and this complex was found to be capable of binding to DNA through southwestern blotting. Furthermore, GST pulldown assays have shown that the BRCT domain located at the N-terminus of hRev1 is necessary for binding CDP/Cux in vitro, as deletion of this domain abolished or greatly reduced the protein-protein interaction with CDP/Cux. Furthermore, in cells synchronized into S-phase, both full-length CDP/Cux (p200) and p110 were found to bind to DNA with increased affinity following treatment with low levels of UVC. These proteins were also found to have a generally enhanced affinity for DNA with a 5' base overhang compared to a fully double-stranded DNA probe. These findings are the first to define an interaction between CDP/Cux and hRev1. If CDP/Cux cooperates with hRev1 in translesion synthesis, this would implicate CDP/Cux in enabling mutagenesis in response to DNA damage and perhaps expose the consequence of aberrant CDP/Cux activity in cancer cells.

The Met receptor tyrosine kinase (RTK) and its ligand, hepatocyte growth factor (HGF) are potent regulators of epithelial remodeling, dispersal, and invasion and their deregulation is frequently observed in human cancers. These processes are coordinated through signal transduction pathways activated downstream of Met. In turn, it is now understood that an important aspect of signalling outcome is modulated through RTK downregulation via receptor internalization, degradation and also RTK recycling to spatially restricted subcellular domains. Although a strong relationship between RTK endocytosis and signalling had been established prior to this thesis, the precise mechanism(s) of how this is achieved is still poorly understood and little was known for the Met RTK.To address this specifically for the Met RTK, I have characterized the function of two endocytic proteins in Met RTK trafficking and the consequence for biological response. Work in this thesis shows that following HGF-mediated Met activation, the endocytic adaptor protein, Eps15, is recruited to the Met receptor, and becomes both tyrosine-phosphorylated and ubiquitinated. Recruitment of Eps15 requires Met receptor kinase activity and involves two distinct Eps15 domains. Unlike previous reports for other receptors, recruitment of Eps15 to Met involves a distinct mode of recruitment involving the coiled-coil domain of Eps15 and the signaling adaptor molecule, Grb2. This identified a new mechanism of recruitment for Eps15 downstream of the Met receptor.In the third part of my thesis, I establish that the endocytic adaptor molecule, Golgi-localized gamma-ear containing Arf-binding protein 3 (GGA3), interacts selectively with Met when stimulated by HGF, to sort Met for recycling through a Rab4 positive compartment rather than degradation. I provide evidence supporting a molecular mechanism through which GGA3 regulates Met recycling and demonstrate that this is essential for both prolonged signaling and HGF-mediated biological response. This data defines an active recycling pathway involving GGA3, and supports a broader role for GGA3-mediated cargo selection in targeting receptors destined for recycling.Finally, in the fourth chapter of this thesis, evidence for microtubule interactions in Met-mediated Rab4 vesicle recycling is presented. We characterize a mechanism reliant on the microtubule +TIP, CLIP-170, linking Met/Rab4-positive recycling vesicles to microtubules for transport to the lamellipodia. We propose that the specific targeting of the Met receptor to the leading edge functions as a specialized signalling microenvironment, required for maintaining normal migration dynamics. These studies identify Met RTK endocytosis as a crucial regulatory process for RTK signalling and biology and stress the need for further studies examining the interplay of RTK endocytosis and signalling in the context of normal development and cancer settings. / Le récepteur tyrosine kinase (RTK) Met, ainsi que son ligand, le facteur de croissance des hepathocytes (HGF), sont de puissants régulateurs du remodelage, de la dispersion et de l'invasion des cellules épithéliales, et leur dérèglement est fréquemment observé dans divers types de cancers chez l'humain. Ces processus sont coordonnés par l'activation de voies de signalisation induites par Met. Il est maintenant connu que l'internalisation, la dégradation ainsi que le recyclage des RTKs vers des domaines spécifiques de la cellule constituent des facteurs importants influençant les conséquences de l'activation de ces voies de signalisation. Bien que le lien entre l'endocytose et la signalisation des RTKs ait été démontré avant ce mémoire, les mécanismes spécifiques de cette association restent encore mal compris. Pour aborder ce problème spécifiquement concernant le récepteur Met, j'ai caractérisé les rôles de deux protéines endocytiques impliquées dans le trafic de Met, et leur implication dans les réponses biologiques induites par Met. Les travaux présentés dans ce mémoire montrent qu'en réponse à l'activation de Met par HGF, l'adaptateur endocytique Eps15 est recruté par le récepteur et devient tyrosine phosphorylé et ubiquiné. Le recrutement d'Eps15 requiert l'activation du récepteur tyrosine kinase Met, et implique deux domaines distincts d'Eps15. Contrairement à ce qui a été rapporté pour d'autres récepteurs, le recrutement d'Eps15 par Met met en jeu un mode de recrutement distinct impliquant le faisceau d'hélices (coiled-coil domain) d'Eps15 et l'adapteur signalétique Grb2. Ceci a permis d'identifié un nouveau mécanisme de recrutement d'Eps15 par le récepteur Met.Dans la troisième partie de ce mémoire, j'ai établi que l'adaptateur endocytique Golgi-localized gamma-ear containing Arf-binding protein 3 (GGA3) interagit spécifiquement avec Met lorsque celui-ci est stimulé par HGF. En conséquence, GGA3 trie Met pour le recyclage via un compartiment contenant Rab4, plutôt que de le trier pour être dégradé. J'y démontre un nouveau mécanisme moléculaire par lequel GGA3 contrôle le recyclage de Met, ce qui est essentiel pour la signalisation prolongée de Met et des réponses biologiques induites par HGF. Ces données définissent un nouveau mécanisme de recyclage actif impliquant GGA3 et supportent un rôle plus large joué par GGA3 dans la sélection des récepteurs destinés au recyclage.Finalement, le rôle des microtubules dans le recyclage des vésicules contenant Rab4 induit par Met est présenté dans le quatrième chapitre de ce mémoire. Nous avons caractérisé un mécanisme dépendant d'une protéine de l'extrémité (+TIP), CLIP-170, qui lie les vésicules de recyclage contenant Met et Rab4 aux microtubules, contrôlant ainsi leur transport vers les lamellipodes. Nous proposons que le ciblage spécifique du récepteur Met vers le front de migration fonctionne comme un microenvironnement signalétique spécifique requis pour le maintient de la dynamique migratoire. Ces travaux ont permis d'identifié l'endocytose du récepteur tyrosine kinase Met comme étant un processus de régulation cruciale pour la signalisation des RTK et pour les réponses biologiques associées à cette signalisation. Ces travaux démontrent qu'il y a un besoin important d'examiner la relation entre l'endocytose des RTKs et leur signalisation aussi bien dans le contexte du développement normal que dans le cadre du développement cancéreux.

The procedure by which mRNA is translated to protein is an important and tightly regulated process in cellular biology. In mammalian cells, the phosphorylation of the alpha subunit of the translation initiation factor 2 (eIF2alpha) is an important mechanism of translational control. This event is mediated by a family of kinases which respond and are activated by distinct forms of cellular stress. The work described herein addresses novel roles of PKR in regulating the Hypoxia-inducible Factor 1-alpha (HIF-1alpha), a key factor that is activated by hypoxic conditions within the tumor microenvironment. Moreover, we developed novel in vivo and in vitro experimental models to better understand the role of the eIF2alpha phosphorylation pathway in cancer biology. More specifically we generated a transgenic mouse expressing a conditionally active eIF2alpha kinase and engineered a novel human cell culture model to dissect the biological functions of eIF2alpha phosphorylation in proliferation and the response to chemotherapeutic agents. Through this work we demonstrated that the eIF2alpha kinases can exert antitumor properties independently of eIF2alpha phosphorylation by inhibiting oncogenic signaling (Stat3), and tumor progression (HIF-1). Furthermore we demonstrate that eIF2alpha phosphorylation can act in a tumor promoting manner by being cytoprotective in response to chemotherapeutics. Our studies suggest that designing chemotherapeutic approaches that inhibit the cytoprotective arm of eIF2alpha phosphorylation under conditions where the kinases are activated may have important implications for impairing tumor progression not only by inhibiting hypoxic signaling but also by diminishing cell proliferation and enhancing efficacy of current chemotherapeutic drugs. / La traduction des ARNm en protéines est un processus important et finement régulé dans la biologie de la cellule. Dans les cellules de mammifères, la phosphorylation de la sous unité alpha du facteur d'initiation de la traduction 2 (eIF2alpha) est un mécanisme important du contrôle de la traduction. Cet événement est induit par une famille de kinases activées par différentes formes de stress cellulaire. Notre travail s'intéresse aux nouveaux rôles de la voie de phosphorylation d'eIF2alpha dans la régulation du facteur induit par l'hypoxie 1-alpha (HIF-1alpha), un facteur clef activé par des conditions hypoxiques dans le microenvironnement de la tumeur. Nous avons développé des nouveaux modèles expérimentaux in vivo et in vitro pour mieux comprendre le rôle de la voie de phosphorylation d'eIF2alpha dans la biologie du cancer. Plus précisément, nous avons généré une souris transgénique qui exprime une kinase d'eIF2alpha active conditionnellement ainsi qu'un nouveau modèle de culture de cellule humaine pour caractériser les fonctions biologiques de la phosphorylation d'eIF2alpha dans la prolifération et la réponse aux agents chimiothérapeutiques. Nous avons établis que les kinases d'eIF2alpha peuvent exercer des propriétés antitumorales indépendamment de la phosphorylation d'eIF2alpha en inhibant la signalisation oncogénique, et la progression tumorale. De plus, nous avons démontré que la phosphorylation d'eIF2alpha peut agir de façon à promouvoir la tumeur en étant cytoprotective en réponse aux agents chimiothérapeutiques. Nos recherches suggèrent que des approches thérapeutiques conçus de façon à inhiber la voie cytoprotective de la phosphorylation d'eIF2alpha dans des conditions où les kinases sont activées peut avoir des implications importantes pour empêcher la progression des tumeurs pas seulement en inhibant la signalisation hypoxique mais aussi en diminuant la prolifération des cellules et en améliorant l'efficacité des médicaments chimiothérapeutiques courants.

Reg family proteins have been implicated in islet β-cell proliferation, survival, and regeneration. Reg3β (pancreatitis-associated protein, PAP; or gene expressed in hepatocellular carcinoma-intestine-pancreas, HIP) was first reported as a pancreatic secretory protein expressed in acinar cells during the acute phase of pancreatitis. Previous studies in Dr. Liu's and other research groups have demonstrated that Reg3β was specifically induced either during islet hyperplasia in the IGF-I-deficient pancreas or as a result of GLP-1-induced islet cell growth. Reg3β has been shown to play anti-apoptotic and anti-inflammatory roles during acute pancreatitis. In the present study, we generated transgenic mice with pancreatic β-cell-specific over-expression of Reg3β and investigated the effect of Reg3β in the regulation of β-cell function during streptozotocin (STZ)-induced type 1 diabetes (T1D) and diet-induced type 2 diabetes (T2D). The data presented in Chapter II demonstrated that pancreatic islet-specific overexpression of Reg3β protein protected mice from STZ-induced T1D. The RIP-I/Reg3β mice were indistinguishable from wild-type littermates in fertility, islet morphology, β-cell mass, and insulin secretion response, yet were slightly high in glucose and low in the expression of Glut2 and insulin. These transgenic mice were significantly protected from STZ-induced hyperglycemia and weight loss that were observed in the wild-type controls. To identify the molecular networks that Reg3β is involved in, a whole genome DNA microarray analysis of isolated islet RNA samples revealed more than 45 genes whose expression were markedly up- or down-regulated as a consequence of Reg3β overexpression. We further confirmed the change in several genes, including the upregulation of islet-protective osteopontin/Spp1 and acute responsive nuclear protein Nupr1/p8 by real-time PCR, Western blots and histology. These results support the potential of Reg3β in preventing STZ-induced damage by regulating expression of specific genes.In Chapter III, mice carrying Reg3β over-expression displayed worsened T2D induced by high-fat diet (HFD), as characterized by faster and more severe development of hyperglycemia, glucose intolerance and insulin resistance. Reg3β seems to exert two opposite actions in respone to HFD: further diminishing the expression of insulin and Glut2 induced by HFD, while suppressing AMPK activity and increasing p8 expression to compensate for the loss of β-cell function. Taken together, Reg3β is a putative protector that prevents STZ-induced acute damage, but unlikely an islet growth factor and unable to protect β-cells against HFD-induced T2D. The protective effect of Reg3β is likely triggered by acute stress but ineffective against chronic stress induced by HFD. / Les protéines de la famille Reg sont impliquées dans la prolifération, la survie et la régénération des cellules pancréatiques β. Reg3β [aussi connue sous le nom de PAP (protéine associée à la pancréatite) ou encore HIP (gène exprimé dans le carcinome hépatocellulaire de l'intestin et du pancréas)] a été identifiée comme étant une protéine sécrétrice du pancréas et elle est exprimée dans les cellules acineuses pendant la phase aiguë de la pancréatite. Des études antérieures dans le laboratoire du Dr Liu ont démontré que la protéine Reg3β est spécifiquement induite durant l'hyperplasie des îlots pancréatiques à la suite d'un déficit de l'IGF-I ou encore à la suite d'une croissance de cellules d'îlots induite par GLP-I. Reg3β joue un rôle anti-apoptotique et anti-inflammatoire pendant la pancréatite aiguë. Dans cette étude, nous avons généré des souris transgéniques qui surexpriment Reg3β spécifiquement dans les cellules pancréatiques β afin d'étudier l'effet de Reg3β dans la régulation de la fonction des cellules β lors du diabète de type 1 (DT1) induit par la streptozotocine (STZ) ainsi que dans le cas du diabète de type 2 (DT2) induit par un régime alimentaire riche en gras. Les données présentées dans le chapitre II ont démontré que les îlots pancréatiques qui surexpriment la protéine murine Reg3β sont protégés du DT1 induit par la STZ. Les souris RIP-I/Reg3β transgéniques sont indiscernables des souris de contrôle de type sauvage en ce qui a trait à la fécondité, la morphologie des îlots, la masse des cellules β et la sécrétion de l'insuline. Cependant, une légère hyperglycémie et une faible expression de GLUT2 et de l'insuline ont été observées. Ces souris transgéniques sont considérablement protégées contre l'hyperglycémie induite par STZ et contre la perte de poids. A l'aide de puces d'ADN, une analyse d'échantillons d'ARN purifiés à partir d'îlots isolés a révélé l'existence de plus de 45 gènes dont l'expression est affectée par la surexpression de Reg3β. Nous avons également confirmé le changement d'expression de plusieurs gènes, y compris la régulation positive de l'osteopontin/SPP1 (qui protège les îlots et de la protéine nucléaire réactive aiguë p8/NUPR1) en utilisant le PCR en temps réel, le Western blot et l'histologie. Ces résultats confirment le potentiel de Reg3β dans la prévention des dommages induits par STZ en régulant l'expression de gènes spécifiques. Au chapitre III, nous avons démontré que la surexpression de Reg3β aggrave le DT2 induit par une alimentation riche en matières grasses. Ceci est caractérisé par le développement plus rapide et plus sévère de l'hyperglycémie, l'intolérance au glucose et la résistance à l'insuline. Reg3β semble exercer deux actions opposées en réponse à une diète riche en gras: 1) diminution accrue de l'expression basale de l'insuline et Glut2 et 2) suppression de l'activité de l'AMPK et augmentation de l'expression de la protéine p8 afin de compenser pour la perte de la fonction des cellules β. En résumé, Reg3β est un protecteur potentiel qui empêche les dommages induits par STZ aiguë, mais il est peu probable que ce soit un facteur de croissance des îlots pancréatiques. De plus, Reg3β est incapable de protéger les cellules β contre le DT2 induit par un régime alimentaire riche en gras. L'effet protecteur de Reg3β survient probablement en réponse au stress aigu mais il est inefficace contre le stress chronique induit par un régime alimentaire riche en gras.

The E4orf4 protein of adenovirus induces cell death in human cancer cells and not normal primary cells when expressed alone. E4orf4 is also lethal to the yeast Saccharomyces cerevisiae, which we use as a model system. E4orf4-induced toxicity in both mammalian and yeast cells is largely dependent on its ability to associate with protein phosphatase 2A (PP2A), a highly conserved Ser/Thr phosphatase, more specifically, with the B class of regulatory subunits, of which Bα is best characterized in mammalian cells, as well as the yeast equivalent Cdc55. Binding to the B subunit appears to inhibit PP2A activity with some substrates. Consequently, E4orf4 is a useful agent in delineating specific functions of Bα/Cdc55-containing PP2A holoenzymes in vivo. E4orf4 induces mitotic arrest, suggesting that PP2ACdc55 plays a role in regulating mitotic exit. The Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) is a multi-subunit complex involved in the timely degradation of cell cycle proteins to allow the mitotic exit of cells. Two forms of the APC, APCCdc20 and APCCdh1, control mitotic transitions and we demonstrate that E4orf4, through its interaction with Cdc55, induces unscheduled APCCdc20 activity in S-phase arrested cells, and results in the untimely degradation of both Pds1/securin and the cohesin Scc1. In contrast, E4orf4 prevents induction of APCCdh1. Thus, E4orf4 may uncouple PP2ACdc55 regulation of mitotic events. While the specific mechanism by which E4orf4 mediates cell death is unclear, its interaction with the B regulatory PP2A subunit plays a significant role. Cdc55 and Bα contain seven WD40 repeats organized into a seven-bladed propeller structure. In an attempt to functionally map the Cdc55 subunit, we identified regions in Cdc55 required for E4orf4 binding. A polypeptide composed only of blades 1 and 2 bound to E4orf4, and overexpression of this fragment blocked E4orf4 toxicity in yeast. Later on, with the knowledge of the Bα crystal structure, we delineated the precise regions of Bα/Cdc55 involved in E4orf4 binding. Mutational studies in both yeast Cdc55 and mammalian Bα suggest that E4orf4 binds across the substrate-binding groove of the B regulatory subunits, and binding interferes with the interaction of certain substrates, such as p107, with the PP2A holoenzyme. This deregulation of PP2A activity by E4orf4 may affect the functions of certain critical substrates, ultimately leading to cell death. / La protéine adénovirale E4orf4 induit la mort cellulaire dans les cellules cancéreuses humaines et non dans les cellules normales primaires lorsqu'elle est exprimée seule. E4orf4 est également létale dans la levure Saccharomyces cerevisiae, que nous utilisons comme modèle. La toxicité induite par E4orf4 dans les cellules de mammifères et dans la levure dépend largement de son association avec la phosphatase protéique 2A (PP2A), une Ser/Thr phosphatase hautement conservée. Plus spécifiquement, E4orf4 s'associe avec les sous-unités régulatrices de classe B, parmi lesquelles Bα, la mieux caractérisée dans les cellules de mammifères, et Cdc55, son équivalent chez la levure. Il semble que la liaison avec la sous-unité B inhibe l'activité de PP2A pour certains substrats. En conséquence, E4orf4 est un outil très utile pour définir les fonctions spécifiques de l'holoenzyme PP2A contenant Bα/Cdc55 in vitro. E4orf4 induit un arrêt mitotique, ce qui suggère que PP2ACdc55 joue un rôle en régulant la sortie de mitose. Le complexe APC/C (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) est un complexe de plusieurs sous-unités impliqué dans la dégradation minutée des protéines du cycle cellulaire, permettant ainsi aux cellules de sortir de mitose. Deux formes de l'APC/C, APCCdc20 et APCCdh1, contrôlent les passages mitotiques et nous avons démontré qu'E4orf4, par son interaction avec Cdc55, induit une activité non programmée d'APCCdc20 dans les cellules arrêtées en phase S, ce qui résulte en une dégradation désynchronisée de Pds1/securin et de la cohésine Scc1, alors qu'au contraire, E4orf4 prévient l'induction d'APCCdh1. Il semble donc qu'E4orf4 soit responsable du découplage de la régulation, par PP2ACdc55, des évènements mitotiques. Bien que le mécanisme spécifique par lequel E4orf4 régule la mort cellulaire reste incertain, son interaction avec la sous-unité régulatrice B de PP2A joue un rôle important. Cdc55 et Bα contiennent sept répétitions WD40, organisées dans une structure en hélice à sept pales. Dans le but de cartographié fonctionnellement la sous-unité Cdc55, nous avons identifiés les régions de Cdc55 qui sont nécessaire pour la liaison avec E4orf4. Un polypeptide composé uniquement des pales 1 et 2 est toujours capable de se lier à E4orf4, et la surexpression de ce fragment bloque la toxicité d'E4orf4 dans la levure. Plus tard, avec la résolution de la structure cristalline de Bα, nous avons délimité les régions précises de Bα/Cdc55 impliquées dans la liaison avec E4orf4. Des études mutationnelles réalisées à la fois dans Cdc55 (levure) et dans Bα (mammifère) suggèrent qu'E4orf4 se lie aux sous-unités régulatrices B au travers de la zone de liaison du substrat, et que cette interaction interfère avec la liaison de certains substrats, tels que p107, avec l'holoenzyme. Cette dérégulation de l'activité de PP2A par E4orf4 pourrait affecter les fonctions de certains substrats vitaux, ouvrant ainsi la voie vers la mort cellulaire.

The troponin I fast (TnIfast) gene, a member of a differentially-expressed three-member TnI multigene family is expressed specifically in fast skeletal muscle fibers. The tissue and fiber type specificity of the TnIfast gene is driven by an Intronic Regulatory Element (IRE) in the first intron. The IRE is a 148 bp transcriptional enhancer, that contains four known or suspected cis regulatory elements; E-box, MEF2, CCAC, and CAGG elements. A previous study in this lab suggested that fast-fiber type specificity is driven by elements that reside in the 5'-most 30 bp of the IRE, a region that includes the E-box motif. My initial goal was to further localize the hypothetical fast fiber type specific element(s) within this region. The experimental approach was to make IRE partial deletions and mutations in reporter gene constructs in which IRE derivatives were cloned upstream of an enhancer-dependent TnI fast minimal promoter driving the reporter gene LacZ. The transcriptional activity of these constructs in fast and slow muscle fibers was evaluated by direct gene transfer into adult mouse skeletal muscle followed by histochemical analysis of LacZ reporter expression. My results showed that the E-box was not required for IRE fast-fiber specificity or high-level expression in adult skeletal muscles. Moreover, additional deletion constructs indicated, in contrast with the previous study, that the 5'-most 30 bp segment is not required for fast-fiber-specificity. I was able to show that a 49 bp IRE segment, not including the 5'-most 30 bp, but including MEF2 and CCAC elements, is sufficient to drive fast-fiber specific expression in adult mouse skeletal muscles. I discuss possible causes for the discordant results between the two studies, and the implications of my findings for the regulatory mechanisms of the IRE. / Le gène troponin I rapide (TnIfast) est un member d'une famille de gènes multiple don't les members s'expriment d'une façons differente celon le type de fibre du muscle squelettique. La spécificité pour le type de tissue et le type de fibre du gène TnIfast est due a un "intronic regulatory element" (IRE) situé dans le premier intron. Le IRE est un enhancer de 148 bp qui contient quatre éléments-cis connus; E-box, MEF2, CCAC et le CAGG elements. Une étude précédente dans notre laboratoire a suggeré que la spécificité du gène troponin I rapide pour le type de fibre est due a des éléments résidant dans les 30 pair de bases situé dans l'éxtrimité gauche du IRE, une région qui contient le site "E-box". Mon but initial était de localise cet élément hypothétique dans ces 30 pairs de bases de l' IRE. Mon approche experimental était de préparer des versions du IRE mutées ou tronquées partiellement. Ces derives de IRE ont été couplés a un gène signal consistant en un promoter TnI fast minimal lié avec le gène LacZ. L'activité transcriptionnelle de ces construits été evalué par transfert de gène in vivo dans le muscle squelettique de souris adults. Cela été suivit par l'analyse histochimique de l'expression du gène signal, le LacZ. Mes resultats ont montre que le E-box n'était pas essentielle pour l'expression ou la spécificité pour les fibre rapide de l' IRE dans les muscle squelettique. De plus, des experiences additionelle ont indique que les 30 bp sont pas essentiel pour la spécificité pour le type de fibre rapide et cela en contradiction avec l'étude précédant. Dans des études additionelles j'ai pu montrer qu'un sègment de 49 bp de l' IRE, inclue les éléments MEF2 et CCAC, est suffisant pour causée l'expression de la spécificité pour le fibre rapide.

Apoptosis, or cell-suicide, is a well-conserved mechanism in higher eukaryotes that is required for development and immunity. Dysregulation of apoptosis is a hallmark of many pathologies including neurodegenerative diseases, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and cancer. Apoptosis is achieved by a specialized set of proteases named caspases. The expression of caspases as well as their natural inhibitors, the inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) is tightly regulated to prevent diseases. Here, we show that two important apoptotic players, caspase-9 and the IAP survivin, are regulated at the level of their messenger ribonucleic acid (mRNA). Indeed, the RNA-binding protein HuR binds to both mRNAs and modulate the expression of the corresponding proteins. In response to cellular stress, HuR modulates the translation of the anti-apoptotic survivin to allow the cell to cope with the stress. If the assault continues, HuR switches partners to associate with and stabilize the pro-apoptotic caspase-9 mRNA and promote cell death. This study therefore sheds light on an important mechanism responsible for the transition between a pro-survival and a pro-death status in eukaryotic cells in response to stress. / L'apoptose, ou suicide cellulaire, est un mécanisme impliqué dans le développement et la réponse immunitaire et qui est conservé à travers l'évolution par tous les organismes eucaryotes. La dérégulation de l'apoptose est une des caractéristiques distinctives de plusieurs pathologies incluant certaines maladies neurodégénératives, le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) et le cancer. L'exécution de l'apoptose est assurée par une catégorie spécialisée de protéases appelée caspases. L'expression de ces caspases ainsi que celle de leurs inhibiteurs naturels, les protéines inhibitrices de l'apoptose (inhibitors of apoptosis proteins, ou IAPs, en anglais) est régulée de façon très stricte afin d'éviter les maladies qui pourraient découler de leur dérégulation. Ce mémoire présente des évidences selon lesquelles deux importantes protéines impliquées dans l'apoptose, caspase-9 et survivin, sont régulées au niveau de leur acide ribonucléique messager (ARNm ou mRNA en anglais). En effet, la proteine liant l'ARN, HuR, lie les deux ARN messagers, stabilisant celui de caspase-9 et potentiellement en modifiant l'efficacité de traduction de survivin. En réponse à un stress cellulaire, HuR s'associe initialement l'ARNm de survivin, une protéine anti-apoptotique, afin de tenter de résister au stress, mais si le stress se poursuit, HuR délaisse l'ARNm de survivin pour s'associer à celui de caspase-9, et promouvoir la mort cellulaire. Cette étude fait donc la lumière sur un important mécanisme cellulaire responsable de la transition entre deux états, pro- et anti-apoptotique, dans les cellules eucaryotes en réponse à un stress.

In the present study, the polymerase chain reaction was used to generate a 0.75 kb cDNA clone encoding the mouse U1 snRNP specific C protein from a somatic cDNA library. The identity of the 0.75 kb fragment was confirmed by sequence analysis. This cDNA sequence encodes a protein that has been shown to associate specifically with the U1 snRNP. Northern blot analysis revealed that U1 snRNP C mRNA is a 0.75 kb transcript present in a variety of tissues in the mouse including, the testes, heart, intestine, lung, muscle, pancreas, spleen, kidney, brain and liver. In situ hybridization confirmed the somatic and haploid expression of the U1 snRNP specific C mRNA transcript. In an attempt to correlate RNA expression with protein distribution, light microscopic immunocytochemistry with the anti-Sm antibody was utilized to illustrate spliceosomal snRNP distribution within the mouse. Immunoblots of testicular homogenates probed with the anti-Sm antibody revealed several reactive proteins, of which one, a 21 kD polypeptide, appears to be the U1 snRNP specific C protein based on its predicted molecular weight. Immunoperoxidase staining using the anti-Sm antibody revealed protein localization predominantly within the nuclei of most cells examined, namely; hepatocytes, somatic and germ cells of the testis, neuronal cells within the cerebral cortex and cerebellum, cardiocytes, nephronic cells, intestinal cells, pancreatic acinar cells and Islet of Langerhans cells. However, exceptions in this nuclear reaction were noted in the nuclei of some pancreatic acinar cells, cells of the spleen, and in all elongated spermatids. (Abstract shortened by UMI.)