Receptor tyrosine kinases (RTKs) are transmembrane cellular receptors that respond to growth factor stimulation and promote cellular proliferation in normal biological processes, such embryogenesis and wound healing. RTK activation and signalling are tightly regulated processes; their dysregulation promotes unrestrained cellular proliferation and is associated with cancer initiation and progression. As such, RTKs are targets of many therapeutic strategies for the treatment of cancer. However, despite initial success, both innate and acquired resistance hinders the efficacy of many of these inhibitors. Active signalling by the Met RTK plays a role in melanomas, osteosarcomas, breast carcinomas, gliomas, non-small cell lung cancers (NSCLC), and cancers of the gastro-intestinal (GI) tract. Multiple mechanisms of Met oncogenic activation have been identified, including autocrine/paracrine stimulation, Met overexpression, genomic amplification, point mutation and alternative splicing. Inhibitors of Met are currently in all phases of clinical trials for multiple tumour types, thus there exists a need to better understand the mechanisms through which Met promotes tumourigenesis, and how cells respond to Met inhibitors, and how resistance can occur.In my thesis, I establish that in four different MET-amplified gastric cancer cells there is a Met-dependent loss of its negative regulator, the E3 ligase, Cbl. I utilized structure-function analysis to demonstrate that this loss of Cbl levels requires Met kinase activity, Cbl E3 ligase activity, and recruitment of Cbl to Met. Where Met is active, Cbl is recruited and subsequently ubiquitinated, and degraded through the proteasome. I also observed that EGFR, which is also negatively regulated by Cbl, is less efficiently degraded upon stimulation in the presence of active Met and low Cbl levels. Thus, I demonstrate that Met-driven Cbl loss not only promotes dysregulation of Met, but of other Cbl target proteins as well.As much of what is known with respect to Met signalling has been identified in the context of activation by its ligand, hepatocyte growth factor (HGF), I investigated the Met-dependent pathways and transcriptional program in gastric cancer cells where Met is chronically active via amplification. I observed that activation of the Ras/Mek/Erk, PI3K/AKT and STAT3 pathways all require Met kinase activity, with STAT3 signalling required for Met-dependent cell proliferation. Interestingly, upon treatment with Met inhibitor, Erk becomes reactivated at later time points (16-24h) in 2/4 cell lines tested. This correlated with loss of Erk negative regulators, DUSP4 and DUSP6, upon Met inhibition. Dual inhibition of Met and Mek decreased cell viability as compared to inhibition of either alone. Hence loss of Erk negative regulators upon Met inhibition, allows for reactivated Erk to promote cell survival and may contribute to innate resistance to targeted Met therapeutics. Next, I established Met inhibitor-resistant cells and utilized gene and protein expression arrays to identify the mechanisms of resistance. I observed that resistant cells were still MET-amplified, but Met kinase activity remained inhibited. Met-independent cell proliferation is, in part, mediated by Erk signalling. Further, I also provide evidence that cell survival signals, in the presence of Met inhibition, may be mediated by a mesenchymal-to-epithelial transition. Altogether, the reactivation of Erk signalling under conditions of innate and acquired resistance to Met inhibitors suggests that combinatorial therapy targeting both Met and Mek may lead to better efficacy and response. / Les récepteurs à activité kinase (RTK) sont des protéines transmembranaires situées à la surface des cellules qui, une fois activés par des facteurs de croissance, induisent la prolifération cellulaire durant des processus biologiques normaux. La signalisation par les RTKs est un processus devant être hautement régulé étant donné qu'une signalisation aberrante des RTKs induit une prolifération cellulaire incontrôlée typique au développement et à la progression de tumeurs. Les RTKs constituent donc une cible thérapeutique de choix pour le traitement du cancer et plusieurs inhibiteurs de RTKs sont maintenant utilisés en clinique. Par contre, malgré des résultats initiaux prometteurs, il appert que de multiples tumeurs développent des mécanismes de résistance aux inhibiteurs de RTKs. Le RTK Met joue un rôle important dans de multiples cancers. Plusieurs mécanismes d'activation oncogénique du récepteur Met ont été identifiés. Des inhibiteurs de Met sont présentement testés en essais cliniques pour le traitements du cancers. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment le RTK Met promeut la formation de tumeurs, comment les cellules cancéreuses répondent aux traitements ainsi que les mécanismes de développement de résistance aux inhibiteurs. Dans cette thèse, j'établis que dans des lignées de cellules cancéreuses gastriques où le gène MET est amplifié, il y a une perte de la protéine ligase E3 Cbl qui est un inhibiteur de Met. À l'aide d'une analyse structurelle et fonctionnelle, je démontre que cette perte de Cbl requière l'activité kinase de Met, l'activité ligase de Cbl et le recrutement de Cbl à Met. L'activation de Met mène au recrutement de Cbl, à son ubiquitination et sa dégradation via le protéasome. J'ai observé que le RTK EGFR, qui est aussi régulé négativement par Cbl, est moins efficacement dégradé suite à sa stimulation en présence d'un récepteur Met actif et de bas niveaux de Cbl. Ainsi, je démontre que la perte de Cbl suite à l'activation de Met mène à la dérégulation de Met, ainsi que d'autres cibles de Cbl.Étant donné que la majorité de ce qui est connu concernant la signalisation en aval de Met a été étudiée dans le contexte de l'activation du RTK par son ligand, le facteur de croissance hépatocytaire HGF, j'ai décidé d'étudier les signaux et programmes de transcription activés en aval de Met quand le récepteur est activé de manière chronique, suite à son amplification. J'ai observé que l'activation des voies de signalisation Erk, AKT et STAT3 requièrent toutes l'activité kinase Met, la signalisation par STAT3 contribuant à la prolifération cellulaire. Curieusement, suite au traitement des cellules cancéreuses avec un inhibiteur de Met, Erk devient réactivé à des temps subséquents (16-24h) dans deux des quatre lignées cellulaires analysées. Ceci corrobore avec la perte des régulateurs négatifs de Erk, DUSP4 et DUSP6, suite à l'inhibition de Met. L'inhibition combinée de Met et Mek diminue la viabilité cellulaire comparée à l'inhibition de Met ou Mek seulement. Par conséquent, la perte des régulateurs négatifs d'Erk suite à l'inhibition de Met permet la réactivation d'Erk et la survie des cellules, et peut contribuer à la résistance innée de certaines cellules cancéreuses aux inhibiteurs de Met.Suite à ces résultats, j'ai établi des lignées cellulaires résistantes à un inhibiteur de Met et analysé l'expression des gènes et protéines à l'aide de matrices pour identifier les mécanismes de résistances. J'ai observé que le gène MET est toujours amplifié dans les cellules résistantes, mais que l'activité kinase reste inhibée en présence de l'inhibiteur. La prolifération cellulaire indépendante de Met est en partie assurée par Erk. Sur la base de ces résultats, la réactivation de la voie de signalisation Erk dans des conditions de résistance innée ou acquise aux inhibiteurs de Met implique qu'une thérapie combinatoire ciblant Met et Mek puisse être plus efficace que les monothérapies.

Rho-family proteins are a major branch of the Ras superfamily of small GTPases. These proteins can be further subdivided into six subfamilies according to primary amino acid sequence identity, structural motifs and biological function: Rho, Cdc42, Rac, RhoBTB, RhoT and Rnd subfamily. Rho-family proteins are "molecular switches" and cycle between GDP-bound "inactive" state and GTP-bound "active" state by regulation of guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and GTPases-activating proteins (GAPs). Rho GTPases have a large collection of effectors and are involved in numerous cellular and physiological processes, such as cytoskeletal reorganization, microtubule dynamics, cell polarity, gene expression and cell cycle progression. However, it is poorly understood how Rho GTPases select specific effectors for diverse physiologic functions. We hypothesize that the specificity of effector choice is dictated by the individual GEF or by scaffold proteins binding either the GEF or the Rho proteins. To test this hypothesis, I used a system biology approach which will determine the complete interactome of the Rac GTPases (Rac1, Rac2, Rac3, and RhoG) in their active and inactive conformation. Through this method, we tried to discover new Rac effectors, possible molecular scaffolds and the Rac:GEF and Rac:GAP specificity. / Les protéines de la famille Rho forment une branche majeure de la superfamille des petites GTPases Ras. Ces protéines peuvent être subdivisées en six sous-familles selon leur identité de séquence d'acides aminés primaires, leur motifs structuraux et leur fonction biologique, soient les sous-familles: Rho, Cdc42, Rac, RhoBTB, RhoT et Rnd. Les petites GTPases agissent comme des "interrupteurs moléculaires" soit qu'elles vont osciller entre un état "inactif" (GTPase-GDP) et un état "actif" (GTPase-GTP), et ce cycle est régulé par des facteurs d'échange de nucléotides guanine (GEFs) et des protéines activatrices de GTPases (GAPs). Les GTPases Rho ont une multitude d'effecteurs et elles sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires et physiologiques, tels que la réorganisation du cytosquelette, la dynamique des microtubules, la polarité cellulaire, l'expression génique et la progression du cycle cellulaire. Cependant, il est encore mal compris comment les GTPases Rho sélectionnent des effecteurs spécifiques pour les différentes fonctions physiologiques. Nous émettons l'hypothèse que le choix de l'effecteur est dictée par la GEF impliquée ou par une protéine d'échafaudage qui est soit liée à la GEF ou à la GTPase. Pour tester cette hypothèse, j'ai utilisé une approche de la biologie des systèmes qui déterminera l'interactome complet des GTPases Rac (Rac1, Rac2, RAC3 et RhoG) dans leur conformation active et inactive. Grâce à cette méthode, nous avons essayé de découvrir des nouveaux effecteurs de Rac, des protéines d'échafaudage, ainsi que des GEFs et des GAPs spécifiques pour Rac.

Lysine acetyltransferases (KATs) are post-translational modifiers that catalyze acetylation of histones and non-histone proteins at specific lysine residues. The MYST family in humans consists of five proteins MOZ, MORF, Tip60, MOF, and HBO1. MYST proteins have diverse biological activities, ranging from regulation of cell homeostasis to chromatin structure across broad chromosomal domains. Ubiquitination is another posttranslational modification that has similar biological features as acetylation. However, the process of ubiquitination requires three enzymes to transfer the ubiquitin tag to target proteins: an E1 (ubiquitin activating enzyme), an E2 (conjugating enzyme), and an E3 ligase that determines the specificity of ubiquitination. E3 ligases are involved in many cellular processes similar to MYST proteins. Recently, the E3 ligase RNF8 has been identified to play a significant role in DNA damage repair. So far, only a limited number of substrates and cellular functions have been assigned to RNF8. In searching for additional substrates, we have found that all MYST family are interaction partners for RNF8. To gain a better functional understanding of this binding we tested if RNF8 could modulate acetylation activity. Indeed, our data revealed that RNF8 binding has the ability to regulate acetylation activity of all MYST members. Due to the importance of the MYST family and RNF8 in regulating many cellular functions, our findings shed light on new regulatory mechanisms of histone modifiers that carry out epigenetic modifications responsible in shaping many cellular activities. / Les lysine acétyltransferases (KATs) sont des modificateurs post-traductionneles qui catalysent l'acétylation sur des résidus de lysine spécifiques dans des protéines histones et non-histones. Chez l'humain, la famille MYST se compose de cinq protéines que sont MOZ, MORF, Tip60, MOF, et HBO1. Ces protéines MYST ont des activités biologiques diverses, allant de la régulation de l'homéostasie cellulaire à celle de la structure de la chromatine dans des domaines chromosomiques. L'ubiquitination est une autre modification post-traductionnelle qui a des caractéristiques biologiques similaires à celles de l'acétylation, mais dont le processus requière trois enzymes pour le transfert de l'étiquette ubiquitine sur les protéines cibles. Ces enzymes sont E1 (enzyme activatrice d'ubiquitine), E2 (enzyme de conjugaison), et E3, une ligase qui détermine la spécificité de l'ubiquitination. Les ligases E3 sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires semblables à ceux des protéines MYST. Récemment, la ligase E3 RNF8 a été identifiée comme jouant un rôle important dans la réparation de l'ADN. Jusqu'à présent, seul un nombre limité de substrats ont été attribués à la protéine RNF8. En cherchant de nouveaux substrats, nous avons observé que toutes les protéines de la famille MYST sont des partenaires d'interaction pour RNF8. Afin d'avoir une meilleure compréhension de la fonction de ces interactions, nous avons fait des tests pour vérifier si RNF8 peut moduler l'activité d'acétylation. Nos données ont démontré que l'interaction avec RNF8 a la capacité de réguler l'activité d'acétylation de toutes les protéines de la famille MYST. Considérant l'importance des protéines MYST et de RNF8 dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires, nos résultats mettent en lumière de nouveaux mécanismes de régulation des modificateurs d'histones. Soulignons que ceux-ci effectuent des modifications épigénétiques responsables de l'élaboration de nombreuses activités cellulaires.

Nuclear receptors regulate various cellular processes by modulating gene expression in response to chemical signals produced by physiological stimuli. The absence of an identified ligand for the orphan nuclear receptor ERRα stresses the importance of post-translational modifications (PTMs) and coregulators in determining its activity. The O-GlcNAc modification is unique to the glucose-dependent hexosamine biosynthetic pathway, and has been suggested that it acts as a "nutrient sensor" of the cell. We demonstrate that changing cellular levels of the O-GlcNAc PTM affects the genomic binding profile and transcriptional activity of ERRα. The differential responses of known ERRα gene targets suggests that an ERRα transcriptional program regulated by O-GlcNAc levels is complex, and does not indiscriminately increase the activity of ERRα on all of its target genes. We were unable to show that ERRα is directly O-GlcNAcylated, but its partners have been. Which could account for some of the observations presented. The ability for the glucose-dependent O-GlcNAc modification to alter ERRα activity supports the known role of ERRα as a key regulator of metabolic genes and implies that it is important in the cellular response to changes in physiological nutrient availability. / Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription qui, suite à différents stimuli physiologiques, contrôlent des processus moléculaires variés en modulant l'expression de leurs gènes cibles. Le récepteur ERRα (Estrogen-related receptor) est considéré comme un récepteur orphelin, car jusqu'à présent aucun ligand pour ce récepteur n'a été identifié. Par conséquent, les différents stress affectant la voie d'ERRα modifie son activité via des modifications post-traductionnelles ou en changeant l'activité de ses corégulateurs. La modification O-GlcNac est unique à la voie biosynthétique hexosamines glucose-dépendante et plusieurs auteurs suggèrent qu'elle sert de « senseur nutritionnel » de la cellule. Dans le présent mémoire, nous démontrons que la modulation des niveaux cellulaires d'O-GlcNac affecte le profil d'interactions géniques d'ERRα en plus d'altérer l'activité transcriptionnelle de ce récepteur nucléaire. Plusieurs patrons de réponse suivant la modification de cette voie ont été observés, ce qui suggèrent que la modification du programme transcriptionnel d'ERRα par la voie O-GlcNac est complexe. Bien que nous n'ayons pu démontrer qu'ERRα était une cible directe de la modification O-GlcNac, certains de ses corégulateurs ont déjà été démontrés comme subissant cette modification, ce qui pourrait expliquer certains des résultats obtenus. La capacité de la voie O-GlcNac de modifier l'activité d'ERRα supporte le rôle clé d'ERRα comme régulateur majeur des gènes métaboliques et implique qu'il est un acteur clé dans la réponse cellulaire suite à des changements physiologiques de disponibilité des nutriments.

The tightly regulated Notch1 signaling pathway plays important roles in cell fate decisions and tissue homeostasis, and its disregulation has been implicated in several disease pathologies, including hematopoietic disease and cancer. Our group previously identified Notch1 as a frequent target of proviral insertion mutagenesis in retrovirus-induced T-cell leukemia in MMTV/cmyc transgenic mice. Two transcript products were identified in this study: a constitutively activated form of the Notch1 intracellular domain (NIC), and a truncated, secreted form of the Notch1 extracellular domain (NEC). While NIC has been implicated by several groups including ours in transformation and tumor formation, the functional roles of NEC remain elusive. We previously generated Tg mice which overexpress the truncated form of NEC under the regulation of the human CD4 promoter, and reported that while no thymomas were detected, Tg animals displayed a vascular disease predominant in the liver. We reasoned that NEC signaling may have an effect on neoplastic formation when challenged with tumor cells. Our results show an altered primary tumor microenvironment in Tg mice inoculated with syngeneic breast tumor cells, marked by a disrupted microvasculature, increased vascular permeability and increased necrosis. Importantly, pulmonary metastasis is highly elevated in Tg animals, with an observed increase in tumor cell intravasation into the circulation. We report that NEC inhibits CBF-dependent Notch signaling, and acts in a paracrine manner to promote the observed increase in metastasis. Isolation and re-inoculation of primary tumor-derived cells from Tg tumors into wild-type hosts showed that these cells have a higher propensity to metastasize, indicating a NEC-mediated reprogramming of tumor cells. We performed a genome-wide microarray expression analysis comparing Tg-derived tumor cells versus those derived from wild-type tumors, and identified a list of candidate genes which may be implicated in the observed increase in metastatic potential of these cells. Moreover, we show an accumulation of CD11b+GR-1+ myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in the blood and primary tumors of Tg mice, suggesting a possible mechanism for NEC-mediated tumor cell dissemination.To investigate the role of NEC in T-cell development, we analyzed thymi of Tg mice. We show that CD4C/NEC mice display a thymic atrophy marked by a skewed thymocyte distribution, and that thymic development is partially blocked at the DN3 stage. Infection with Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV) reveals that in contrast to wild-type animals which develop thymomas, Tg animals display an almost complete thymic ablation. Interestingly, our in vitro data shows that NEC inhibits the infectivity of cells, suggesting an important role for Notch1 in retroviral infection. Additionally, preliminary results indicate that Tg mice display characteristics of a mild myeloproliferative disease. We observe a splenomegaly and an accumulation of MDSCs as well as Ter119+CD71+ immature erythroid cells in spleen and blood of Tg mice, confirming a distinct role for Notch signaling in myelopoiesis and erythropoiesis. The outcome of these studies is likely to provide important insights into the role of Notch1 in tumor microenvironment, metastasis, hematopoiesis and retrovirally-induced T-cell leukemia. A better understanding of the effects of NEC signaling will provide important insight into the long-term efficacy of Notch-targeting therapeutics for cancer treatment. / La voie de signalisation Notch1, qui est strictement régulée, joue un rôle important dans les décisions du destin cellulaire et l'homéostasie tissulaire. Son dérèglement a été impliqué dans la pathogénèse de plusieurs maladies, y compris les maladies hématopoïétiques et le cancer. Notre groupe avait préalablement identifié Notch1 comme étant un site commun d'insertion provirale dans les leucémie à cellules T induites par mutagénèse insertionnelle chez les souris transgéniques (Tg) MMTV/cmyc. Deux produits de transcription ont été identifiés dans cette étude: une forme constitutivement activée du domaine intracellulaire Notch1 (NIC), ainsi qu'une forme tronquée et sécrétée du domaine extracellulaire Notch1 (NEC). Alors que NIC a été mis en cause par plusieurs groupes dont le nôtre dans la transformation cellulaire et la formation de tumeurs, les rôles fonctionnels de NEC demeurent insaisissables. Afin d'étudier ces rôles, nous avions généré des souris Tg qui surexpriment la forme tronquée NEC sous le contrôle du promoteur CD4 humain. Quoique le développement de thymomes n'avait pas été détecté dans ces modèles, les animaux Tg présentaient une maladie vasculaire prédominante dans le foie. Nous avons pensé que NEC peut avoir un effet sur la formation néoplasique lorsque les souris sont inoculées avec des cellules tumorales. Nos résultats démontrent des changements au niveau du microenvironnement de la tumeur primaire chez les souris Tg inoculés avec des cellules tumorales mammaires syngéniques, tels qu'une microvascularisation perturbée, une augmentation de la perméabilité de la tumeur et une augmentation de la nécrose. Les métastases pulmonaires sont très élevées chez les animaux Tg, d'autant plus qu'une augmentation de l'intravasation des cellules tumorales dans la circulation a été observée. Nous rapportons que NEC inhibe la signalisation Notch dépendante de CBF, et agit d'une manière paracrine pour promouvoir l'augmentation des métastases. L'isolement et la ré-inoculation de cellules dérivées de la tumeur Tg primaire dans des hôtes de type sauvage ont démontré que ces cellules ont une plus grande propension aux métastases. Nous avons réalisé une analyse de l'expression génique par micropuces afin de comparer les cellules tumorales dérivées de souris Tg versus celles dérivées de souris de type sauvage, et nous avons identifié une liste de gènes candidats pouvant être impliqués dans l'augmentation du potentiel métastatique de ces cellules. Par ailleurs, nous démontrons une accumulation de cellules myéloïdes suppressives (MDSC) dans le sang et dans les tumeurs primaires de souris Tg, ce qui suggère un mécanisme possible pour la dissémination des cellules tumorales médiée par NEC. Pour étudier le rôle de NEC dans le développement des cellules T, nous avons examiné le thymus des souris Tg. Nous rapportons que les souris CD4C/NEC démontrent une atrophie thymique marquée par une distribution asymétrique des thymocytes, et que le développement des thymocytes est partiellement bloqué au stade DN3. L'infection par le virus de la leucémie murine Moloney (MoMLV) révèle que, contrairement aux animaux de type sauvage chez lesquels se développent des thymomes, les animaux Tg affichent une ablation presque complète du thymus. Nos données in vitro indiquent que NEC inhibe l'infection des cellules, suggérant un rôle important pour Notch1 dans l'infection rétrovirale. En outre, les résultats préliminaires indiquent que les souris Tg présentent des caractéristiques d'une légère maladie myéloproliférative. Les résultats de ces travaux fournissent d'importantes informations quant au rôle de Notch1 dans le microenvironnement tumoral, les métastases, l'hématopoïèse et la leucémie des cellules T induite par les rétrovirus. Une meilleure compréhension des effets de la signalisation NEC sera essentielle afin d'évaluer l'efficacité à long terme du ciblage thérapeutique de Notch pour le traitement du cancer.

Histone deacetylase inhibitors (HDI) have shown promising antitumor activity in preclinical and clinical studies for a broad range of hematological and solid malignancies. Nonetheless, the percentage of patients in any given malignancy who experience a meaningful clinical response remains small. While initial studies with HDIs focused on utilizing these agents to re-sensitize leukemic cells to differentiating stimuli, recent studies have shown HDIs to display significant cytotoxic activity in malignant cells by a number of different mechanisms. One proposed mechanism is the accumulation of DNA damage after HDI treatment, resulting in apoptosis. HDI-induced DNA damage accumulation is thought to occur through the induction of reactive oxygen species (ROS), and disruption of chromatin organization and DNA repair pathways.The proposed mechanisms by which HDIs induce DNA damage suggest HDIs would be a rational combination therapy with DNA damaging stimuli or more effective in malignancies sensitive to DNA damage. Indeed, many groups have shown that HDIs can sensitize cancer cells to DNA damaging stimuli like gamma irradiation. The aim of the work presented in this thesis was to first characterize HDI-induced ROS and DNA damage in leukemia cells. Finally, we sought to investigate the efficacy of HDIs in DNA repair deficient leukemias in order to define malignancies that may respond best to HDI-based therapies. We demonstrate that clinically achievable doses of the HDI vorinostat induce DNA double strand breaks (DSBs) and oxidative damage in acute myeloid leukemia (AML) cells. Vorinostat-induced DNA damage is followed by a G2-M arrest and eventually apoptosis. We also found the accumulation of DNA damage to coincide with an accumulation of ROS and the oxidative stress marker HO-1. Furthermore, pre-treatment with the antioxidant N-acetyl-cysteine (NAC) reduced vorinostat-induced DNA DSB breaks, G2-M arrest and apoptosis. Next, we investigated HDI efficacy in AML cells expressing the leukemia associated fusion proteins (LAFPs) PLZF-RARɑ, PML-RARɑ and AML1-ETO. Expression of these LAFPs has been correlated with a DNA repair deficient phenotype. We found that expression of LAFPs resulted in an increased sensitivity to vorinostat induced DNA damage and apoptosis. This correlated with an enhanced induction of the cell cycle regulators (CDKN2D) p19INK4D and (CDKN1A) p21WAF1, and a greater G2-M cell cycle arrest by vorinostat in LAFP expressing cells. The combination of LAFP and vorinostat also led to a greater down-regulation of several base excision repair (BER) enzymes, representing potential biomarker candidates for HDI-induced DNA damage. Importantly, repair of vorinostat-induced DNA DSBs was impaired in PLZF-RARɑ expressing cells, suggesting a mechanism by which LAFP expression and HDI treatment cooperate to cause an enhanced accumulation of damaged DNA.The work presented in this thesis suggests that DNA damage is an important mechanism in HDI-induced growth arrest and apoptosis. Furthermore, our work suggests that LAFP-positive AMLs are more responsive to HDI-based treatments and the continued study of HDIs in this setting is warranted. / Les inhibiteurs de déacétylases d'histones (IHDs) ont montré une activité anti-tumorale prometteuse lors d'études précliniques et cliniques et ce, contre une large gamme de cancers hématologiques et solides. Cependant, le pourcentage de patients qui montrent une réaction clinique significative demeure faible. Alors que des études initiales sur les IHDs se sont focalisées sur l'utilisation de ces agents pour re-sensibiliser les cellules leucémiques à des stimuli de différentiation, des études récentes ont démontré que les IHDs ont une importante activité cytotoxique contre les cellules malignes grâce à différents mécanismes. Un des mécanismes est l'accumulation de dommages au niveau de l'ADN suite à un traitement aux IHDs, conduisant à l'apoptose. Il est présumé que cette détérioration induite par les IHDs se produit par l'entremise de l'induction d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), de la perturbation de l'organisation de la chromatine et des mécanismes de réparation de l'ADN. Ce mécanisme, par lequel les IHDs provoquent l'altération de l'ADN laisse penser que les IHDs pourraient être intégrés dans des combinaisons thérapeutiques avec d'autres agents induisant des dommages à l'ADN, ou seraient plus efficace contre des cancers sensibles aux dommages à l'ADN. En effet, plusieurs groupes ont montré que les IHDs peuvent rendre les cellules cancéreuses sensibles aux stimuli causant des dégâts à l'ADN, tel que les rayons gamma. L'objectif de cette thèse est, de caractériser les dommages causés à l'ADN dans les cellules de leucémie myéloïde aiguë (LMA), provoqués par l'induction des ERO par l'entremise des IDHs. Nous avons étudié l'efficacité des IHDs dans les leucémies déficientes en terme de réparation des dommages à l'ADN, dans le but de décrire les caractériser les cancers qui réagissent le mieux aux thérapies à base d'IHDs. Nous démontrons ici que les doses cliniquement atteignables d'IHDs provoquent une rupture du double brin de l'ADN et des dommages oxydatifs dans des cellules de LMA. Les dommages de l'ADN provoqués par IHD sont suivis d'un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M, et éventuellement, d'une apoptose. Nous avons aussi découvert que les dommages à l'ADN coïncident avec l'accumulation des ERO et du marqueur de stress oxydatif HO-1. De plus, le prétraitement avec l'antioxydant N-acetyl-cysteine réduit les ruptures de brins d'ADN provoquées par IHD, l'arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M et l'apostose. Nous avons aussi étudié l'efficacité de vorinostat dans des cellules de leucémie myéloïde aiguë exprimant les proteines de fusion associées aux leucemies, (PFALs) PLZF-RARɑ, PML-RARɑ et AML1-ETO. La présence de ces PFALs a été corrélée avec le phénotype de déficience de réparation d'ADN. Nous avons découvert que la présence des PFALs a pour effet une sensibilité accrue aux dommages d'ADN et à l'apoptose induits par IHD. Nous montrons également une corrélation avec une induction accrue des régulateurs de cycles cellulaires CDKN2D et CDKN1A, ainsi qu'un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M induit par IHD plus important dans les cellules qui expriment les PFALs. En présence de PFALs, IHD conduit également à une plus grande diminution de l'expression de plusieurs enzymes de réparation par excision de base, représentant des candidats potentiels en tant que biomarqueurs des dommages de l'ADN provoqués par les IHD. La réparation des dommages aux doubles brins d'ADN se trouve être compromise dans les cellules qui expriment PFAL, laissant penser à un mécanisme ou PFALs et le traitement par IHD contribuent à provoquer une accumulation accrue d'ADN endommagé. Le travail présenté dans cette thèse soutient que les dommages causés à l'ADN représentent un mécanisme important contribuant à l'arrêt de la croissance induite par les IHD et à l'apoptose. En outre, nos recherches soutiennent que les LMA PFALs positives sont plus sensibles aux traitements à base d'IHD, ce qui justifie une recherche plus poussée sur les IHD.

Inositol phosphates (IPs) are signaling molecules implicated in a variety of cellular processes, notably, cell survival signaling and vesicular trafficking, which underlie diseases such as cancer and diabetes. The specific roles of many IPs in disease states have yet to be determined. Inositol phosphate kinases (IPKs) phosphorylate inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) on different positions of its inositol ring to yield an array of unique IPs. Control of IP production at different stages of the IP metabolic pathway could be used as an approach to determine the functional roles of each IP. In this thesis, we focus on inositol 1,3,4,5,6-pentakisphosphate 2-kinase (IPK1), which phosphorylates IP5 to IP6. These two IPs regulate apoptosis in vitro and in vivo, revealing a role for IPK1 in cell death, but their precise mechanisms of action remain unresolved. Our overall goal was to structurally and biochemically characterize IPK1 to identify how it selects its substrates, how it is regulated, and how it may be targeted with small molecules to be used as tools to study IPK1 function. We determined the IP-free crystal structure of IPK1, which revealed that the N-lobe of IPK1 is unstable in the absence of substrate. Based on this observation, we hypothesized that IPK1 uses a mechanism of IP-induced stabilization to select IP5 as its substrate: IP5 is initially recognized by IPK1 through the 4-, 5-, and 6-phosphates, and then, the 1- and 3-phosphates induce N-lobe stabilization, thereby allowing IPK1 activation only when the appropriate IP is bound. The key interaction between R130 and the 1-phosphate of the IP stabilizes the N-lobe for subsequent kinase activation. To validate our hypothesis, we evaluated the role of each IP phosphate for IP binding and kinase activation. We determined that the 5- and 6-phosphates were more important for IP binding, while the 1- and 3-phosphates were more important for IPK1 activation. Moreover, we demonstrated that IPs lacking the 1- or 3-phosphates were unable to stabilize IPK1 to the same extent as IP5, and that artificial stabilization of the N-lobe by engineered disulfide bonds altered IPK1 substrate specificity, by reducing the need for N-lobe interactions with substrate. We also characterized PKRnc and Catechin Gallate as leads for the development of small molecule inhibitors of IPK1. Taken together, our studies provide a basis for the development of selective inhibitors for IPK1 to investigate the roles of IPs that modulate apoptotic signaling pathways. Moreover, IP-induced stabilization distinguishes IPK1 from other IPKs and provides important considerations for the selective inhibition of each IPK. Uncovering the role of IPs in different cellular processes may ultimately lead to novel treatments for diseases whose underlying mechanisms are mediated by IP signaling. / Inositol phosphates (IPs) représentent une classe de molécules de signalisation qui sont impliqués dans différents processus cellulaires, en particulier dans la signalisation de la survie cellulaire et le trafic vésiculaire, qui sont la base des maladies telles que le cancer et le diabète. Les rôles spécifiques de plusieurs IPs dans des états pathologiques n'ont pas encore été déterminés. Inositol phosphates kinases (IPKs) catalysent la phosphorylation de inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) sur différentes positions de son cycle d'inositol pour créer de nouveaux IPs qui sont uniques. Le control de la production des IPs à différentes étapes de la voie métabolique des IPs pourrait être utilisé pour découvrir les rôles fonctionnels de chaque IP. Dans cette thèse, nous nous concentrons sur inositol 1,3,4,5,6-pentakisphosphate 2-kinase (IPK1), qui catalyse la formation de IP6 à partir de IP5. Ces deux IPs régulent l'apoptose in vitro et in vivo et dévoilent un rôle pour IPK1 dans la mort cellulaire, mais leurs mécanismes d'actions précises ne fut résolus. Notre objectif était de caractériser IPK1, en démontrant sa structure et sa biochimie, pour déterminer comment celle-ci choisit ses substrats, de quel façon il est réglementé, et comment il peut être ciblé pour étudier sa fonction cellulaire. Nous avons obtenu la structure cristallographique de IPK1 sans que IP soit présent, qui révéla que le N-lobe de IPK1 est deséquilibré dans l'absence de IP. D'après cette observation, nous avons supposé que IPK1 utilise un mécanisme de 'stabilisation induit par IP' pour sélectionner IP5 comme son substrat natif: Initialement, le 4-, 5-, et 6-phosphate de IP5 sont reconnus par IPK1, et par ensuite, le 1- et 3-phosphate de IP5 induisent la stabilisation du N-lobe, qui permit l'activation de IPK1 seulement quand le IP correspondant est attaché. L'interaction entre R130 et le 1-phosphate du IP stabilise le N-lobe pour l'activation de la kinase. Pour valider notre hypothèse, nous avons évalué le rôle de chaque phosphate du IP pour l'engagement de IPK1 et l'activation de IPK1. Nous démontrâmes que le 5- et 6-phosphate sont plus importants pour engager IPK1 tandis que le 1- et 3-phosphate sont plus importants pour l'activation de IPK1. De plus, nous avons démontré que les IPs qui manquent le 1- et 3-phosphate ont été incapable de stabiliser IPK1 dans la même mesure que IP5, et que la stabilisation artificielle du N-lobe a modifié la spécificité de substrat de IPK1, en réduisant la nécessité pour les interactions entre le N-lobe et le substrat. Nous avons également caractérisé PKRnc et Catechin Gallate comme des pistes pour le développement d'inhibiteurs pour IPK1. Nos études fournissent une base importante pour le développement d'inhibiteurs sélectifs pour IPK1 pour enquêter sur les rôles des IPs qui modulent les voies de signalisation apoptotiques. Pour ajouter, la 'stabilisation induit par IP' distingue IPK1 d'autres IPKs et fournit des considérations importantes pour l'inhibition sélective de chaque IPK. En découvrant les rôles des IPs dans différents processus cellulaires, on peut finalement conduire de nouveaux traitements pour les maladies dont les mécanismes sous-jacents sont médiés par la signalisation IP.

Oxidative stress, generated by excessive reactive oxygen species (ROS) and/or decrease in antioxidant defences, is associated with male infertility. A consequence of oxidative stress is the generation of excessive redox dependent protein modifications, such as tyrosine nitration (Nitro-Y) and S-glutathionylation (GSS-R). We hypothesize that excessive Nitro-Y and GSS-R levels impair sperm motility and capacitation (process by which sperm gain fertilizing ability). The aims of this study were to determine: 1) the effect of different ROS on motility, capacitation and the production of Nitro-Y and GSS-R in human spermatozoa and 2) the subcellular localization of Nitro-Y and GSS-R modified proteins. Percoll washed spermatozoa from healthy donors were incubated for 30 minutes at 37oC with increasing concentrations of either hydrogen peroxide (H2O2), tert−butyl hydroperoxide (tBHP), or DaNONOate (a nitric oxide (NO•) donor). Modified sperm proteins were analysed using SDS-PAGE immunoblotting and immunocytochemistry. Levels of GSS-R modified proteins increased dose dependently after exposure to H2O2 and tBHP (0.1 to 1 mM), and were localised mainly in the cytosolic and Triton-soluble fractions of the spermatozoa. Levels of Nitro-Y modified proteins increased dose dependently after exposure to DaNONOate (0.1 to 1 mM), and were mainly localized in the Triton-insoluble fraction. ROS-treated spermatozoa showed a dose dependent decrease of motility and had tyrosine phosphorylation and acrosome reaction levels similarly to that of non-capacitated spermatozoa following incubation under capacitating conditions. These results suggest that excessive Nitro-Y and GSS-R modified sperm proteins may be a culprit for the motility and fertilization failure observed in some conditions of male infertility.In the preparation of this thesis, I participated in the experimental design, performed all experiments and analyzed the resulting data. / Le stress oxidatif, causé par un excès des espèces réactives de l'oxygène et/ou une diminution de la capacité anti-oxydante, est associé à une infertilité masculine. Un des conséquence du stress oxydatif est la formation de modifications, telles que la nitration des tyrosine (Nitro-Y) ou la S-glutathionylation (GSS-R) de protéines pouvant être impliquées dans la balance réduction-oxydation. Notre hypothèse est que l'excès de Nitro-Y et GSS-R induit des anomalies de la motilité et de la capacitation des spermatozoïdes. Cette étude a donc pour but de 1- Déterminer les effets des espèces réactives de l'oxygène sur la motilité, la capacitation et la production de Nitro-Y et GSS-R dans le spermatozoïde humain; 2- Localiser les protéines ayant des Nitro-Y et/ou GSS-R dans le spermatozoïde humain. Des spermatozoïdes de donneurs sains, sélectionnés après gradient de Percoll ont été incubés 30 minutes à 37oC en présence de différentes concentrations de H2O2, tert−butyl hydroperoxide (tBHP) ou de Da-NONOate (un donneur de NO•). Les protéines modifiées sont analysées par immuno-buvardage (SDS-PAGE) et immunocytochimie. Nous avons montré une augmentation dose-dépendante des protéines associées au GSS-R en présence de H202 et de tBHP (0.1 to 1 mM). Ces protéines sont localisées dans le cytosol et la fraction soluble au triton du spermatozoïde. D'autre part, nous avons montré une augmentation dose-dépendante des protéines associées au Nitro-Y en présence de DaNONOate (0.1 to 1 mM). Ces protéines sont localisées dans la fraction insoluble au triton du spermatozoïde. De plus, en présence d'espèces réactives de l'oxygène, nous avons observé, une diminution de la motilité des spermatozoïdes et un niveau de réaction acrosomique et de phosphorylation des protéines similaires à des spermatozoïdes non capacités, même après induction de la capacitation. Nos résultats suggèrent qu'un excès de protéines ayant des Nitro-Yet GSS-R peuvent être à l' origine d'anomalies de la motilité et du pouvoir fécondant des spermatozoïdes chez certains hommes infertiles. Dans la préparation de cette thèse, j'ai participé à la conception expérimentale, réalisée toutes les expériences et analysé les données résultantes.

<p> In enterohemorrhagic <i>E. coli</i> (EHEC) sigma factor N (&sigma;^N) regulates glutamate-dependent acid resistance (GDAR) and the locus of enterocyte effacement (LEE), discrete genetic systems required for transmission and virulence of this intestinal pathogen. Regulation of these systems requires nitrogen regulatory protein C, NtrC, and is a consequence of NtrC/&sigma;^N-dependent reduction in the activity of sigma factor S (&sigma;^S). This study elucidates pathway components and stimuli for &sigma;^N-directed regulation of GDAR and the LEE in EHEC. Deletion of <i> fliZ,</i> the product of which reduces &sigma;^S activity, phenocopies <i>rpoN</i> (&sigma;^N) and <i> ntrC</i> null strains for GDAR and LEE control, acid resistance and adherence. Upregulation of <i>fliZ</i> by NtrC/&sigma;^N is indirect, requiring an intact flagellar regulator <i>flhDC</i>. Activation of <i>flhDC</i> by NtrC/&sigma;^N and FlhDC-dependent regulation of GDAR and the LEE is dependent on &sigma;^N-promoter <i>flhD</i>_P2, and a newly described NtrC upstream activator sequence. While the addition of ammonium significantly alters GDAR and LEE expression, acid resistance and adherence, it does so independently of <i>rpoN,</i> <i>ntrC</i> and the NtrC sensor kinase <i>ntrB</i>. Altering the availability of NtrC phosphodonor acetyl phosphate by growth without glucose, with acetate addition, or by deletion of acetate kinase, <i>ackA</i>, abrogates NtrC/&sigma;^N-dependent control of <i>flhDC,</i> <i>fliZ,</i> GDAR and LEE genes. </p>

<p> The sperm-mitochondria-associated cysteine-rich protein (SMCP) is a male germ cell-specific protein that localizes to the outer membranes of sperm mitochondria and increases sperm motility. The <i>Smcp</i> mRNA is transcribed in early spermatids, and stored in a translationally repressed state for ~7 days before translation is activated in late spermatids. Identifying the <i>cis</i>-elements and <i>trans</i>-factors that repress the <i>Smcp</i> mRNA in early spermatids is important because these factors and elements coordinate the translational activity of hundreds of mRNAs. </p><p> A mutation was studied in transgenic mice in which the 16 nucleotides downstream of the first poly(A) signal in the <i>Smcp</i> 3'UTR were replaced with the 17 nucleotides downstream of the poly(A) signal from the pEGFP plasmid 3'UTR. Replacing this sequence of the <i>Smcp</i> 3'UTR eliminates two elements that are conserved in many mammalian <i> Smcp</i> mRNAs. My research using the GFP reporter and analysis of polysomal loading demonstrates that the mutation eliminates repression of a <i> Smcp-Gfp</i> transgenic mRNA in early spermatids. </p><p> Studies in our lab demonstrate that Y-box protein 2 (YBX2) binds the 3' termini of the protamine 1 (<i>Prm1</i>) and <i>Smcp</i> 3'UTRs, which have been demonstrated with mutations in transgenic mice to be necessary for repression in early spermatids. My research demonstrates that depletion of YBX2 in <i>Ybx2</i>-null mice eliminates the translational repression of the <i>Smcp</i> and <i>Prm1</i> mRNAs in early spermatids. </p><p> The localization of the <i>Smcp</i> mRNA in spermatids was studied using RNA-fluorescent <i>in situ</i> hybridization (RNA-FISH). The <i>Smcp</i> mRNA probe detected a signal in a germ cell-specific granule called the chromatoid body. It has been speculated that the chromatoid body stores repressed mRNAs in early spermatids. My RNA-FISH studies reveal that translationally repressed and translationally active mRNAs are concentrated in the chromatoid body implying that localization is independent of translational activity. A probe for the <i>Smcp</i> intron also localized to the chromatoid body suggesting that the <i>Smcp</i> pre-mRNA may be spliced in the chromatoid body. This is the first demonstration with RNA-FISH that translationally active mRNAs and introns localize to the chromatoid body. This research has permitted the formulation of a speculative model of translational repression of the <i>Smcp</i> mRNA.</p>