The short isoforms of the CUX1 transcription factor have been implicated in various cancer-related processes in tissues culture experiments and were found to contribute to tumorigenicity in transgenic mice. In addition, CUX1 is over-expressed in many human cancers. The functions attributed so far to CUX1 stem from its activity as a transcription factor. However, it is possible that CUX1 plays a non-transcriptional role in the cell. Tandem affinity purification, followed by mass spectrometry, identified numerous binding partners of CUX1. The aim of my studies was to validate and further characterize the interactions of CUX1 with some of these proteins: REV1, PARP1 and Ku70/Ku80. REV1 is an error-prone DNA polymerase involved in translesion synthesis and is responsible for most point mutations in yeast and mammalian cells. We showed that the REV1-CUX1 interaction required the REV1 BRCT domain and was increased following irradiation. I have shown that CUX1 was phosphorylated following DNA damage. My results indicated that ATM phosphorylated CUX1 and that phosphorylation of CUX1 at serines 861, 868 and 1100 promoted its interaction with REV1. ChIP-on-chip experiments showed that REV1 preferentially localized to transcribed regions, that the recruitment increased after gamma-irradiation and that 12.9% of REV1 binding sites overlapped CUX1 binding sites. I have optimized and characterized two reporter assays for point mutations (GFPstop and ouabain resistance) and showed that point mutation frequency correlated, at least in part, with the ability of a promoter to recruit REV1. Reduction in REV1 expression led to a decrease in expression of numerous genes. We propose that the physiological purpose for REV1 recruitment to transcribed regions is to enable efficient transcription of actively transcribed genes, by preventing stalled replication forks from blocking the passage of the transcription machinery. Ku and PARP1 are sensors of DNA damage and promote DNA damage repair. I have validated the interaction of CUX1 with Ku and PARP1 and showed that expression of CUX1 fragments led to their displacement from known promoter targets. Using various experimental approaches, my results indicated that in addition to its transcriptional role, CUX1 might play a non-transcriptional role in the repair of strand breaks. / Le facteur de transcription CUX1, et plus particulièrement ses isoformes courtes, sont impliquées dans différents processus associés au développement cancéreux dans des expériences de culture de tissus et dans des modèles de souris transgéniques. De plus, CUX1 est sur-exprimé dans de nombreux cancers humains. Les fonctions attribuées jusqu'à présent à CUX1 sont associées à son activité transcriptionelle. Cependant, il est possible que CUX1 joue un rôle non-transcriptionel dans la cellule. La purification par affinité en tandem, couplée à la spectrométrie de masse, a permis d'identifier plusieurs partenaires d'interaction de CUX1. Le but de mes études a été de valider et caractériser les interactions de CUX1 avec certaines de ces protéines, plus précisément REV1, PARP1 et Ku70/Ku80. REV1 est une ADN polymérase de faible fidélité lors de la synthèse d'ADN impliqué dans le processus de synthèse à travers les lésions (translesion synthesis) et responsable de la plupart des mutations ponctuelles chez la levure, ainsi que chez les mammifères. Nous avons montré que l'interaction entre REV1 et CUX1 nécessitait le domaine BRCT de REV1 et que leur affinité respective augmentait suite à l'irradiation. J'ai montré que CUX1 était phosphorylé suite aux dommages à l'ADN. Mes résultats ont indiqué que ATM phosphorylait CUX1 et que les phosphorylations de CUX1 sur les serines 861, 868 et 1100 favorisaient son interaction avec REV1. Des expériences de localisation génomique par puce ont montré que REV1 était localisé de manière préférentielle dans des régions transcrites, que cette localisation augmentait suite à l'irradiation aux rayons gamma et que 12.9% des sites de localisation de REV1 se superposaient aux sites de localisation de CUX1.J'ai optimisé et j'ai caractérisé deux essais rapporteurs pour l'analyse des mutations ponctuelles (GFPstop et résistance à l'ouabain) et j'ai montré que la fréquence des mutations ponctuelles corrélait, en partie, avec la capacité des promoteurs à recruter REV1. Une réduction de l'expression de REV1 a induit la réduction de l'expression des nombreux gènes. Nous suggérons que le rôle physiologique du recrutement de REV1 au sein de régions génomiques transcrites est de permettre la transcription efficace des gènes transcrits activement, en prévenant le blocage du passage du complexe transcriptionel normalement induit par les fourches de réplication arrêtées à cause du dommage à l'ADN. Ku et PARP1 sont des détecteurs du dommage à l'ADN et stimulent la réparation de l'ADN. J'ai validé l'interaction de CUX1 avec Ku et PARP1 et j'ai montré que, suite à l'expression des fragments de CUX1, Ku et PARP1 ne se localisaient plus sur certaines de leurs cibles génomiques. En utilisant différentes approches expérimentales, mes résultats ont indiqué que, en plus de son rôle transcriptionel, CUX1 pourrait jouer un rôle non-transcriptionel dans la réparation des cassures de l'ADN.

CUX1 is a transcription factor implicated in the control of cell proliferation. Over-expression of CUX1 is observed in many human tumors and cancer cell lines. Cells constitutively over-expressing the p110 isoform of CUX1 proliferate faster and spend less time in G1 following quiescence. We studied three aspects of CUX1 function and regulation during the cell cycle. In the first part of this study we investigated how over-expression of p110 CUX1 results in a shortened G1. Using quantitative PCR we showed that over-expression of p110 CUX1 caused an increase in the transcription of DDK genes (cdc7 and Dbf4) upon exit from quiescence. Western blot analysis revealed that p110 CUX1 cells display elevated phosphorylation of MCM2 serine 5 (pS5-MCM2) during quiescence, indicating an increased activity of DDK. This was associated with a faster loading of MCM2 onto the chromatin after re-entry into the cell cycle and a shortening of G1 as shown by FACS. In a set of experiments, we investigated how the phosphorylation of CUX1 by cyclinD1-CDK4 contributes to cell cycle regulation. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) analysis revealed that phosphorylation of a recombinant CUX1 protein (1125-1505) by cyclinD1-CDK4 inhibited its DNA binding while PKA activated it. Another recombinant CUX1 protein (1125-1308), missing the C-terminal repression domains, is activated by cyclinD1-CDK4 and inhibited by PKA. Autoradiography and western blot analysis revealed that cyclinD1-CDK4 phosphorylates CUX1 on S1216 while PKA phosphorylates S1215 and S1216. FACS analyses showed that cells expressing mutant p110 CUX1S1215/1216A decrease in size with extended passages in culture and eventually die by apoptosis, indicating the importance of cyclinD1-CDK4 regulation in maintaining cell size. Thirdly, during mitosis CUX1 appears ~15kDa larger when observed by SDS-PAGE. We wanted to search for any large post translational modifications such as ubiquitin. No such modifications were identified, however, using mass spectrometry we demonstrated that during mitosis CUX1 is phosphorylated on at least twelve residues compared to six during G2. / CUX1 est un facteur de transcription impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire. La surexpression de CUX1 est observée dans de nombreuses tumeurs humaines et lignées de cellules cancéreuses. Les cellules qui surexpriment constitutivement l'isoforme p110 de CUX1 prolifèrent plus rapidement et passent moins de temps en G1 après quiescence. Nous avons étudié trois aspects de la régulation de CUX1 au cours du cycle cellulaire. Dans la première partie de cette étude, nous avons analysé le mécanisme par lequel la surexpression de p110 CUX1 conduit à une réduction dans la durée de la phase G1. En utilisant la méthode de PCR quantitative, nous avons montré que la surexpression de p110 CUX1 a augmenté la transcription de gènes DDK (Cdc7 et Dbf4) à la sortie de quiescence. L'analyse par immuno-buvardagea révélé que les cellules p110 CUX1 montrent une phosphorylation élevée de pS5-MCM2 pendant la quiescence, ce qui indique une augmentation de l'activité de DDK. Cette phosphorylation élevée est associée à un chargement plus rapide de MCM2 sur la chromatine après entrée dans le cycle cellulaire et un raccourcissement de la phase G1 tel que mesuré par FACS. Dans un deuxième projet, nous avons étudié l'effet de la phosphorylation de CUX1 par le complexe cyclin D1/CDK4 sur la régulation du cycle cellulaire. Des test de liaison à l'AND ont révélé que la phosphorylation d'une protéine recombinante CUX1 (1125-1505) par cyclinD1-CDK4 inhibeé sa liaison à l'ADN tandis que la PKA l'active. À l'inverse, une autre protéine recombinante CUX1 (1125-1308), qui ne contient pas les domaines répression en C-terminaux, est activée par cyclinD1-CDK4 et inhibée par la PKA. L'autoradiographie et l'analyse par immuno-buvardage ont révélé que cyclinD1-CDK4 phosphoryle la sérine 1216, alors que PKA phosphoryle sur les sérines 1215 et 1216. Les analyses par FACS ont montré que les cellules exprimant un mutant p110 CUX1S1215/1216A passent moins de temps en G1, deviennent progressivement plus petites et finissent par mourir par apoptose. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de CUX1 par le complexe cyclinD1-CDK4 sert à contrôler la taille des cellules. Finalement, au cours de la mitose, CUX1 semble ~ 15 kDa plus grands quand on l'observe par SDS-PAGE. Nous avons vérifié si cette différence de poids moléculaire résultait de modifications post-traductionnelles telles que l'ajout d'un peptide de la famille des ubiquitines. Aucune de ces modifications n'a été identifiée, mais en utilisant la spectrométrie de masse, nous avons démontré que, durant la mitose, CUX1 est phosphorylé sur au moins douze résidus par rapport à six au cours de G2.

The Hedgehog (Hh) signaling pathway is an essential and highly conserved pathway required for embryonic development and adult tissues homeostasis in both invertebrates and vertebrates. In humans, abnormal Hh signaling leads to numerous congenital diseases and deregulation of Hh signaling is associated with certain aspects of tumorigenesis. Therefore, a complete characterization of this pathway may help us to better understand the role of Hh signaling under physiological and pathological conditions. A key transducer of Hh signaling is Smoothened (Smo), a seven-pass transmembrane protein and distant member of the G-protein-coupled receptor (GPCR) family. In the absence of the secreted Hh protein, Smo is inhibited by another membrane protein, the Hh-receptor Patched (Ptc). Hh binding to Ptc releases this inhibition and triggers accumulation of Smo at the cell surface. Phosphorylation of Smo by Protein kinase A (PKA) and additional kinases allows Smo to adopt an active conformation, which turns the Hh signaling pathway on and ultimately allows the expression of Hh target genes. G-protein-coupled receptor kinases (GRKs) are known to phosphorylate active GPCRs and promote homologous desensitization of GPCR signaling. Smo is a functional GPCR in Drosophila and several recent studies suggest that GRKs participate in Hh signaling in both invertebrates and vertebrates. To address the role of GRKs in Drosophila Hh signaling, we analyzed flies mutant for gprk2, one of two GRKs in flies. Interestingly, gprk2 mutant flies display defects typical of impaired Hh signaling, suggesting that Gprk2 is required for transducing the Hh signal. Further studies, however, showed that Gprk2 also plays a negative role in Hh signaling by promoting Smo desensitization, which is consistent with typical GRK biology. To explain the dual and contradictory role of Gprk2 in Hh signaling, we hypothesized that heterotrimeric G-protein-dependent signaling may be affected in gprk2 mutants through misregulation of Smo and other GPCRs. Consistent with this idea we find that basal cAMP levels are abnormally low in gprk2 mutants. Cellular cAMP concentrations control the activity of PKA, the key activator of Smo. With genetic experiments, we confirmed that cAMP levels and PKA activity are limiting for Hh target gene expression in gprk2 mutants. In conclusion, our results suggest that Gprk2 regulates Hh signaling in two ways. On one hand, it limits Hh signaling by promoting homologous desensitization of Smo. On the other hand, it is also required to keep cellular cAMP concentrations in a physiological range that is required for normal Hh signaling. We speculate that the abnormally low cAMP levels in gprk2 mutants are not only caused by misregulation of Smo, but also by a more global misregulation of GPCR signaling, suggesting that Hh signalling is affected by signalling cross-talk. / La voie de signalisation Hedgehog (Hh) est une cascade de signalisation essentielle et hautement conservée, requise lors du développement embryonnaire et le maintien de l'homéostasie dans les tissus adultes, tant chez les invertébrés que chez les vertébrés. Chez l'homme, une signalisation anormale de cette voie de signalisation entraîne de nombreux défauts congénitaux, et est associée à certains aspects de la tumorigénèse. Ainsi, une caractérisation complète de cette cascade signalitique nous aiderait à mieux comprendre le rôle de Hh dans des conditions physiologiques et pathologiques. La protéine Smoothened (Smo) est une composante importante de la signalisation par Hh. Smo est composée de sept domaines transmembranaires et fait partie de la famille de "G-protein-coupled receptor" (GPCR). En absence de Hh, Smo est inhibée par la protéine membranaire "Hh-receptor Patched" (Ptc). La liaison de Hh à Ptc relâche l'inhibition qu'exerce cette dernière sur Smo, qui s'accumule alors à la surface de la cellule. La phosphorylation de Smo par la Protéine kinase A (PKA) ou d'autres kinases permet à Smo d'adopter sa conformation dite active, qui enclenche alors la cascade signalitique qui induit l'expression des gènes cibles de Hh.Il a été démontré que les protéines "G-protein-coupled receptor kinases" (GRKs) phosphorylent les GPCRs actives et promouvoient ainsi la désensibilisation à leur signalisation. De récentes études suggèrent que les GRKs participent à la signalisation par Hh chez les invertébrés et chez les vertébrés. Afin de mieux comprendre le role des GRKs dans la signalisation de Hh chez la drosophile, nous avons analysé des mouches mutantes pour gprk2, l'une des deux GRKs présentes dans ce modèle. Surprenament, les mouches mutantes pour gprk2 présentent des défauts qui sont typiques à la voie de signalisation Hh. Ceci suggère que Gprk2 est requise pour transmettre les signaux de signalisation en aval de Hh. Toutefois, de plus amples études ont révélées que Gprk2 régule aussi de façon negative cette voie de signalisation en induisant la désensibilisation à Smo. Afin d'expliquer les rôles contradictoires de Gprk2 dans la voie de signalisation Hh, nous avons émis l'hypothèse que les défauts de signalisation par les GPCRs observés chez les mouches mutantes pour gprk2 sont dûs à une mauvaise regulation de Smo et d'autres GPCRs. Ainsi, nous avons découvert que les niveaux basals d'AMPc sont anormalement bas chez les mutants de gprk2. Les concentrations intracellulaires d'AMPc régulent l'activité de la PKA, qui elle-même régule Smo. À l'aide d'expériences génétiques, nous avons confirmé que les bas niveaux d'AMPc et de l'activité de la PKA limitent l'expresssion des gènes cibles de Hh chez les mutants de gprk2. En conclusion, nous résultats suggèrent que Gprk2 régule la signalisaiton de Hh de deux façons distinctes. D'une part, elle régule la signalisation en amont de Hh en induisant la désensibilisation à Smo. D'autre part, Gprk2 est requise afin de maintenir les niveaux d'AMPc à des niveaux physiologiques, ce qui est nécessaire pour une signalisation normale de Hh. Nos résultats suggèrent que les niveaux anormalement faible d'AMPc chez les mutants de gprk2 ne sont pas dûs uniquement à une mauvaise regulation de Smo, mais à une mauvaise regulation plus globale de GPCRs en general. Ainsi, la signalisation par Hh semble être régulée par différentes boucles de rétroactivation.

Angiogenesis and inflammation are hallmarks of several pathologies including breast cancer. The angiopoietins and Tie receptors have emerge as alternative targets for therapeutical intervention due to their function as essential regulators of angiogenesis, vascular homeostasis and inflammation. Angiopoietin-1 (Ang-1), the main agonist of Tie-2 receptors, promotes vessel growth, inhibits inflammation and maintains vessel stability. Although important advances have been made in understanding the functions of Ang-1 in the vasculature the intracellular signaling pathways activated by Ang-1, as well as its role in breast cancer and inflammation, remain largely unexplored. Using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), we identified dual-specificity phosphatases (DUSPs) that negatively regulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways activated by Ang-1. Specifically we found that Ang-1 increased the expression (mRNA and Protein), as well as the activity of DUSP1, DUSP4 and DUSP5. Knocking down these phosphatases using siRNA revealed that DUSP1 mainly inactivates p38, DUSP4 dephosphorylates ERK1/2, p38 and SAPK/JNK, and DUSP5 is ERK-specific. Furthermore DUSP1, DUSP4 and DUSP5 had distinct functions in Ang-1-dependent survival and migration of endothelial cells (ECs).Because of the importance of angiogenesis in tumor progression, we then investigated the influence of estradiol (E2) on the expression of angiopoietins in breast cancer cell lines. We found Ang-1 mRNA and protein expressions to be lower in estrogen receptor (ERα) positive cells than in ERα negative cells. Additionally, we observed that both tumor size and Ang-1 production were reduced in ERα+ cell-derived xenografts in mouse mammary pads when compared to those derived from ERα- cells; and this effect was inhibited when the mice were ovariectomized. Since a large portion of the genome is under the regulation of microRNAs (miRNAs), we hypothesized that Ang-1 induces the expression of miRNAs to protect the endothelium against E. Coli lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation. We found that treating HUVECs for 24h with Ang-1 reduced LPS-induced phosphorylation of p38 and SAPK/JNK, and the activation of nuclear factor kappa b (NF-B). Ang-1 also decreased the expression of pro-inflammatory cytokines, adhesion molecules and leukocyte adhesion in vitro. Our findings suggest that miR-146b-5p is induced by Ang-1 as a mechanism to control Toll-like receptor (TLR) 4 signaling and the expression of pro-inflammatory mediators by targeting the signaling proteins interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK1) and TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6). We conclude that Ang-1 induces the expression of DUSP1, DUSP4 and DUSP5 to coordinate its anti-apoptotic and migratory response. Ang-1 is also an important modulator of growth and progression of ERα- breast cancers. Finally, Ang-1 treatment antagonizes pro-inflammatory pathways activated by LPS through the induction of miR-146b-5p which targets the TLR signaling proteins IRAK1 and TRAF6. / L'angiogenèse et l'inflammation sont caractéristiques de plusieurs pathologies, dont le cancer du sein. Les angiopoiétines et les récepteurs Tie ont émergé comme cibles d'intervention thérapeutique alternatives en raison de leur fonction de régulateurs essentiels de l'angiogenèse, de l'homéostasie vasculaire et de l'inflammation. L'angiopoiétine-1 (Ang-1), l'agoniste principal du récepteur Tie-2, favorise la croissance des vaisseaux, inhibe l'inflammation et maintient la stabilité vasculaire. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des fonctions d'Ang-1 dans le système vasculaire, les voies de signalisation intracellulaires activées par Ang-1 ainsi que son rôle dans le cancer du sein et l'inflammation sont largement inexplorées.Utilisant des cellules endothéliales de veine ombilicale (CEVOH), nous avons identifié des phosphatases à double spécificité (DSPs) qui régulent négativement les voies de signalisation des protéines kinase activée par mitogènes (MAPKs) activées par Ang-1. Plus précisément nous avons trouvé que l'Ang-1 a induit l'ARNm, l'expression des protéines et l'activité de DSP1, DSP4 et DSP5. Réduire l'expression de ces phosphatases à l'aide de ARNi a révélé que DSP1 inactive principalement p38, DSP4 déphosphoryle ERK1/2, p38 et SAPK/JNK et DSP5 est spécifique pour ERK. En outre DSP1, DSP4 et DSP5 possèdent des fonctions distinctes pour la régulation de la migration, la survie, la formation de tube capillaire et la perméabilité vasculaire dépendante d'Ang-1.En raison de l'importance de l'angiogenèse dans la progression tumorale, nous avons ensuite étudié l'influence de l'estradiol (E2) sur l'expression des angiopoiétines dans des lignées cellulaires du cancer du sein. Nous avons trouvé que le niveau de transcrits d'ARNm ainsi que l'expression protéique d'Ang-1 étaient réduits dans cellules positives pour les récepteurs des œstrogènes (ER) par comparison aux cellules négatives pour ER. En outre, nous avons observé que la taille de la tumeur et la production d'Ang-1 étaient réduits dans de xénogreffes de tissu mammaire chez la souris dérivés de cellules ER+, par rapport à ceux issus de cellules ER. De plus cet effet est inhibé lorsque les souris sont ovariectomisées.Comme une grande partie du génome est sous le contrôle des microARNs (miARN), nous avons émis l'hypothèse que l'Ang-1 induit l'expression des miARNs pour protéger l'endothélium contre l'inflammation induite par le lipopolysaccharide (LPS) d'E. Coli. Nous avons constaté que le traitement de CEVOH pendant 24 heures avec Ang-1 réduit la phosphorylation de p38 et SAPK/JNK, ainsi que l'activation du facteur nucléaire kappa B (NF-B) induite par le LPS. Ang-1 a également diminué l'expression de cytokines pro-inflammatoires, des molécules d'adhésion et l'adhérence des leucocytes in vitro. Nos résultats suggèrent que miR-146b-5p est induit par l'Ang-1 comme un mécanisme pour le contrôle de la signalisation des récepteurs de type toll (TLR) et l'expression de médiateurs pro-inflammatoires, en ciblant les protéines de signalisation IRAK1 et TRAF6.Nous concluons que l'Ang-1 induit l'expression de DSP1, DSP4 et DSP5 à fin de coordonner son action anti-apoptotique et sa réponse migratoire et angiogénique. Ang-1 est également un modulateur important de la croissance et de la progression des cancers du sein ER-. Enfin, le traitement avec Ang-1 antagonise les voies de signalisation pro-inflammatoires par l'induction de l'expression de miR-146-5p, qui cible des protéines de la voie de signalisation TLR: IRAK1 et TRAF6.

The ability to sense and respond to fluctuating environmental conditions is a conserved and essential feature of all living organisms. Cellular stress responses sense and transmit the demands of specific stressors to appropriate homeostatic effectors, which can then implement appropriate cellular adaptation mechanisms. This study examines two distinct and highly conserved eukaryotic signaling responses that are implemented in response to unfolded protein in the endoplasmic reticulum, a situation known as ER stress. We find that Schizosaccharomyces pombe calnexin (Cnx1p) is regulated by phosphorylation at a conserved serine residue in its cytoplasmic tail. Our analysis of Cnx1p-S553 phosphomutants suggests that this post-translational modification regulates the association of calnexin with ER membrane-bound ribosomes. We also find that this regulation of Cnx1p is important for cell size control and ER stress tolerance. Next, we identify and characterize a number of novel small-molecule inhibitors of the Ire1-dependent ER homeostatic mechanisms in Saccharomyces cerevisiae. We extend these findings beyond this yeast model by showing that one of these small-molecules also inhibits Ire1 signaling in mammalian cells. This compound, designated UPRM8, was used as a chemical probe to study the importance of Ire1-dependent ER homeostatic responses in constitutively ER-stressed multiple myeloma cells. UPRM8 elicited an apoptotic cell death in RPMI-8226 multiple myeloma cells due to its impairment of cytoprotective, Ire1-dependent ER homeostatic mechanisms. Lastly, this study also examines the roles of a cell polarity scaffold protein, called Bem1p, in the responses to pheromone and cell wall stressors in Saccharomyces cerevisiae. A novel separation of function mutant of Bem1, called Bem1-s3, was identified and it revealed that the tandem SH3 domains of Bem1p are required for efficient pheromone signaling. Furthermore, we used mass spectrometry to identify novel Bem1p-interacting proteins and post-translational modifications. These novel physical interactions, as well as the phenotypes of Bem1 null and phosphomutants, suggested a novel role for Bem1p in the adaptive response to cell wall stressors. In summary, this thesis describes stress signaling mechanisms and some methods of manipulating them in order to exert control over cell fate. / La capacité à percevoir et à répondre aux fluctuations des conditions de l'environnement est une caractéristique essentielle et conservée chez tous les organismes vivants. Les réponses aux stress cellulaires sont sensibles aux exigences de facteurs de stress spécifiques qu'elles transmettent à des effecteurs homéostatiques appropriés, et qui à leur tour induisent des mécanismes cellulaires d'adaptation. Cette étude examine deux réponses distinctes et hautement conservées qui sont mises en oeuvre en réaction à la présence de protéines incorrectement repliées dans le Réticulum Endoplasmique (RE), une situation appelée "stress réticulo-endoplasmique". Nous avons démontré que la calnexin (Cnx1p) de Schizosaccharomyces pombe est régulée par la phosphorylation d'un résidu sérine conservé et localisé à l'extrémité cytoplasmique de la protéine. Notre analyse du phospho-mutant Cnx1p-S553 suggère que cette modification post-traductionnelle régule l'association de la calnexine aux ribosomes liés à la membrane du RE. Nous avons également constaté que la régulation de la phosphorylation de la calnexine est importante pour le contrôle de la dimension cellulaire et la tolérance au stress réticulo-endoplasmique. Ensuite, nous avons identifié et caractérisé un certains nombre de nouvelles petites molécules qui sont des inhibiteurs des mécanismes d'homéostasie du RE dépendant d'Ire-1 chez Saccharomyces cerevisiae. Ces résultats ont été étendu au-delà du modèle de la levure, en montrant que l'une de ces petites molécules inhibe également la voie de signalisation d'Ire-1 chez des cellules de mammifères. Ce composé, désigné par UPRM8, a été utilisé comme test chimique pour étudier l'importance de la réponse homéostatique au stress réticulo-endoplasmique constitutivement présent chez les cellules de myélomes multiples. UPRM8 induit une apoptose chez les cellules de myélomes multiples RPMI-8226 en empêchant les mécanismes cyto-protectifs dépendants d'Ire-1. Finalement, cette étude a également examiné les rôles d'une protéine impliquée dans la polarité cellulaire, appelée Bem1p, dans la réponse à une phéromone et à un facteur de stress de la paroi cellulaire chez Saccharomyces cerevisiae. Un nouveau mutant de Bem1, nommé Bem1-s3, a été identifié et a révélé que les domaines SH3 en tandem de Bem1p sont requis pour une signalisation efficace des phéromones. De plus, nous avons utilisé la spectrométrie de masse pour identifier de nouvelles protéines qui interagissent avec Bem1p ainsi que des modifications post-traductionnelles. Ces nouvelles interactions ainsi que les phénotypes des mutants Bem1 et Bem1p ont suggéré un nouveau rôle pour Bem1p dans la réponse adaptative à des facteurs de stress de la paroi cellulaire. En résumé, cette thèse décrit des mécanismes de signalisation du stress et des moyens mises en œuvre par la cellule afin de composer avec les facteurs de stress et d'exercer un contrôle sur son devenir.

A 186-bp fragment of ors8, a mammalian DNA replication origin, was previously identified as the minimal sequence required for origin function in vivo and in vitro. The 186-bp origin contains, among other features, an octamer motif, serving as the binding site for the transcription factor Oct-1, and an A3/4-homologous region, serving as the binding site for the origin binding protein, OBA. The research objective of this thesis is to investigate the role of Oct-1 and OBA in mammalian in vitro DNA replication. / Depletion of the Oct-1 protein inhibited in vitro DNA replication to basal levels. The inhibition was partially reversed upon the exogenous addition of Oct-1 POU protein. Site-directed mutagenesis of the octamer motif in the origin resulted in a mutant clone that lacked Oct-1 binding but replicated efficiently. The results suggest that Oct-1 is an enhancing component in DNA replication but its effect is not caused through direct DNA binding, but rather through protein-protein interactions. / OBA was purified from HeLa cells through its ability to interact with the 186-bp origin. OBA binds to A3/4, a 36-bp mammalian origin sequence. The DNA binding subunit of OBA is identical to the 86 kDa subunit of Ku antigen. Depletion of OBA/Ku, by inclusion of anti-Ku antibodies to the in vitro replication reaction of p186, inhibited DNA replication. Furthermore, addition of the A3/4 oligonucleotide to the replication reaction of mammalian origin-containing plasmids (p186, pors12, and pX24) inhibited replication. This inhibition was reversed upon addition of OBA. In contrast, SV40 in vitro replication remained unaffected. OBA also possessed DNA helicase activity. By co-immunoprecipitation analyses, OBA was found to associate with DNA polymerases delta and epsilon, PCNA, topoisomerase II, RF-C, RP-A, DNA-PKcs, and Oct-1. / The replication activity of xrs-5, a derivative of Chinese hamster ovary (CHO) K1 cell line defective in Ku86, was also examined. Total and cytoplasmic extracts from xrs-5 cells replicated p186 DNA as efficiently as CHO K1 extracts. In contrast, xrs-5 nuclear cell extracts lacked DNA replication activity, which was restored upon addition of OBA. / The data implicate OBA/Ku in a direct role in the initiation of mammalian DNA replication as an origin-specific binding protein with helicase activity. The physical association of OBA/Ku with Oct-1 and the replication machinery reveals a possible mechanism by which these proteins are recruited to DNA replication origins. A cytoplasmic Ku-like origin-specific binding protein likely compensates for the absence of the endogenous OBA/Ku in xrs -5 cells. / These studies provide a better understanding of the proteins that bind to mammalian origins, thereby aiding in understanding the mechanisms that regulate the initiation of DNA replication.

The follicle stimulating hormone receptor (FSHR) is an essential G-protein-coupled receptor expressed in granulosa cells of the ovary and Sertoli cells of the testis. Upon hormone binding, the FSHR activates G-proteins, initiates gonadotropin signals and triggers granulosa cells and oocyte or Sertoli cells and germ cells communication that is required for gonadal development and maturation. This hormone signaling also participates in the biosynthesis of progesterone and estradiol in females and testosterone in males. The expression of FSHR reaches higher levels in mature follicles and in stages XIII-I of the seminiferous epithelial cycle. Little is known on the mechanisms by which cell- and stage-specific expression of FSHR is regulated. In the present studies, we have characterized four cis-elements in an ovine FSHR (oFSHR) promoter, and identified the corresponding DNA binding proteins. The first cis-element at +32 to +54 of the proximal oFSHR promoter was characterized as an E-box overlapping an orphan receptor response element (ORRE) to which upstream stimulatory factors (USFs) and chicken ovalbumin upstream promoter transcription factors (COUP-TFs) can compete for their binding. The second element was mapped at -46 to -67 as a CACC box that Krupple-like transcription factors recognize. The third cis-element at -117 to -197 was found to be a composite activator protein-1 (AP-1) binding site embedding an E-box and an ORRE that a group of proteins including AP-1, steroidogenic factor-1 (SF-1) and COUP-TFs can competitively occupy depending on their availability and activity. The fourth element from -284 to -303 was identified as a composite retinoic acid response element (RARE) that is recognized by retinoic acid receptors (RARs) and SF-1. Functional studies revealed that USFs, AP-1 and SF-1 were activators whereas COUP-TFs and RARs were repressors in the presence of retinoic acid (RA). Our data suggest a mechanism by which activators and repressors compete for

While replication origins, cis-acting sequences directing the initiation of DNA synthesis, have been well-characterized in many model organisms, the multiple sequence and protein components present at the chromosomal origins of higher eukaryotic organisms have not yet been fully defined. Genetic assays that identify origin function in cloned DNA fragments would provide a useful approach for the isolation and analysis of mammalian DNA replication origins. / In this thesis, (1) cloned fragments from a known mammalian origin, the ori$ beta$ of the hamster 3$ sp prime$ DHFR region, are demonstrated to replicate autonomously, both following transfection into human cells, and when used as templates in an in vitro replication system based on human cell extracts; (2) larger scale versions of these two assay methodologies are used to isolate over 40 novel putative origins of DNA replication from anticruciform purified human genomic DNA libraries; (3) transfection and in vitro autonomous replication assays are applied to demonstrate the potential origin function of a mitochondrial DNA sequence implicated in the insertional mutagenesis of a human genomic locus; (4) an origin mapping strategy based on the in vitro assay is used to provide evidence for the existence of a replication origin in a cloned and sequenced portion of the human 15q11q13 chromosomal subdomain, a region associated with allele-specific replication timing, genomic imprinting, and genetic disease; and (5) some of these autonomously replicating origins are cloned into a selectable YAC vector and are shown to permit the long term episomal maintenance, in human cells, of the transfected plasmid constructs. / These results consistently demonstrate that short mammalian genomic DNA fragments can replicate autonomously, supporting the applicability of the replicon model in humans, and could be extended to the search for an origin core consensus element, to the investigation of higher order organization and temporal control of human DNA replication origins, and to the construction of a complete human artificial chromosome.

The response of target cells to the polypeptide hormone, prolactin, is initiated by the inaction of the hormone with a cell surface receptor that belongs to the class of receptors with a single membrane-spanning domain, designated as the cytokine/GH/PRL receptor family. The mechanism of signal transduction for this family of receptors is not yet determined. Cloning and functional analysis of different forms of the prolactin receptor (PRL-R) were carried out to elucidate the mechanism of signal transduction. The protein sequence deduced from cDNAs isolated from a rat ovarian cDNA library revealed the existence of a long form of the PRL-R in the rat. The mature form has a predicted size of 591 amino acids and shows strong overall sequence similarity with previously cloned long forms of the PRL-R from other species. Another form of the PRL-R was characterized in Nb$ sb2$ cells, a rat lymphoma cell line, dependent on PRL for mitogenesis. This receptor is a deleted form of the long form of the PRL-R missing 198 amino acids in the cytoplasmic domain. The ability of the different forms of the PRL-R to transmit a lactogenic signal was tested in functional systems. The systems consisted of the transient co-transfection of chinese hamster ovary (CHO) cells with a fusion gene containing a milk protein gene promoter linked to the chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene coding region and an expression vector containing various forms of PRL-R cDNAs under the control of the SV-40 early promoter. CAT activity was measured three days after transfection. Results indicate that the long form of the PRL-R is capable of transmitting PRL's signal and activating the milk protein gene promoter. However, when the short form of the receptor was transfected, there was no induction of CAT activity. Interestingly, the Nb$ sb2$ form of the PRL-R was fully capable of transmitting PRL's signal, when examined in the above functional system. This implies that the 198 amino acids segment of t

lck is a member of the src family of tyrosine protein kinase genes expressed predominantly in T-lymphocytes. Its product, p56$ sp{ rm lck}$ is physically and functionally associated with the CD4 and CD8 T-cell surface antigens, suggesting a possible role in CD4/CD8-mediated tyrosine phosphorylation signals during the process of antigen stimulation. Activation of p56$ sp{ rm lck}$ by mutation of tyrosine 505 was prevented by further mutation of either the site of autophosphorylation, tyrosine 394 to phenylalanine, or the site of myristylation, glycine 2 to alanine, as determined by the effects of overexpression of these p56$ sp{ rm lck}$ mutants in rodent fibroblasts. The role of activation of p56$ sp{ rm lck}$ in T-cells was examined by overexpression of the tyrosine 505-to-phenylalanine mutant in a CD4-negative, MHC-class II restricted T-cell hybridoma. The enhancement of T-cell responsiveness observed with expression of activated Lck was qualitatively similar to the effect of expression of CD4 in these cells, providing evidence that p56$ sp{ rm lck}$ positively regulates T-cell functions and that it mediates some of the functions of CD4 and CD8 during antigen stimulation.