Introduction. Recent lines of evidence suggest that retinoids1,2 and RARbeta23 may have both beneficial and harmful effects in cancer. Little is known regarding the specifics of RARbeta2 promoter silencing in cancer, or about the role that RARbeta2 plays in RARbeta2-expressing cancer cells. Objectives. To analyze the patterns and heritability of RARbeta2 promoter methylation in cancer and determine whether it is subject to allelic bias; and to analyze the effects of RARbeta2 knockdown on growth and mRNA expression profiles in cancer. Methods. RARbeta2 promoter methylation was analyzed in 20 parental cancer cell lines and 5 subcloned lines using bisulfate genomic sequencing (>150 sequencings); the proportion of methylated alleles was estimated using methylation-sensitive restriction enzyme digestion followed by PCR and single nucleotide polymorphism identification; 18 antisense oligonucleotides against RARbeta2 were tested in various cancer cell lines using RT-PCR, cell counting and annexin V staining; and gene expression profiles were compared following knockdown versus all trans retinoic acid (ATRA) stimulation using cDNA microarray technology (>14,000 genes), SOURCE and GOMINER databases. Results. Hypo- and hypermethylated alleles frequently co-exist in lines in which RARbeta2 is inactivated (5111, 45%); divergent methylation is heritable in the majority of subclones analyzed (618, 75%); and methylation is subject to allelic bias at a ratio of ~2:1 (3l3 CpG sites, 100%). Cellular proliferation is correlated with RARbeta2 expression levels (p=0.0003); the most effective oligo reduces cellular proliferation by up to 80% in cancer cell lines in which RARbeta2 expression has been retained (313, 100%), but has no apparent effects in lines in which it has been lost (313, 100%); reduction in cell growth following oligo treatment is at least partially due to activation of programmed cell death; and over a dozen pro-carcinogenesis genes are downr / 1Omenn GS, Goodman GE, Thornquist MO, Balmes J, Cullen MR, Glass A, et al. Risk factors for lung cancer and for intervention effects in CARET, the Beta-Carotene and Retinol Efficacy Trial. J Natl Cancer Inst 1996;88:15509. 2Anon., The effect of vitamin E and beta carotene on the incidence of lung cancer and other cancers in male smokers. The Alpha-Tocopherol, Beta Carotene Cancer Prevention Study Group. N Engl J Med 1994;330:1029-35. 3Khuri FR, Wu H, Lee JJ, Kemp BL, Lotan R, Lippman SM, et al. Cyclooxygenase-2 overexpression is a marker of poor prognosis in stage I non-small cell lung cancer. Olin Cancer Res 2001;7:861-7

Initiation is the rate-limiting step in the process of translation, which is a complex process that requires the participation of numerous translation initiation factors (eIFs). The poly (A)-binding protein (PABP) interacts simultaneously with the poly(A) tail of mRNAs and the scaffolding protein eIF4G to mediate mRNA circularization resulting in the stimulation of protein translation. PABP is regulated by the PABP-interacting protein, Paip1. Paip1 is thought to act as a translational activator in 5' cap dependent translation by interacting with PABP and the initiation factors eIF4A and eIF3. In this study, the X-ray crystal structure of the middle domain of Paip1 (MPaip1; spanning 157-371) has been determined to a 1.7 Å resolution, revealing a crescent-shaped domain consisting of ten alpha helices arranged as five α-HEAT repeats. I show that the interaction of full-length Paip1 with eIF4A is very weak, suggesting that it is merely a stabilizing interaction in the translation initiation complex. Binding analysis between MPaip1 and eIF4A utilizing pull-down experiments, isothermal titration calorimetry and surface plasmon resonance, show that unlike MIF4G (the middle of domain of eIF4G), MPaip1 does not bind eIF4A. This suggests that the weak interaction between Paip1 and eIF4A is mediated by residues upstream or downstream of the middle domain. / L'initiation est l'étape déterminante de vitesse de réaction dans la traduction, un processus complexe qui requiert la participation d'un grand nombre de facteurs d'initiation. PABP (la protéine qui se lie à la queue poly(A) de l'ARNm) interagit simultanément avec l'ARNm et la protéine d'échaffaudage eIF4G, ce qui déclenche la circularization de l'ARNm et stimule la synthèse de protéines. PABP est régulée par la protéine Paip1. Paip1 est suggérée être activatrice du processus de traduction medié par la coiffe 5' de l'ARNm, par son interaction avec PABP et les facteurs d'initiation eIF4A et eIF3. Dans cette étude, la structure du domaine du milieu de Paip1 (Mpaip1, comprenant 157-371) a été résolué à travers la cristallographie par rayons X, à une résolution de 1.7 Å. Cette structure a révélé un domaine en forme de croissant, contenant 10 hélices alpha formant cinq HEAT repeats. Je montre que l'interaction du domaine complet de Paip1 avec eIF4A est très faible, suggérant qu'elle constitute simplement une interaction stabilizante dans le complexe d'initiation de traduction. Une analyse de l'interaction entre Mpaip1 et eIF4A en utilisant des expériences de pull-down, ITC et SPR, montre qu'au contraire de MIF4G (le domaine du milieu de eIF4G), Mpaip1 ne se lie pas à eIF4A. Cela suggère que l'interaction faible entre Paip1 et eIF4A est médiée par des résidues en montée ou en aval du domain du milieu.

Recent work published from our lab showed that modulation of the dynein motor complex affected HIV-1 viral production but not viral infectivity and that trafficking of viral components played an important role in assembly. It was further demonstrated that viral genomic RNA and the HIV-1 structural protein pr55Gag co-localized on LAMP-1 - a transmembrane glycoprotein found on endosomal and lysosomal membranes - late endosomal vesicles. Using the Lumio™ dyes fluorescein arsenical helix binder (FlAsH) and resorufin arsenical helix binder (ReAsH) and TC-tagged Gag-TC and pNL4-3TC constructs, we show the localization of newly synthesized pr55Gag through dual biarsenical labeling in the perinuclear region of HeLa cells. By overexpressing the p50/dynamitin-HA and RILP-myc proteins, we also show the physical interaction of newly synthesized pr55Gag and LAMP-1 late endosomal membranes. / Les récents travaux de notre laboratoire ont montré que la modulation du complexe moteur dynein (Dynein motor complex) avait un impact sur la production virale du VIH-1 mais pas sur son infectivité. Ainsi, le trafic de composantes virales joue un rôle important dans l'assemblage du virus. De plus, l'ARN génomique viral et la protéine structurelle pr55Gag du VIH-1 sont co-localisés sur les vésicules d'endosome tardif portant le marqueur LAMP-1, une glycoprotéine transmembranaire que l'on retrouve sur les membranes endosomales et lysosomales. En utilisant les molécules fluorescentes Lumio™ fluorescein arsenical helix binder (FlAsH) et resorufin arsenical helix binder (ReAsH) et des construits viraux portant une étiquette TC (Gag-TC et pNL4-3-TC), nous montrons que l'emplacement de pr55Gag nouvellement synthétisé se trouve dans la région péri-nucléique de cellules HeLa. En sur-exprimant les protéines p50/dynamitin-HA et RILP-myc, nous montrons également l'interaction physique entre les protéines pr55Gag nouvellement synthétisées et les vésicules d'endosomes tardifs marqués par LAMP-1.

Plant cells are encased within a complex polysaccharide wall that not only strengthens the plant, but also has key roles in plant growth, cell differentiation, and defence. The plant cell wall is comprised of a network of cellulose microfibrils interconnected by hemicelluloses; this framework is embedded in a more soluble pectin matrix. This dynamic structure is under continual modification during plant growth and development, and its synthesis and modification requires the activity of a myriad of enzymes. Recent research has provided insight into how plants manufacture and regulate the cell wall during development, but much remains unknown. The mucilage secretory cells (MSCs) of Arabidopsis thaliana are used as a model to discover novel genes involved in the synthesis, secretion and modification of cell wall components, particularly pectin. These cells synthesize copious amounts of pectinaceous mucilage during development and, upon hydration of the desiccated seed, this mucilage rapidly swells, bursts from the MSCs and surrounds the seed in a gelatinous capsule. The patchy (pty)/beta-xylosidase1(bxl1) mutant has a peculiar phenotype where mucilage release is patchy and slow, and mutant seeds are delayed in germination. Cloning of the mutant locus revealed a lesion in an encoded bifunctional β-xylosidase/α-arabinofuranosidase. Chemical and immunological analyses indicate an increase in 1,5-linked arabinans, suggesting the action of AtBXL1 is required for the trimming of these chains to allow correct mucilage release. In addition to the study of AtBXL1, an enhancer/suppressor screen of the mum4 reduced mucilage mutant was performed in order to identify novel genes involved in mucilage secretory cell differentiation. The screen identified six novel mutants named mum enhancer (men) 1-6. Characterization of men mum4 double mutants revealed two distinct groups, those that produced similar amounts of mucilage to mum4 but failed to release it (men2, 6), and / Les cellules végétales sont encastrées dans une paroi de polysaccharide complexe qui non seulement renforce la plante mais aussi agit de façon cruciale dans les mécanismes de croissance, de différentiation cellulaire et de défense. La paroi des cellules végétales consiste en un réseau de microfibrilles de cellulose connectées par des hemicelluloses. Ce réseau est encastré dans une matrice de pectine plus solubilisable. Cette structure dynamique est en modification perpétuelle pendant le développement et la croissance de la plante. Ces changements et sa synthèse engage l'action d'une myriade d'enzymes. Des études récentes ont données de nouvelles perspectives sur comment les plantes produisent et régulent leur paroi cellulaire pendant le développement cependant beaucoup reste à découvrir. Les cellules sécréteuses de mucilage (MSCs) d'Arabidopsis thaliana sont utilisées comme modèles pour la découverte de nouveaux gène impliqués dans la synthèse, sécrétion et la modification des composants de la paroi cellulaire, particulièrement la pectine. Ces cellules synthétisent de grandes quantité de mucilage pectiné durant le développement et, après hydration de la graine disséquée, celui-ci gonfle rapidement, jaillit des MSCs entourant la graine d'une capsule gélatineuse. Le mutant patchy (pty)/beta-xylosidase1(bxl1) présente un phénotype particulier où le relargage est épars et lent, ces graines présentent aussi un retard dans la germination. Le clonage du locus muté a révélé une lésion dans la β-xylosidase/α-arabinofuranosidase bifonctionelle transcrite. Les analyses chimique et immunologique ont indiquées une augmentation des 1,5-linked arabinans suggérant que l'action de BXL1 est requise pour l'hydrolyse de ces chaines permettant un bon relargage du mucilage. En parallèle de cette étude, un screen des enhancers/suppresseurs du mutant au mucilage réduit mum4 dans l'intention d'identifier des nouveaux gènes imp

Post-translational modifications on histones play a major role in remodelling dynamic chromatin structures, in response to various cellular needs for gene activation or repression. Acetylation carried out by histone acetyltransferases (HATs) is one of the most extensively-studied histone modifications. The ATAC (Ada-Two-A Containing) complex is a multiprotein HAT complex. The complex is unique because it contains two acetyltransferases known as GCN5 and ATAC2, along with greater than 10 additional subunits. GCN5 is a mammalian orthologue of PCAF, and they are mutually exclusive in the human ATAC complex. Recent studies of this complex revealed intricate association among its components. It has been shown that different ATAC complexes contain different components and exhibit different substrate specificities. However, the regulatory mechanisms controlling ATAC activity and assembly are poorly understood. To gain insight into this and its functional consequences, I sought to study the activity of ATAC2, and to elucidate the contributions of each of the HAT enzymes in assembling the ATAC complex. From this work, each HAT domain of the acetyltransferases was shown to be responsible for the association with different subsets of ATAC components. And ATAC2 was discovered to bridge GCN5 and PCAF with other ATAC components. Therefore, acetyltransferase domains are not only important for acetyltransferase activity but also for complex assembly. Moreover, the HAT domain and the PHD domain of ATAC2 are both required for enzymatic activity. Additional preliminary data suggest that ATAC2 may affect the anchorage-independent proliferation of transformed cells. These findings not only reveal the essential roles of the HAT domains in the activity and assembly of the ATAC complex, but also open the possibility for ATAC complex regulation. / Le remodelage de la chromatine induit par l'ensemble de modifications post-traductionnelles d'histones joue un rôle important dans la régulation de l'expression génique. De ce fait, plusieurs études scientifiques ont examinées le mécanisme d'acétylation d'histones par les enzymes histone acetyltransferase (HAT). Le complexe multiprotéique ATAC (Ada-Two-A Containing) comprend deux enzymes HAT. D'après plusieurs études récentes, l'association des composantes de ce complexe est très élaborée. Différentes conformations de ce complexe contiennent une variété de combinaisons de sous-unités éprouvant des affinités enzymatiques distinctes envers certains substrats spécifiques. Ceci dit, l'ensemble des processus cellulaire qui gère la combinaison des sous-unités et l'activité enzymatique du complexe ATAC sont peu connus. De ce fait, afin d'élucider le rôle biologique des enzymes HAT par rapport à l'assemblage des composantes de ce complexe, j'ai étudié l'activité enzymatique de la sous-unité ATAC2. D'après mes résultats, l'acétylation des substrats d'ATAC2 dépend du domaine HAT de cet enzyme. Ainsi, les domaines HAT et PHD sont tous les deux indispensables à son activité enzymatique. De plus, ATAC2, GCN5 et PCAF s'associent avec divers sous-ensembles hétérogènes du complexe ATAC. Subséquemment, ATAC2 participe activement à l'événement de liaison entre GCN5, PCAF et les autres composantes du complexe. Les données supplémentaires préliminaires suggèrent qu'ATAC2 peut affecter l'anchorage-indépendant prolifération des cellules transformées. Les résultats de mon étude démontrent le rôle d'ATAC2 en ce qui concerne l'activité enzymatique et la formation du complexe ATAC, et ouvrent également la possibilité pour le règlement du complexe ATAC.

In most mammalian species, all oogonia cease mitotic proliferation and enter meiosis in fetal ovaries. Furthermore, more than half of the maximum number of germ cells is eliminated from ovaries by neonatal life, thus limiting the oocyte reserve for reproduction. The cause or mechanism of this female germ cell loss remains largely unknown. A major loss occurs in the oocytes which reach the pachytene stage of meiotic prophase, suggesting that oocytes with meiotic or recombination errors may be eliminated by a checkpoint mechanism. It remains to be determined whether oocytes are eliminated by apoptosis and if so in which pathway. The purpose of my study is to investigate a mechanism of oocyte loss in the mouse ovary during meiotic prophase. We used an Msh5 null mutant mouse strain, in which all oocytes are eliminated by neonatal life. Msh5 encodes a protein required for meiotic chromosome synapsis. / Msh5 heterozygous mutant mice were crossed and ovaries were isolated from female progeny at 14.5 – 22.5 days postcoitum (dpc). We studied the loss of germ cells in Msh5 -/- (MT) females comparing to the Msh5 +/+ (WT) and Msh5 (+/-) (HT) females by immunolabeling of ovarian sections for GCNA1 or MVH (both germ cell markers) or by counting GCNA1 positive germ cells in cell suspension preparations. Our results showed a continuous loss of GCNA1 positive cells in both MT and WT although the loss in MT was constantly larger than in the WT. A significant difference between WT and MT was found at 19.5 dpc. / Meiotic progression was studied by GCNA1 and SC (synaptonemal complex) or SC and ɣH2AX double immunolabeling of chromosome spread preparations. We found that meiosis in MT was blocked at zygotene-pachytene transition. No normal pachytene was observed in MT. / The role of apoptosis in elimination of oocytes during meiotic prophase was investigated by analyzing the cleavage of various caspases (caspase 2, 3, 6, 7, 9) as well as PARP1 by western blot using the lysate of whole ovaries. The activation of initiator caspase 9 increased from 17.5 to 18.5 dpc and decreased by 19.5 dpc. Caspase 2L activation also increased in a similar pattern but at much lower levels. The activation of effector caspase 3 or 6 remained at low levels. The activation of caspase 7 also was low but increased slightly at 19.5 dpc. The cleavage of PARP1 was high at all investigated stages. There were not major differences in the average level of activation between WT and MT. By immunolabeling of ovarian sections we observed that cleaved caspases and PARP1 were localized in oocytes but also in cells negative for GCNA1. / These results suggest that a mitochondrial pathway of apoptosis may play a role in the elimination of oocytes during meiotic prophase, involving activation of caspase 9 and cleavage of PARP1. However further studies are necessary for identification of an effector caspase. / Dans la plupart des espèces de mammifères, tous les oocytes cessent la prolifération mitotique et initialisent la méiose dans les ovaires fœtales. En outre, plus de la moitié du nombre maximal de cellules germinales est éliminée dans les ovaires pendant la vie néonatale, limitant ainsi la réserve d'oocytes pour la reproduction. La cause ou le mécanisme de cette perte de cellules germinales femelles reste largement inconnu. Une perte majeure se produit dans les oocytes qui atteignent le stade pachytène de la prophase méiotique, suggérant que les oocytes avec des erreurs dans la méiose ou des erreurs de recombinaison peuvent être éliminés par un mécanisme de contrôle. Il reste à déterminer si les oocytes sont éliminés par apoptose, et si oui, par quel méchanisme. Le but de mon projet est d'étudier un mécanisme de perte d'oocytes dans les ovaires de souris durant la prophase méiotique. Nous avons utilisé une souche de souris mutantes pour la gene Msh5, dans lequelles tous les oocytes sont éliminés durant la vie néonatale. Msh5 code pour une protéine nécessaire à la synapse de chromosomes méiotiques. / Des souris hétérozygote Msh5 ont été croisées et les ovaires ont été isolées de la progéniture féminine de 14,5 à 22,5 dpc. Nous avons étudié la perte de cellules germinales dans les ovaires des femelles Msh5 -/- (MT) en les comparant à ceux des femelles Msh5 +/+ (WT) et Msh5 +/- (HT) par immunodétection en utilisant des anticorps anti-GCNA1 et anti-MVH (marqueurs des cellules germinales) ou par le comptage des cellules positives au GCNA1 dans des suspensions cellulaires. Nos résultats montrent une perte continue de cellules positives au GCNA1 chez les souris MT et WT, bien que la perte chez les MT a été constamment supérieure à celle des WT (différence significative à 19.5 dpc). / La progression de la méiose a été étudiée par immunodétection double pour GCNA1 et SC (complexe synaptonémal) ou pour SC et γH2AX sur des préparations de chromosomes. Nous avons constaté que la méiose chez les souris MT est bloquée dans le stage de transition zygotène-pachytène. Nous n'avons pas observé de pachytène normal chez les souris MT. / Le rôle de l'apoptose dans l'élimination d'oocytes au cours de la prophase méiotique a été étudié par analyse du clivage de diverses caspases (caspases 2, 3, 6, 7, 9) ainsi que celui de la PARP1 par immunobuvardage des protéines d'ovaires entières lysées. L'activation de la caspase 9 initiatrice a augmenté entre 17.5dpc et 18.5 dpc et a ensuite baissé à 19.5 dpc. Celle de la caspase 2L a augmenté d'une manière semblable, mais à des niveaux beaucoup plus bas. L'activation des caspases effectrice 3 et 6 est demeurée à des niveaux faibles mais celle de la caspase 7 bien que faible a augmenté légèrement à 19.5 dpc. Le clivage de PARP1 était élevé dans tous les stages. Dans tous ces cas, il n'y a pas eu de grandes différences dans le niveau moyen d'activation entre WT et MT. Par immunodétection de sections d'ovaires, nous avons observé que les caspases et PARP1 clivées étaient localisées dans des oocytes, mais aussi dans les cellules sans marquage pour GCNA1. / Ces résultats indiquent que la voie mitochondriale de l'apoptose peut jouer un rôle dans l'élimination d'oocytes au cours de la prophase méiotique, puisque les clivages de la caspase 9 et de PARP1 y sont associés. Cependant des études supplémentaires sont nécessaires pour l'identification de caspases effectrices.

Telomerase synthesizes telomeric sequences and is minimally composed of a reverse transcriptase (RT) (TERT) and RNA (TR). We reconstituted heterologous mouse and human TERT-TR and chimeric mTERT-hTERT-hTR complexes in vitro and in immortalized human alternative lengthening of telomere (ALT) cells. Our data suggest that species-specific determinants of activity, processivity, and telomere function map not only to TR, but also to the TERT component. hTERT-hTR, but not heterologous TERT-TR complexes, nor chimeric mTERT-hTERT-hTR complexes, significantly reduced the percentage of chromosomes without telomeric signals in ALT cells. Moreover, heterologous and chimeric complexes were defective in recruitment to telomeres. Our results suggest a requirement for several hTERT domains and interaction with multiple proteins for proper recruitment of telomerase to the shortest telomeres in human ALT cells. The ability of hTERT to elongate short mouse telomeres, and the inability of mTERT to elongate short human telomeres suggest that mechanisms regulating recruitment and activity of hTERT at short telomeres may be less stringently regulated than mechanisms regulating mTERT recruitment and activity at short telomeres. Results such as these may lead to the design of better strategies for inhibiting telomerase and validation using rodent models. For example, TERT domains that confer similar functions in human and mouse cells may be better targets than domains with species-restricted functions. We also tested the specificity of a novel class of platinum(II) G-quadruplex stabilizers at inhibiting telomerase activity. We showed that these ligands efficiently stabilize telomeres and inhibit telomerase activity with comparable potency to telomestatin (a potent telomerase inhibitor). Additionally, these ligands may present a potent dual action strategy to not only inhibit telomerase function, but also disrupt telomere function and assembly. Accordingly, targeting telomere function / La télomérase synthétise les séquences télomériques et se compose minimalement d'une sous-unité transcriptase inverse (TERT) et d'un fragment d'ARN (TR). Nous avons reconstitué des complexes hétérologues TERT-TR humains et murins ainsi que des complexes chimériques mTERT-hTERT-hTR in vitro et dans des cellules immortalisées utilisant un mécanisme alternatif d'élongation des télomères (cellules ALT). Nos résultats suggèrent que les déterminants espèce-spécifiques de l'activité, la processivité et la fonction télomérique sont attribués non seulement au composant TR mais aussi au composant TERT de la télomérase. Les complexes hTERT-hTR, mais non les complexes hétérologues TERT-TR ou mTERT-hTERT-hTR ont diminué le pourcentage de chromosomes sans signal télomérique de façon significative lorsqu'exprimés dans des cellules ALT. De plus, il a été démontré que les complexes hétérologues et chimériques sont déficients quant à leur recrutement aux télomères. Nos résultats suggèrent que plusieurs domaines de TERT et la présence d'interactions entre plusieurs protéines sont requis pour le recrutement de la télomérase aux télomères les plus courts dans les cellules ALT. La capacité de hTERT à allonger les télomères murins les plus courts, et l'incapacité de mTERT à allonger les télomères humains les plus courts suggèrent que les mécanismes régulant le recrutement et l'activité de hTERT aux télomères les plus courts seraient régulés de façon moins rigoureuse que les mécanismes régulant ceux de mTERT. De tels résultats pourraient mener à la création de meilleures stratégies visant à inhiber la télomérase et la validation de celles-ci dans des modèles murins. Par exemple, les domaines de TERT qui confèrent des fonctions similaires dans les cellules humaines et murines risquent de représenter de meilleurs cibles thérapeutiques que les domaines de TERT possédant des fonctions espèce-spécifiques.$

In cancer progression, the development of metastases is characteristic of late stage disease and makes treatment and cure more difficult. In order for metastasis to occur, cancer cells must gain motile and invasive phenotypes. As one of the keystone proteins involved in cell motility and invasion, Focal Adhesion Kinase (FAK) has emerged as a good therapeutic target for the inhibition of metastases via targeted drug design and small molecule inhibitors. Accordingly, a small molecule inhibitor has recently been developed against FAK activation and signaling. However, drug resistance is common among targeted therapies. Development and classification of drug resistant cells elucidated the possible mechanism behind FAK inhibitor resistance such that second-line therapy drugs can be designed to overcome or avoid resistance. The overall data presented herein support the role of FAK as an important drug target in cancer metastasis as well as provide insight and direction for future FAK inhibitor design. / Dans la progression du cancer, le développement de métastases est caractéristique de la phase terminale et rend le traitement difficile. Afin que des métastases se dévelopment, les cellules cancéreuses doivent acquérir de la motilité ainsi qu'un phénotype invasif. Considéré come l'une des plus importantes protéines participant dans la motilité cellulaire, la prot éine Focal Adhesion Kinase (FAK) a émergé comme une bonne cible thérapeutique pour l'inhibition de métastases par la création de drogues ciblées et de petites molécules inhibitrices. Par conséquent, une molécule inhibitrice de l'activation de FAK et sa signalisation a été récemment développée. Cependant, J'ai demontré que la résistance est commune parmis ces drogues. Le dévelopement et la classification des clones de cellules résistantes ont permi d'élucider un mécanisme impiquant en partie une amplification de l'activité FAK; ce mécanisme permetter a de découvrir des analogues de deuxième génération pour surmonter ou éviter la résistance. L'ensemble de données présentées ci-dessous supportet le rôle de FAK comme une cible importante dans la prévention de métastases et exposent les futur directions pour contourner la résistance aux inhibiteurs de FAK.

Group II introns are a family of introns found in bacterial and organellar, but not in nuclear genomes. Many group II introns encode proteins termed maturases which are required for their splicing and retrotransposition. Recently four maturase-like proteins were identified in the Arabidopsis thaliana nuclear genome. The proteins encoded by these genes are termed nuclear maturases (NMATs). The four NMAT proteins are classified as NMAT1A, NMAT1B, NMAT2A, and NMAT2B. Nuclear maturases are predicted to have mitochondrial localization signals and a conserved X domain suggesting that these putative maturases are transported to organelles and may function in splicing of group II introns. My results indicate that NMAT1A, NMAT2A, and NMAT2B are all required for embryo viability. Analysis of mitochondrial transcripts from the mutant plants indicate that NMAT2A is necessary for efficient splicing of intron 1 of the nad2 gene, and that NMAT2A is necessary for efficient splicing of intron 1 of the nad5 gene. The results thus confirm the hypothesis that NMATs are required for the specific efficient splicing of mitochondrial transcripts. / Les introns du groupe II sont une famille d'introns trouvé dans les bactéries et organelles, mais non dans les génomes nucléaire. Beaucoup de ceux-ci codent pour des protéines appelées maturases qui sont requises pour l'épiçage et la retrotransposition. Récemment, quatre protéines maturase-like ont été trouvées dans le génome nucléaire d'Arabidopsis thaliana. Les protéines correspondantes à ces gènes ont été nommées maturases nucléaire (NMATs). Elles ont été classifiées NMAT1A, NMAT1B, NMAT2A, et NMAT2B. La prédiction d'un signal de localisation mitochondrial et d'un domaine X conservé suggèrent que ces protéines pourrais fonctionner dans l'épissage d'introns du group II. Mes résultats indiquent que NMAT1A, NMAT2A, et NMAT2B sont tous requis pour la viabilité embryonnique. L'analyse des transcrits mitochondriaux de ces plantes indiquent que NMAT2A est nécessaire pour un épissage efficace de l'intron 1 du gène nad2 et que NMAT2B est necessaire pour l'épissage de l'intron 1 du gène nad5. Les résultats confirment ainsi l'hypothèse que les NMATs sont requises pour un épissage efficace de transcrits mitochondriaux spécifiques.

The conjugation of ubiquitin to proteins is catalyzed sequentially by a cascade of members of three classes of enzymes – ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin conjugating enzyme (E2), and ubiquitin protein ligase (E3). Polyubiquitinated protein substrates are selectively targeted for degradation by the proteasome. Removal of ubiquitin from ubiquitinated substrates is catalyzed by deubiquitinating enzymes (DUB). In this thesis, I have explored functions of three specific enzymes of the ubiquitin system, the E2 UBC4-testis, the HECT E3 EDD/Rat100 and the deubiquitinating enzyme USP19, in mammalian spermatogenesis or muscle wasting. UBC4-testis is a rodent testis specific E2 enzyme that is induced in round spermtids. Mice lacking the UBC4-testis gene had a delay in postnatal development during the first wave of spermatogenesis but ultimately had in adulthood normal fertility and testis weights, spermatid number, protein content, rate of ubiquitination and quantity and quality of sperm. When subjected to the heat stress of experimental cryptorchidism, the profile of germ cell degeneration was not significantly different from that of wild type mice. Our data suggest that UBC4-testis has a specific function in promoting the evolution of the first wave of spermatogenesis; however, some coexisting isoforms of UBC4 may serve redundant complementary functions in later stages of spermatogensis. EDD/Rat100 is a UBC4 dependent E3 that is highly expressed in rat testis. The poly(A)-binding protein (PABP) is a translation initiation factor that is negative regulated by the PABP-interacting protein 2 (Paip2). Both PABP and EDD/Rat100 share a PABC domain, through which they can interact with Paip2. EDD/Rat100 can ubiquitinate Paip2 in vitro. Under normal in vivo conditions, the abundant PABP may sequester Paip2 from ubiquitination by EDD/Rat100. In PABP-depleted cells, Paip2 is free to interact with EDD/Rat100, which leads to Paip2 ubiquitination and degradation by the proteasome. Degradation of Paip2 may then restore the activity of PABP and therefore maintain its homeostasis. Thus, the turnover of Paip2 in the cell is mediated by EDD/Rat100 but is regulated by PABP. In addition, six proteins that were copurified from immunoprecipitation of EDD/Rat100 in rat testis have been elaborately studied, but none of them was identified as a bona fide substrate of EDD/Rat100. Finally, I studied USP19, a 150 kDa DUB that is induced in atrophying skeletal muscle. A modest increase of expression of USP19 was observed in early differentiation of L6 cells. TNF-α can increase expression of USP19 in L6 myotubes. SiRNA mediated silencing of USP19 expression can increase expression of MHC in L6 myotubes in a myogenin dependent manner. And silencing of USP19 can partially reverse the TNF-α or DEX stimulated catabolism of MHC. Thus, USP19 can regulate synthesis of myofibrillar proteins through modulating transcriptional factor in myotubes. These data demonstrate that the ubiquitin system not only mediates the increased protein breakdown but is also involved in the decreased protein synthesis in atrophying skeletal muscle. / L'attachement de l'ubiquitine à un substrat protéique est catalysé par une série de réactions en chaîne impliquant trois classes d'enzymes- l'enzyme d'activation de l'ubiquitine (E1), l'enzyme de conjugaison de l'ubiquitine (E2) et l'enzyme de ligation de l'ubiquitine (E3). Les substrats protéiques polyubiquitinés sont spécifiquement reconnus par le protéasome pour être dégradés. L'enlèvement de l'ubiquitine présent sur les substrats ubiquitinés est catalysé par les enzymes de déubiquitination (DUB). Dans cette thèse, j'ai étudié les fonctions de trois enzymes du système ubiquitine : l'enzyme E2 UBC4-testis, l'enzyme E3 EDD/Rat100 et l'enzyme de déubiquitination USP19. Leurs rôles dans la spermatogénèse et l'atrophie musculaire ont été étudiés chez les mammifères.UBC4-testis est une enzyme spécifiquement exprimée dans les testicules de rongeurs et est induite dans les spermatides ronds. Des souris ayant le gène UBC4-testis inactivé démontrent un délai dans le développement postnatal durant la première vague de spermatogénèse. Par contre, arrivées à l'âge adulte, ces mêmes souris démontrent une fertilité et un poids testiculaire normal. Aussi, nous avons observé des données normales pour le nombre de spermatides, le contenu protéique, le taux d'ubiquitination ainsi que pour la quantité et la qualité des spermatozoïdes. Lorsque les testicules de ces souris sont soumis à un stress de température en effectuant une cryptorchidie expérimentale, le profil de dégénérescence des cellules germinales n'était pas significativement différent de celui de souris normales ayant subit le même traitement. Nos résultats suggèrent donc que UBC4-testis exerce un rôle dans l'évolution de la première vague de la spermatogénèse mais il est possible que d'autres isoformes UBC4 puissent exercer des fonctions redondantes dans les étapes tardives de la spermatogénèse.EDD/Rat100 est une enzyme E3 qui est dépendante de l'enzyme E2 UBC4 et qui est fortement exprimée dans les testicules de rat. La protéine de liaison au Poly(A) (PABP) est un facteur d'initiation à la traduction qui est négativement régulé par une protéine interagissant avec PABP appelée Paip2. PABP et EDD/Rat100 ont en commun un domaine appelé PABC qui peut interagir avec Paip2. EDD/Rat100 est capable d'ubiquitiner Paip2 in vitro. Dans des conditions normales in vivo, PABP, qui est en abondance, pourrait séquestrer Paip2 pour être ubiquitiné par EDD/Rat100. Dans des cellules qui ont des niveaux de PABP réduits, Paip2 est libre d'interagir avec EDD/Rat100 et est donc ubiquitiné et dégradé par le protéasome. La dégradation de Paip2 peut finalement rétablir l'activité de PABP et par conséquent maintenir son homéostasie. Ainsi, le taux de renouvellement de Paip2 dans la cellule est géré par EDD/Rat100 mais est régulé par PABP. De plus, six protéines copurifiées par immunoprécipitation avec EDD/Rat100 dans des extraits de testicules de rat ont été minutieusement étudiées mais aucune d'entre elle n'a été identifiée comme étant un substrat bona fide de EDD/Rat100.Finalement, j'ai analysé USP19, une enzyme de déubiquitination qui est induite dans les muscles squelettiques dans des conditions d'atrophie musculaire. Une modeste augmentation de l'expression de USP19 a été observée dans des cellules L6 en début de différentiation. TNF- peut augmenter l'expression de USP19 dans les cellules L6. Lorsque les niveaux d'USP19 sont réduits par ARN interférent dans les myotubes L6, l'expression de MHC est augmentée de façon dépendante de la myogénine. Aussi, en diminuant les niveaux d'USP19, la dégradation de MHC stimulée par TNF- ou par DEX peut partiellement être renversée. Donc, USP19 peut réguler la synthèse de protéines myofibrillaires en modulant la transcription dans des cellules musculaires L6. Ces résultats démontrent que le système ubiquitine n'agit non seulement sur la dégradation protéique dans les muscles squelettiques atrophiés mais aussi en diminuant la synthèse protéique.