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Thesis (Ph.D.)--University of Illinois at Urbana-Champaign, 2009. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 70-06, Section: B, page: 3353. Advisers: Wanda M. Haschek-Hock; Paul S. Cooke. Includes bibliographical references (leaves 75-89) Available on microfilm from Pro Quest Information and Learning.

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Vitamin D is a key modulator and regulator of mineral and bone homeostasis. The main active form of vitamin D in the body is the 1,25-(OH)2D metabolite that is formed in the kidney from 25-(OH)D by the enzyme CYP27B1. The enzyme CYP24A1 initiates the C24-oxidation pathway that leads to degradation of the hormonal form of vitamin D, but is also responsible for the synthesis of 24,25-(OH)2D. The putative biological activity of 24,25-(OH)2D remains unclear, but it has been found that following tibial fractures in chicks, the levels of CYP24A1 activity and serum 24,25-(OH)2D are both elevated. Our laboratory has engineered a mouse deficient for the Cyp24a1 gene to study the role of 24,25-(OH)2D, and has identified a putative membrane receptor (FAM57Bv2) to 24,25-(OH)2D. In this study we assessed the biomechanical properties (stiffness and force needed to break) of the repaired bones of mutant and wild-type mice at different intervals in the presence or absence of treatment with exogenous 24,25-(OH)2D. We also assessed the mRNA and protein expression of the putative receptor in different organ tissues of wild-type mice. Methods: wild-type and Cyp24a1-deficient mice were subjected to a modified open osteotomy with subsequent intramedullary nailing of the tibia, followed by subcutaneous treatment with vehicle (propylene glycol) or 6.7 µg/kg of 24,25-(OH)2D. Tibiae were collected on days 18 and 28 post operatively, and the biomechanical properties were tested using a three point bending testing machine. To assess the mRNA and protein expression of Fam5bv2 in different tissues, qRT-PCR, western blot analysis and immunohistofluorescence were performed. Results: at day 18, we observed significantly inferior biomechanical parameters in the male and female mutant mice injected with vehicle compared to their wild-type littermates. These differences were rescued by exogenous administration of 24,25-(OH)2D. No statistically significant differences were measured at day 28. qRT-PCR analysis showed high mRNA expression of Fam57bv2 in skin and cartilage, while western blot analysis showed FAM57B (all isoforms) to be expressed in all tissues studied. Immunohistofluorescence studies showed detection of FAM57B in brain paraffin sections, and kidney and tibial cryosections. Conclusion: The results of this study confirm the delay of fracture healing in Cyp24a1-deficient mice and support a role for 24,25-(OH)2D in optimizing fracture healing. Our expression monitoring results show that the putative receptor for 24,25-(OH)2D, FAM57Bv2, is broadly expressed with enrichment in chondrocytes, which may contribute to improved fracture healing. / La vitamine D est un modulateur clé de l'homéostasie des minéraux. La forme active de la vitamine D est la 1,25-(OH)2D synthétisée au niveau du rein par l'action de l'enzyme CYP27B1 sur le précurseur 25-(OH)D. L'enzyme CYP24A1 initie la voie d'oxydation C24 qui conduit à la dégradation de la forme hormonale de la vitamine D, mais est également responsable de la synthèse de 24,25-(OH)2D. L'activité biologique de la 24,25-(OH)2D demeure controversée, mais il a été constaté qu'à la suite de fractures du tibia chez les poussins, les niveaux d'activité de la CYP24A1 et les niveaux sériques de 24,25-(OH)2D sont stimulés. Notre laboratoire a mis au point une lignée de souris déficientes pour le gène Cyp24a1 afin d'étudier le rôle de la 24,25-(OH)2D, et a identifié une molécule qui pourrait agir comme récepteur membranaire pour la 24,25-(OH)2D (FAM57B2). Dans cette étude, nous avons évalué les propriétés biomécaniques (rigidité et la force maximale pour rompre) des os réparés chez des souris mutantes et de type sauvage, suite à un traitement en présence ou absence de 24,25-(OH)2D exogène. Nous avons également évalué l'expression de l'ARNm et de la protéine du récepteur putatif dans différents organes chez les souris sauvage. Méthodes: les souris de type sauvage ou déficiente pour le gène Cyp24a1 ont été soumise à une ostéotomie ouverte modifiée du tibia avec insertion d'un clou médullaire, suivie d'un traitement sous-cutané avec le véhicule (propylène glycol) ou avec 6,7 g/kg de 24,25-(OH)2D. Les tibias ont été prélevés aux jours 18 et 28 suivant la chirurgie, et les propriétés biomécaniques ont été testées en utilisant un test de flexion à trois points. Pour évaluer l'ARNm et l'expression de la protéine de Fam57bv2 dans différents tissus, une amplification par PCR quantitative, l'immunobuvardage et l'immunohistofluorescence ont été utilisés. Résultats: au jour 18, nous avons observé que les paramètres biomécaniques sont nettement inférieurs chez les souris mutantes mâles et femelles injectées avec le véhicule par rapport aux animaux de type sauvage. Ces différences disparaissent suite à l'administration de 24,25-(OH)2D exogène. Aucune différence statistiquement significative n'a été mesurée au jour 28. L'analyse qRT-PCR a montré une expression elevée de l'ARNm de Fam57bv2 dans la peau et le cartilage, tandis que l'analyse par immunobuvardage a montré que FAM57B (toutes les isoformes) est exprimée dans tous les tissus étudiés. L'immunohistofluorescence a permis de détecter FAM57B dans des coupes en paraffine de cerveau et dans des cryosections de rein et de tibia. Conclusion: Les résultats de cette étude confirment le retard de la guérison des fractures chez les souris déficientes en Cyp24a1 et soutiennent un rôle de la 24,25-(OH)2D à optimiser la guérison des fractures. Nos résultats concernant l'expression de FAM57B montrent que le récepteur potentiel de la 24,25-(OH)2D, FAM57Bv2, est exprimé à des niveaux élevés dans les chondrocytes, ce qui appuie une contribution mécanistique au cours de la guérison des fractures.

Two areas that are particularly suited to mathematical modeling analysis are how molecular signaling pathways process the timing of stimuli and how spatial structure can influence a signaling pathway's dynamics. These topics are explored through specific examples. The timing of stimuli is known to affect the strength of memory formation. This phenomenon has been studied in the sensory-motor neuron synapse of Aplysia. In this system, training that is separated by rest periods (spaced training) leads to persistent changes in synaptic strength that depend on biochemical pathways that are distinct from those that are engaged when the training lacks rest periods (massed training). Applications of serotonin (5HT), the neurotransmitter implicated in inducing these synaptic changes, causes desensitization of PKC Apl II, in a manner that depends on the timing of 5HT stimulation; spaced applications of 5HT cause more desensitization than massed applications of 5HT. We developed a mathematical model of this response to gain insight into how neurons process the timing difference in stimuli. The model represents the trafficking of the 5HT receptor responsible for activating PKC Apl II. Each component of the model was developed incrementally and was experimentally validated. We discovered two major elements of the signaling pathway mediating PKC Apl II desensitization. First, we discovered that PKA activity leads to an increase in the reversal from desensitization. Second, we propose that the mechanism allowing the signaling pathway to differentiate spaced from massed applications of 5HT is largely driven by the rates of synthesis and degradation of a pair of hypothetical proteins, named AD and D, that regulate receptor activity. We further developed the isolated sensory neuron work by experimentally observing the desensitization of PKC Apl II translocation in co-cultured sensory and motor neurons. We found that the formation of a synapse results in a change in the desensitization of PKC Apl II translocation: spaced applications of 5HT no longer caused greater desensitization than massed applications. This finding implies that the sensory neuron has undergone a change during synapse formation in the signaling network regulating the desensitization of PKC Apl II. To explain these changes, we created two new models: one of the cell body of sensory neurons co-cultured with motor neurons and one of the synapses of these neurons. These new models were able to explain the change in desensitization of PKC translocation by making changes to the expression and activity of regulatory proteins. These models provide a signaling pathway mechanism for neurons to encode the timing of stimuli. The model of PKC Apl II desensitization was able to describe these signaling dynamics without taking into consideration the spatial structure of the system. However, the geometry of a system may have a significant impact on a signaling pathway's output. To examine this issue in more detail, we modeled the general case of a signaling pathway with two signaling molecules, an activating species and an inhibiting species forming a negative feedback, which are synthesized at unique sites and interact with each other through diffusion. The dynamical behaviors in these systems depend on the spatial locations of the synthetic sites. In a negative feedback system with two sites, we find two dynamical modes: fixed point and stable oscillations whose frequency can be tuned by varying the distance between the sites. When there are multiple synthetic sites, we find more diverse dynamics, including chaos, quasiperiodicity, and bistability. These studies propose a mechanism for signaling pathways to encode the timing of stimuli, and demonstrate the effects spatial structure can have on signaling output. Furthermore, they provide examples of the use of mathematical modeling in furthering our understanding of molecular signaling networks. / Il est connu que le moment de présentation des stimuli a un effet important sur la force de la mémoire formée. Un excellent modèle pour étudier ce phénomène est la synapse sensori-motrice des neurones de l'aplysie. Dans ce système, une stimulation séparée par des périodes de repos (applications espacées) conduit à des changements persistants au niveau de la force synaptique qui dépend de voies biochimiques différentes de celles qui se produisent lors d'une stimulation sans périodes de repos (applications continues). Récemment, il a été montré que dans les neurones sensoriels isolés, l'application de la sérotonine, qui est le neurotransmetteur impliqué dans l'induction de ces changements synaptiques, entraîne une désensibilisation de la réponse PKC Apl II d'une manière qui dépend du moment précis de la stimulation par la sérotonine. Nous avons développé un modèle mathématique de cette réponse afin de mieux comprendre comment les neurones traitent-ils la différence temporelle entre stimuli. Le modèle représente le trafic du récepteur de la sérotonine responsable de l'activation de PKC. Chaque composante du modèle a été développée progressivement et a été validé expérimentalement. Basée sur ce modèle, nous avons découvert deux éléments majeurs de la voie de signalisation médiatrice de désensibilisation de la PKC. Premièrement, nous avons découvert l'activité PKA conduit également à une augmentation du processus réversible de désensibilisation. Deuxièmement, nous proposons que le mécanisme permettant à la voie de signalisation de différencier l'effet de la sérotonine, dépendamment d'une application espacée ou une application continue, est largement déterminée par les taux de synthèse et de dégradation d'une paire de protéines hypothétiques, que nous nommerons AD et D qui régulent l'activité des récepteurs. Nous avons élargi le travail des neurones sensoriels isolés en observant la désensibilisation de la translocation PKC Apl II dans des co-cultures de neurones sensoriels et moteurs, où le neurone sensoriel forme une connexion synaptique avec le motoneurone. Nous avons constaté que la formation d'une synapse résulte d'un changement de la désensibilisation de la translocation PKC: les applications espacées de 5HT ne sont plus capables de causer une désensibilisation plus importante que celles des applications continues. Ceci peut signifier que, le neurone sensoriel a subi un changement durant la formation de synapses dans le réseau de signalisation régulant l'activation de la PKC. Pour expliquer ces changements, nous avons créé deux nouveaux modèles: l'un dédié aux corps cellulaires des neurones sensoriels co-cultivés avec des neurones moteurs et l'autre aux synapses de ces neurones. Ces nouveaux modèles ont été en mesure d'expliquer le changement dans la désensibilisation de la translocation de la PKC en pratiquant des changements dans les taux de synthèse et de dégradation des proteines AD et D.Le modèle de la translocation PKC Apl II a pu décrire les dynamiques biologiques sans prendre en considération la structure spatiale du système. Néanmoins, la géométrie d'un système peut avoir un impact significatif sur la résultante d'une des voies de signalisation. Ainsi, nous considérons le cas général d'une voie de signalisation ayant deux molécules de signalisation: une espèce activatrice et une espèce inhibitrice avec une rétroactivité négative, qui sont synthétisés dans des sites uniques et qui interagissent les uns avec les autres à travers un processus de diffusion. Les comportements dynamiques de ces systèmes dépendent des localisations spatiales des sites de synthèse. Dans un système de rétroactivité négative à deux sites, on trouve une dynamique à deux modes: point fixe et oscillations stables dont la fréquence peut être ajustée en faisant varier la distance entre les deux sites. Quand il y'a plusieurs sites de synthèse, nous avons constaté une dynamique plutôt diverse, incluant chaos, quasi-périodicité et instabilité.

Adipose tissue is an important contributor to energy homeostasis and the discovery that adipose tissue produces a number of hormones involved in regulating energy storage and energy utilization has been a topical area of research. Acylation stimulating protein (ASP/C3adesArg) is an adipose tissue derived hormone that stimulates fatty acid uptake and storage in adipocytes. ASP stimulates triglyceride (TG) synthesis via its receptor, C5L2. C5L2 also binds C5a, an anaphylactic protein structurally similar to ASP, yet its function as an active receptor for C5a is still under debate. However, in adipocytes ASP affects TG synthesis via increased diacylglycerol acyltransferase activity, glucose transport and indirect stimulation of lipoprotein lipase (LPL) activity. LPL is often referred to as a 'gatekeeper of postprandial TG' and subjects with a genetic mutation in LPL suffer from hyperchylomicronemia (excess dietary lipids). The overall objective of this thesis was to examine the role of ASP in lipid metabolism by tracking fatty acid fluxes in human subjects and animal models. This was investigated by 1) evaluating the fasting and postprandial plasma ASP levels in subjects deficient in LPL and 2) determining the consequences of fatty acid repartitioning with respect to adipose tissue storage and muscle utilization. The latter examined fatty acid storage and oxidation in two mouse models, ASP-deficient C3 knockout (KO) and ASP receptor-deficient C5L2 KO mice. Novel findings showed that both homozygote and heterozygote carriers of an LPL mutation displayed elevated fasting ASP levels, possibly due to the accumulation of chylomicrons in these subjects, since fibrate treatment which reduces TG levels also decreased ASP levels in LPL heterozygotes. In addition, this thesis showed that both C3KO and C5L2 KO mice displayed altered adipocyte morphology, reduced adipose tissue TG synthesis capacity and increased skele / Le tissu adipeux est un régulateur important de l'homéostasie énergétique de l'organisme. Outre sa fonction de réserve énergétique, le tissu adipeux est capable de produire une grande variété d'hormones. Celles-ci jouent de nombreux rôles dans le contrôle du stockage et l'utilisation de l'énergie et la compréhension de leurs fonctions est un sujet de pointe en recherche. La protéine stimulant l'acylation (ASP/C3adesArg) est une hormone dérivée du tissu adipeux qui stimule le captage et le stockage des acides gras (AG) chez les adipocytes. L'ASP stimule également la synthèse des triglycérides (TG) via son récepteur, le C5L2. Le C5L2 est aussi reconnu comme pouvant lier le C5a, une protéine anaphylactique similaire à l'ASP, mais son activation suite à cette liaison reste controversée. Pour sa part, l'ASP agit sur la synthèse des TG via un accroissement de l'activité de la diacylglycérol acyltransférase chez les adipocytes. L'ASP augmente aussi le transport du glucose et stimule indirectement l'activité de la lipoprotéine lipase (LPL). La LPL est reconnue comme étant capable de contrôler les niveaux de TG postprandiaux. Les personnes qui possèdent une mutation dans le gène de la LPL souffrent d'hyperchylomicronémie (un excès de lipides alimentaires). L'objectif principal de cette thèse était de déterminer le rôle de l'ASP dans le métabolisme lipidique en évaluant les fluctuations des AG tant chez l'humain que chez l'animal. Cet objectif a été réalisé en : 1) évaluant les niveaux d'ASP à jeun et postprandiaux chez des personnes déficientes en LPL, en 2) regardant les conséquences d'un changement dans la répartition des AG en relation avec le stockage dans le tissu adipeux et l'utilisation par le muscle et finalement en 3) examinant le stockage et l'oxydation des AG chez deux modèles murins; soient des souris déficientes en protéine C3 (ASP déficiente obl

The mdx mouse is the genetic homologue of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). In this model, repeated cycles of muscle fiber necrosis occur within the diaphragm and other muscles. It has been reported that molecules associated with tissue damage, such as extracellular matrix breakdown products, can act as endogenous ligands for Toll-Like receptors (TLRs). However, the role of TLRs and endogenous ligands released from damaged skeletal muscle has not been examined. The goals of this study were to determine whether genes associated with TLR function are abnormally regulated in mdx diaphragm and tibialis anterior and if TLR2 gene ablation affects genes associated with TLR signaling and inflammation. By quantitative RT-PCR, multiple genes associated with TLR signaling and inflammation were significantly upregulated in the mdx diaphragm and tibialis anterior muscles. Genetic ablation of TLR2 in mdx mice was associated with a significant downregulation of many pro-inflammatory genes. Our findings suggest that genes of the TLR signaling pathway are upregulated in mdx skeletal muscles and are linked to excessive inflammation. / Dans le modèle murin, mdx , de la Dystrophie Musculaire de Duchenne, des cycles répétés de nécrose des fibres musculaires se produisent dans le diaphragme ainsi que d'autres muscles. Il a été montré que des molécules associées au dommage tissulaire, telles que des produits issus de la dégradation de la matrice extracellulaire peuvent agir comme ligands des récepteurs Toll (TLRs). Cependant, le rôle des TLRs dans la pathologie du muscle dystrophique ainsi que leur capacité à interagir avec des ligands endogènes libérés lors de dommage du muscle squelettique n'ont jamais été étudiés. Le but de cette étude est de déterminer: 1) d'une part si les gènes associés à la signalisation des TLRs sont élèvés et d'autre part si l'extinction du gène TLR2 dans les souris mdx affecte les gènes associés à la signalisation des TLRs et à l'inflammation. Par RT-PCR quantitative, nous avons montré que de multiples gènes associés à la fonction TLRs étaient régulés positivement à la fois dans le diaphragme et le muscle Tibialis Anterior mdx. L'extinction du récepteur TLR2 dans les souris mdx a provoqué une significative regulation negative de nombreux gènes pro-inflammatoires.

Mammalian alkali cation/proton exchangers, more commonly known as sodium/proton exchangers (NHEs) are a family of transmembrane proteins that mediate an electroneutral exchange of Na+ (or K+) and protons across cellular membranes, thereby regulating intracellular pH and volume homeostasis. Eleven different isoforms have been identified, which differ in their tissue distribution, subcellular localization, and function. The organellar-type NHE6 isoform is widely distributed in tissues, but is enriched in brain, heart, and muscle. In order to elucidate the native distribution of NHE6 and to identify some of the mechanisms underlying its trafficking and function, a rabbit polyclonal antibody was generated. Utilizing this antibody in polarized human SH-SY5Y neuroblastoma cells, endogenous NHE6 was detected in transferrin receptor-containing vesicles in the soma and neurite processes. In mouse hippocampal organotypic slice cultures, NHE6 was detected within the soma, as well as dendritic shafts and spines of CA1 pyramidal cells. Ultrastructural analysis of mouse hippocampus and cortex revealed the presence of NHE6 positive signals predominantly in dendrites, occasionally adjacent to postsynaptic densities, and to a minor extent in some presynaptic terminals. N-glycosylation of proteins is involved in different aspects of protein function, such as folding, trafficking, stability and activity. To identify the glycosylation site(s) and their potential role in NHE6 function, mutagenesis analysis in combination with different biochemical assays and confocal microscopy were used. Our results revealed that asparagine 128 is the sole target for the N-glycosylation of the transporter. Furthermore, glycosylation was involved in promoting efficient export of the exchanger to the cell surface and for optimal transport activity within recycling endosomes.The NHEs have been shown to be regulated in part through the interaction of the cytosolic C-terminal domain with numerous interacting partners, depending on the isoform. In order to identify novel interacting proteins involved in the regulation of NHE6, a yeast two-hybrid screen of a human brain cDNA library was conducted using the C-tail of NHE6 as bait. Two of the clones identified encoded the receptor for activated protein kinase C 1 (RACK1), a scaffolding protein involved in numerous protein interactions and biological functions. Direct interaction of these two proteins was confirmed in vitro and in vivo. Depletion of RACK1 by siRNA resulted in increased total cellular expression and cell surface abundance of NHE6.Recently mutations in NHE6 have been linked to X-linked mental retardation, with a phenotype closely resembling that of Angelman syndrome. One of the mutations resulted in deletion of two residues (Glu255/Ser256) in the predicted transmembrane domain seven. To investigate the molecular mechanisms underlying the phenotype observed, we generated epitope-tagged variants of NHE6 bearing the deletion and showed that they display deficient processing and maturation, as well as markedly reduced stability in cells. Furthermore, the mutant protein is mislocalized in cells and targeted to an ill-defined acidic compartment. Preliminary results show that depletion of NHE6 in neurons resulted in decreased dendritic branching and disappearance of dendritic spines. We propose that the mutant protein is non-functional; thereby vesicular trafficking is impaired, resulting in deficient dendritic spine growth and maintenance. / Les échangeurs de Na+/H+ (NHEs) sont des protéines transmembranaires qui catalysent l'échange électroneutre de Na+ (ou K+) et de protons à travers les membranes cellulaires, régulant ainsi le pH intracellulaire et l'homéostasie du volume cellulaire. Jusqu'à présent, on été identifié onze isoformes, qui diffèrent dans leur distribution tissulaire, localisation subcellulaire, et leur fonction. L'isoforme NHE6 est largement distribué dans les tissus, mais il est plus exprimé dans le cerveau, le cœur et les muscles.Afin de déterminer la distribution native du NHE6 et d'identifier certains des mécanismes sous-jacents de son trafic et de sa fonction, on a crée un anticorps polyclonal. En utilisant celui-ci pour le marquage des cellules polarisées SH-SY5Y de neuroblastome, le NHE6 endogène a été détecté dans des vésicules contenant le récepteur de la transferrine, dans le corps cellulaire (soma) et au niveau des neurites. Dans des cultures cellulaires de l'hippocampe, le NHE6 a été détecté dans le soma et dans les dendrites ainsi que dans les épines des cellules pyramidales CA1 L'analyse ultrastructurale de l'hippocampe et du cortex de souris a révélé la présence des signaux positifs de NHE6 principalement dans les dendrites, parfois à côté de la région post-synaptique hyperdense, et dans une moindre mesure dans certaines terminaisons présynaptiques.La N-glycosylation des protéines est impliquée dans de différents aspects de la fonction des protéines, comme le pliage, le trafic, la stabilité et l'activité. Pour identifier les sites de glycosylation et leur rôle potentiel dans la fonction de NHE6, ont a utilisé la mutagenèse, en combinaison avec différents dosages biochimiques et la microscopie confocale. Nos résultats ont révélé que l'asparagine 128 est la seule cible de la N-glycosylation du transporteur. En outre, nous avons démontré que la glycosylation est nécessaire pour l'exportation efficace de l'échangeur à la surface cellulaire, ainsi que pour une l'activité optimal dans les endosomes de recyclage.Afin d'identifier des nouvelles protéines impliquées dans la régulation de NHE6, nous avons utilisé un système de double-hybride de levure. On a dentifiés deux clones qui codent le récepteur de la protéine kinase C (RACK1), une protéine d'échafaudage impliquée dans les interactions entre protéines. L'interaction directe de ces deux protéines a été confirmée in vitro et in vivo. L'utilisation de siRNA contre RACK1 conduit à une augmentation de l'expression cellulaire et de la densité sur la surface cellulaire du NHE6.Récemment, des mutations dans NHE6 ont été liées à un syndrome ressemblant à celui du syndrome d'Angelman. Une de ces mutations conduit a la suppression de deux résidus (Glu255/Ser256) dans le domaine sept transmembranaire. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents au phénotype observé, nous avons généré des variantes de NHE6 portant la suppression, qui on montré une maturation inadéquate, ainsi qu'une stabilité réduite dans les cellules. En outre, la protéine mutante est mal-localisée dans les cellules et se trouve dans un compartiment acide mal défini. Des résultats préliminaires montrent que l'utilisation de siRNA contre NHE6 entraine une baisse de ramification dendritique, ainsi que la disparition d'épines dendritiques dans des neurones. Nous proposons que la protéine mutante n'est pas fonctionnelle, et que le trafic vésiculaire intracellulaire est altéré, ce qui peut entraîner une déficience dans le développement de dendrites.