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The human body contains about three to four grams of iron, a metal of vital importance for almost all forms of life. The majority of body iron is used by developing red blood cells for hemoglobin production. Macrophages digest senescent red blood cells, break down heme and then return heme-derived iron to the circulation. Macrophages also produce an immense amount of reactive oxygen species, including nitrogen monoxide (NO), which in turn severely reduces pathogen vitality and proliferation, in response to inflammatory stimuli. In addition, to its cytotoxic effects on pathogens and tumor cells, NO regulates macrophage iron metabolism in numerous ways. Furthermore, NO derived from bone-marrow macrophages may also expose developing red blood cells to the modulating effects of NO. In anemia of chronic disease (ACD), the perturbation of macrophage iron export during inflammatory conditions leads to iron-restricted erythropoiesis. ACD is usually present in patients suffering from tumors, chronic infections, or chronic inflammatory conditions and results from retention of macrophage iron, thus leading to anemia. In this thesis we examine the effects of NO on macrophage and reticulocyte iron metabolism and suggest that NO could contribute to the pathogenesis of ACD by increasing macrophage iron storage and impairing hemoglobin synthesis in developing red blood cells. In chapter 2 we investigated the effects of NO on the synthesis of the iron storing protein, ferritin, in macrophages. We showed that the increase in ferritin synthesis by NO occurs independently of the ferritin-translation regulatory proteins, known as iron regulatory proteins (IRPs). Moreover, we demonstrated that sodium nitroprusside (SNP) greatly increases the efficiency of ferritin mRNA translation. In chapter 3 we examined the possibility that ferritin-iron could be used for the macrophage's own metabolic needs. Indeed, we show that stimulation of heme synthes / Le corps humain contient entre 3 et 4 grammes de fer. Ce métal est d'une importance vitale pour presque toute forme de vie. La majorité du fer contenu dans le corps est utilisé par les globules rouges en développement pour la production d'hémoglobine. Les macrophages digèrent les globules rouges sénèscents, décomposent l'hème et remettent en circulation le fer qui en dérive. Les macrophages produisent aussi une immense quantité d'espèces oxygénées réactives, incluant le monoxyde d'azote (NO), qui en retour réduit sévèrement la vitalité et la prolifération des agents pathogènes, en réponse aux signaux inflammatoires. Additionnellement à ses effects cytotoxiques sur les pathogènes et les cellules tumorales, le NO régule le métabolisme du fer dans les macrophages de nombreuses façons. Le NO qui dérive des macrophages de la moëlle osseuse pourrait aussi exposer les globules rouges en développement à l'effet modulateur du NO. Dans l'anémie des maladies chroniques (AMC), la perturbation de l'exportation du fer par les macrophages au cours de conditions inflammatoires mène à l'erythropoïèse restreinte au fer. L'AMC est habituellement présente chez les patients souffrant de tumeurs, d'infections chroniques, ou d'inflammation chronique, elle aboutit à la rétention du fer par les macrophages, conduisant ainsi à l'anémie. Dans cette thèse, nous examinons l'effet du NO sur le métabolime du fer dans les macrophages et les réticulocytes. Nous suggèrons que le NO pourrait contribuer à la pathogenèse de l'AMC en augmentant le stockage du fer dans les macrophages et en affectant la synthèse d'hémoglobine dans les globules rouges en développement. Dans le chapître 2, nous étudions les effects du NO sur la synthèse de la ferritine, protéine de stockage du fer, dans les macrophages. Nous avons montré que l'augmentation de la synthèse de ferritine par le NO apparaît indépendement de

In an absurd twist of nature, the physiological role of iron is paradoxical. Iron is the most abundant element found on Earth and yet is insoluble under physiological conditions. Furthermore, life is not possible without iron; iron is indispensible for life, as it is a vital co-factor for essential enzymes due to its unique redox abilities. And yet, high concentrations of iron lead to the formation of reactive oxygen species and are toxic. Consequently, living creatures have evolved ingenious strategies for acquiring and managing otherwise insoluble iron atoms, and for tightly regulating its levels within the organism. The majority of bodily iron in humans is contained within the red blood cell (RBC) mass, as a component of hemoglobin. RBCs become more damaged and less deformable as they age, and at the end of their 120 day lifespan, senescent RBCs are engulfed by macrophages of the reticuloendothelial system of the liver and spleen. These specialized macrophages ingest 2 million RBCs/sec, catabolize the hemoglobin, and release the iron contained within to plasma transferrin for reincorporation into new RBCs within the bone marrow. It is remarkable how reticuloendothelial macrophages safely manage the enormous quantities of iron which would otherwise prove toxic to other cells. In my studies, I have examined the specific aspects of iron metabolism within these iron-handling macrophages. Natural resistance-associated macrophage protein 1 (Nramp1) is a divalent metal transporter expressed only within the phagosomes of professional phagocytic cells such as macrophages and neutrophils. Nramp1 has since been found to be the gene responsible for conferring host resistance against intracellular pathogens. Mice deficient in Nramp1 have been found to be susceptible to infection with intracellular pathogens. Nramp1 is thought to confer protection by depleting the phagosome of divalent metals necessary for pathogen / La majorité du fer dans le corps humain est contenu dans la masse de globule rouge, en tant que composante de l'hémoglobine. Les GR deviennent plus endommagés et moins déformables en vieillissant, et à la fin de leurs durée de vie de 120 jours, les GR sénescents sont ingurgités par les macrophages du système réticuloendothélial du foie et de rate. Ces macrophages spécialisés ingèrent 2 millions de GR∕sec, catabolisent l'hémoglobine et relâche le fer qui y est contenu à la transferrine plasmatique pour permettre son réincorporation dans de nouveau GR dans la moelle épinière. C'est remarquable comment les macrophages réticuloendothéliaux gèrent de manière sécuritaire l'énorme quantité de fer qui serait sinon toxique pour les autres cellules. Dans mes recherches, j'ai examiné les aspects spécifiques du métabolisme du fer dans ces macrophages spécialisés dans sa manutention.La protéine associée à la résistance naturelle du macrophage (Nramp1) est un transporteur de métaux divalents exprimé seulement dans les phagosomes de cellules phagocytiques telle que les macrophages et les neutrophiles. Nramp1 a depuis été reconnu comme le gène responsable de conférer à l'hôte la résistance contre les pathogènes intracellulaires. Nramp 1 est présumé donner une protection en vidant le phagosome de métaux divalents nécessaires à la croissance de pathogènes.Au cours des recherches nous avons trouvé qu'en plus de jouer un rôle significatif dans la résistance de l'hôte, Nramp1 est aussi important pour la régularisation de l'homéostasie du fer. Nous avons remarqué que les macrophages sans Nramp1 sont incapables de recycler le fer (après l'erythrophagocytose in vitro) de manière aussi efficace que les macrophages qui ont le Nramp1 fonctionnel. On a ensuite observé les souris knockout et trouvé que les animaux sans Nramp1 ont une surdose progressive de fer en vieil

Kir3 channels contain multiple Gβγ binding sites within their N- and C-terminal domains. However, the channel opens when only a few binding sites are occupied by Gβγ, suggesting that some sites subserve roles other than agonist-dependent interactions. We delineated these roles on Kir3.2 channels with mutations in their N- or C-terminal Gβγ binding sites. / The N-terminal mutant displayed a high affinity site for Gβγ but this affinity was reduced with the C-terminal mutant. Also, the N-, but not the C-terminal mutant could traffic to the cell surface. Carbachol stimulation of the muscarinic M2 receptor, resulted in conformational changes between Gβγ and the wildtype channel, which were not engendered by either of the mutants. Lastly, neither of the mutant channels could be opened following receptor activation. / We conclude that the C-terminal Gβγ site may be required for 'precocious' interactions, while the N-terminal site may be needed for signalling following receptor activation. / Les canaux Kir3 possèdent de multiples sites de liaison pour les protéines Gβγ, localisés dans leurs domaines N- et C-terminaux. Cependant, la liaison des protéines Gβγ à seulement quelques-uns de ces sites suffit à produire l'ouverture du canal, ce qui suggère que certains sites remplissent des rôles autres que ceux résultant de l'interaction avec les protéines Gβγ lors d'un l'activation du récepteur. Nous avons investigué ces rôles en utilisant des canaux Kir3.2 ayant des mutations au niveau des sites de liaisons des protéines Gβγ dans les domaines N- et C-terminaux. / Nous démontrons que le mutant de la partie N-terminale possède un site de haute affinité pour les Gβγ, mais que cette affinité est réduite par la présence du mutant de la partie C-terminale. De plus, seul le mutant de la partie N-terminale a la capacité d'être acheminé à la surface cellulaire. Une stimulation du récepteur muscarinique M2 par le carbachol résulte en un changement de conformation entre les protéines Gβγ et le canal de type sauvage, ce qui n'est pas engendré par les mutants. Finalement, aucun des canaux mutants n'a pu être ouvert suivant l'activation du récepteur. / Nous concluons que le site de liaison situé dans la région C-terminale puisse être requis pour des interactions précoces alors que celui en N-terminal puisse être nécessaire à la signalisation suivant l'activation du récepteur.

Measurement of exercise cardiac output (Qc) in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is limited by the availability of accurate, reliable and practical non-invasive techniques. The purpose of this investigation was to compare three techniques, two of which are lung-diffusion-based (CO2 and Innocor® inert-gas rebreathing) and one using thoracic impedance cardiography (Physioflow®), for exercise Qc determination in 13 COPD patients (Gold II-III) and 11 age-matched controls (CTRL). Measurements were obtained during cycling at 20, 35, 50% peak power. Computation of Qc was based on arterial CaCO2, rate of N2O disappearance (Innocor®) and changes in thoracic impedance (Physioflow®). Test-retest reproducibility in COPD was also assessed for each technique.In CTRL, measured Qc for a given power output was similar to oxygen consumption-based predictions. In COPD, similar Qc were found for CO2-rebreathing and Physioflow®, whereas Innocor® resulted in systematically lower Qc. Interestingly, computation of CO2-rebreathing-derived Qc using end-tidal and not PaCO2 revealed similar Qc values to Innocor®. Reproducibility was high for CO2-rebreathing, Innocor® and Physioflow® (R2= 0.58,0.78,0.88 respectively).In conclusion, CO2-rebreathing with direct CaCO2 input and Physioflow® resulted in concurrent exercise Qc values. However, given its high reproducibility combined with patient-free application advantage, Physioflow® stands as a preferred choice for investigating exercise circulatory limitations in COPD. / La mesure du débit cardiaque (Qc) à l'effort chez les patients MPOC est limitée par la disponibilité des techniques non-invasives valides et fiables qui parviennent à détourner les anomalies de ventilation-perfusion. Cette étude a comparé trois techniques, dont deux sont basées sur la diffusion pulmonaire (respiration en circuit fermé de CO2 et de gas inerte avec l'Innocor ® et l'autre utilise l'impédancemetrie thoracique (Physioflow®), afin de déterminer le Qc chez 13 patients MPOC (GOLD II-III) et 11 participants contrôles (CTRL) du même âge. Les mesures ont été obtenues sur ergocycle à 20, 35 et 50% de la puissance maximale. Le calcul du Qc a été basé sur le CaCO2 artériel, la vitesse de disparition du N2O (Innocor®) et les changements d'impédance thoracique (Physioflow®). La reproductibilité test-retest chez les MPOC a aussi été évaluée pour chaque technique. C'est les CTRL, le Qc mesuré à une puissance donnée était similaire à la prédiction basée sur la consommation d'oxygène. C'est les MPOC, des valeurs similaires de Qc ont été trouvées entre la respiration en circuit fermé de CO2 et Physioflow®, tandis que le Qc avec l'Innocor® était systématiquement plus bas. Il est intéressant de noter que le Qc obtenus par respiration en circuit fermé de CO2 avec le PetCO2 et non le PaCO2 a révélé des valeurs de Qc similaires à celle obtenus avec l'Innocor®. La reproductibilité était élevée pour respiration en circuit fermé de CO2, l'Innocor® et le Physioflow® (R2= 0.58, 0.78, 0.88 respectivement).En conclusion, la respiration en circuit fermé de CO2 avec la mesure directe du CaCO2 et le Physioflow® ont apportés des valeurs comparables de Qc pendant l'exercice. Cependant, étant donné sa grande reproductibilité et ses avantages d'utilisation, le Physioflow® est le choix de préférence pour investiguer les limitations circulatoires pendant l'effort chez les patients MPOC.

Mutational disruption of the genes clk-1 and isp-1, the products of which are involved in mitochondrial oxidative phosphorylation, has been shown to extend lifespan in the nematode worm Caenorhabditis elegans. Here, we describe efforts to characterize the effects of disrupting the mammalian homologues of these genes on the aging process and on the age-dependent disease atherosclerosis. Mice with a single copy of Mclk1 (the mammalian homologue of clk-1), a gene that encodes a mitochondrial enzyme required for the biosynthesis of ubiquinone, have been shown to live longer than wild-type mice. The prolonged survival implies a decreased mortality from age-dependent lethal pathologies. Atherosclerosis is one of the main age-dependent pathologies in humans. However, we found that Mclk1 heterozygosity did not protect against atherosclerosis, dyslipidemia or oxidative stress in two mouse models of the disease. Furthermore, an atherosclerosis-susceptible genetic background suppressed the lifespan-promoting effects of Mclk1 heterozygosity. These findings indicate that although Mclk1 heterozygosity can extend lifespan of mice, it does not necessarily protect against atherosclerosis. Moreover, in the presence of hyperlipidemia and chronic inflammation, Mclk1 heterozygosity is incapable of extending lifespan. isp-1, and its mammalian homologue Risp (aka UQCRFS1), encode the Rieske iron-sulfur protein, a core component of the ubiquinol:cytochrome c – oxidoreductase (complex III of the mitochondrial electron transport chain). In order to determine if the effect of Risp disruption on lifespan is conserved in mammals, we obtained "knock-in" mice with the same missense mutation as in isp-1 mutant worms. Homozygous mutant mice were non-viable, whereas heterozygotes (Risp+/-) were healthy with decreased RISP protein and a small but clearly significant deficit in the enzymatic activity of complex III. Risp+/- mice exhibited a mild mitochondrial dysfunction sufficient to decrease overall metabolic rate. Risp heterozygosity also increased spontaneous activity of male, but not female mice. Although lifespan of Risp+/- males was shortened, the maximum (but not median) lifespan of Risp+/- females was increased. In both sexes, Risp heterozygosity slowed the age-related increase in mortality rate. This study demonstrates that mitochondrial impairments not sufficient to cause overt mitochondrial disease nonetheless have the potential to exert significant positive or negative effects on lifespan. / L'inactivation des gènes clk-1 et isp-1, codant tous deux pour des protéines mitochondriales impliquées dans le processus de phosphorylation oxydative, a été démontrée comme augmentant la durée de vie du nématode Caenorhabditis elegans. La présente étude décrit les effets résultants de l'inactivation des homologues de ces gènes chez les mammifères sur le processus du vieillissement ainsi que sur une des principales pathologies reliées au vieillissement, l'artériosclérose. Les souris ne possédant qu'une seule copie fonctionnelle du gène Mclk1, l'homologue du gène clk1 qui code pour une enzyme impliquée dans la formation de l'ubiquinone, ont été montrées comme vivant plus longtemps que des souris de type sauvage. Cette prolongation de la durée de vie implique certainement une diminution de la mortalité reliée à diverses pathologies communément associées au vieillissement. Chez l'humain, l'artériosclérose est une des principales pathologies que l'on retrouve dans cette catégorie. Toutefois, cette étude n'a pas été en mesure de démontrer qu'une perte de fonction du gène Mclk1 confère une quelconque protection contre l'artériosclérose, la dyslipidémie ou le stress oxydatif chez deux lignées de souris modèles pour cette pathologie. Ces résultats démontrent que l'extension de la durée de vie observée chez les mutants Mclk1 +/- n'implique donc pas une augmentation de la protection contre l'artériosclérose. De plus, cette étude révèle qu'une diminution de l'expression du gène Mclk1 ne résulte pas en une prolongation de la durée de vie en présence d'hyperlipidémie ou d'inflammation chronique. Isp-1, de même que son homologue Risp (UQCRFS1) chez les mammifères, code pour la protéine fer-soufre Rieske, une composante de la ubiquinol : cytochrome c – oxydoréductase principalement reconnue comme étant le complexe III de la chaîne de respiration mitochondriale. Dans l'objectif de déterminer les effets de la perte de fonction Risp sur la durée de vie, des souris mutantes contenant exactement la même mutation faux-sens présente chez les vers mutants pour ce gène ont été générées. Ces souris homozygotes mutantes présentent un phénotype de mortalité embryonnaire alors que les souris hétérozygotes sont viables et sont notamment caractérisées par une baisse des niveaux d'expression de la protéine RISP et de l'activité du complexe I. La fonction mitochondriale est également diminuée chez les souris Risp+/- et elle est jumelée à une diminution significative de l'activité métabolique globale. Les niveaux d'activité spontanée sont élevés chez les souris mâles Risp+/- mais sont inchangés chez les femelles. Bien que la durée de vie des mâles Risp+/- soit plus courte, la durée de vie maximale se trouve augmentée chez les femelles. Une diminution du taux de mortalité en fonction de l'âge a de plus été observée chez les souris hétérozygotes mâles et femelles. Cette étude démontre donc qu'une diminution de la fonction mitochondriale ne résultant en aucune pathologies observables peut néanmoins avoir le potentiel d'exercer des effets bénéfiques sur le vieillissement des individus affectés.

Molecular Mechanisms Underlying the Regulation of Na+/H+ Exchanger Isoform 1 by Calcineurin B Homologous Protein 3: Restoration of cardiac intracellular pH (pHi) following acidification is of crucial importance for maintenance of myocardial contractility. The major mechanism responsible for this is the function of the sodium/hydrogen exchanger isoform 1 (NHE1) which is the primary isoform of mammalian myocardium. However, elevated activity and expression of NHE1 is also detrimental in numerous diseases of the heart and studies have documented its role in cardiac hypertrophy and heart failure as well as exacerbation of myocardial injury during periods of ischemia/reperfusion. Furthermore, a vast amount of research over the past decade has demonstrated that inhibition of NHE1 by pharmacological antagonists attenuates both ischemic/reperfusion damage as well as hypertrophy. Regulation of the exchanger occurs primarily through its interaction with numerous proteins and biomolecules. One such novel partner is the Ca2+-binding protein CHP3/tescalcin, a member of the calcineurin B homologous protein family, which, unlike isoforms CHP1 and 2, is predominantly restricted to the heart in adult human tissue.By utilizing both in vitro and in vivo binding assays as well as confocal fluorescent microscopy in concert with mutational analysis of the regulatory C-terminal motif of NHE1, we determined that CHP3 binds the NHE1 at the juxtamembrane region of the exchanger that is identical to the region that interacts with the other CHP isoforms. Furthermore, functional analysis of the exchanger expressed in NHE-deficient Chinese hamster ovary AP-1 cells, determined that CHP3 upregulates NHE1 by accelerating both biosynthetic maturation and cell surface stability of the exchanger.The CHP proteins have been shown to be N-myristoylated, and belong to the EF-hand superfamily of Ca2+-binding proteins. By mutating the N-myristoylation domain as well as the sole functioning EF-hand motif, both the upregulation of NHE1 activity was ablated along with the cell surface stability of the exchanger. We determined that although neither site is required for the interaction with NHE1 or for promoting the maturation of the exchanger, both are necessary to stabilize NHE1 at the cell surface, thereby optimizing its plasmalemmal expression and activity. Furthermore, our results suggest that CHP3 is a member of the Ca2+-myristoyl switch protein family since mutation of either motif by itself resulted in identical regulation of the exchanger, but mutation of both sites in concert does not compound the decrease in exchanger activity or stability.NHE1 maintains a distinct distribution within the myocardium where it is localized predominantly to the intercalated disks and transverse t-tubules, but not the sarcolemmal membrane. However, upon low flow ischemia/reperfusion or depletion of cellular ATP, NHE1 rapidly redistributes to the lateral sarcolemmal membranes. Furthermore ATP-depletion in AP-1 cells expressing NHE1 results in a decrease in Na+/H+ exchange activity which correlates partially to a dephosphorylation and depletion of the plasma membrane phosphoinositide, phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Our results demonstrate ATP-depletion also causes in a rapid decrease in NHE1 at the cell surface of exchanger expressing AP-1 cells that correlates with the rapid inhibition of exchange activity. Furthermore, CHP3 over-expression is unable to stabilize the exchanger at the cell surface during episodes of ATP-depletion. / Mécanismes moléculaires de la régulation de l'échangeur Na+/H+ isoforme 1 par la protéine 3 homologue de la calcineurine B: La récupération du pH intracellulaire (pHi) des cellules cardiaques suivant une acidification est d'importance cruciale pour le maintien de la contractilité myocardique. L'isoforme de l'échangeur sodium/proton (NHE1) qui est l'isoforme principal dans le myocarde des mammifères, en est le principal acteur. Cependant, une activité et une expression élevées de NHE1 est nuisible dans plusieurs pathologies cardiaques. En effet, de nombreuses études ont démontré son rôle au niveau de l'hypertrophie et de la défaillance cardiaques de même que dans l'aggravation des dommages myocardiques durant les périodes d'ischémie/reperfusion. En outre, un grand nombre de recherches effectuées durant la dernière décennie ont montré que l'inhibition de NHE1 par des agents pharmacologiques atténue les dommages causés par l'ischémie/reperfusion de même que via l'hypertrophie. La régulation de l'échangeur s'effectue principalement via son interaction avec de nombreuses protéines et biomolécules. La protéine liant le Ca2+ soit CHP3/Tescalcine, un membre de la famille des protéines homologues à la calcineurin B chez l'humain adulte est une de ces nouvelles molécules. Contrairement aux isoformes CHP1 et 2, l'espression CHP3/Tescalcine est principalement limitée au coeur.Via des essais in vitro et in vivo d'ancrage, de même qu'à l'aide de la microscopie confocale à fluorescence, de concert avec des analyses par mutations de la partie régulatrice C-terminale de NHE1, nous avons déterminé que CHP3 se lie à la région juxtamembranaire de l'échangeur (NHE1) qui est identique à celle qui interagit avec les autres isoformes CHP. De plus, des analyses fonctionnelles de l'échangeur exprimé dans les cellules AP-1 d'ovaires de hamster chinois déficientes en NHE, ont déterminé que CHP3 module positivement NHE1 en accélérant à la fois la synthèse et la maturation de la protéine, et en stabilisant l'échangeur à la membrane plasmique.

Fetal tracheal occlusion (TO) has been investigated as a treatment option for lung hypoplasia secondary to congenital diaphragmatic hernia (CDH). TO has been shown to accelerate lung growth but its effect on bronchial branching is unknown. In this study we characterized the effects of in vitro TO on bronchial branch development in fetal lung explants derived from the Nitrofen rat model of CDH and on the expression of four molecular markers involved in lung development (FGF10, SHH, VEGF, LGL1). Nitrofen administration induced lung hypoplasia as shown by decreased airway branching in fetal lung explants and decreased expression of FGF10. TO In vitro TO performed at E14 increased bronchial branching in both control and Nitrofen- exposed hypoplastic lungs. In addition, TO increased airway branching in Nitrofen-exposed explants to control levels suggesting that early TO reverses the lung hypoplasia seen in this model. TO did not affect the expression profile of our four selected growth factors. / L'occlusion trachéale fœtale (OT) a été décrite en tant que traitement potentiel de l'hypoplasie pulmonaire secondaire à la hernie diaphragmatique congénitale. Même s'il a été démontré que l'occlusion trachéale induit une croissance accélérée des poumons, l'effet de l'OT sur le développement des bronches demeure inconnu. Dans cette étude nous décrivons les effets de l'OT in vitro sur le développement des poumons de foetus de rats affectés par l' hypoplasie pulmonaire induite par le Nitrofen et sur l'expression de quatre gènes impliqué dans le développement des poumons. L'administration de Nitrofen cause l'hypoplasie pulmonaire, une réduction de la ramification bronchique et un délai dans le profil d'expression de FGF10. Au quatorzième jour embryologique, l'OT in vitro augmente le développement des bronches des poumons fœtals contrôles et hypoplasiques, ramenant ces derniers au niveau des poumons contrôles. Ceci suggère que l'OT renverse l'hypoplasie pulmonaire dans ce modèle animal de hernie diaphragmatique congénitale. Cependant l'OT n'a pas changé le profil d'expression de nos quatre gènes sélectionnés.

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