Human activities such as eutrophication and pollution are increasing the frequency and intensity of aquatic hypoxia (low dissolved oxygen) worldwide. Recent studies have demonstrated that hypoxia can impair reproduction in fish; however, studies to date have focused on short term exposures in species that do not experience hypoxia in their natural environment. In this thesis, I investigated the effect of hypoxia on sex hormone levels in the African mouth-brooding cichlid, Pseudocrenilabrus multicolor victoriae. In Chapter one, I validated a non-invasive holding water technique of hormone measurement for use with P. multicolor. In Chapter two, I applied this technique to investigate the effect of hypoxia on sex hormones in female P. multicolor sampled across the reproductive cycle in a long-term laboratory acclimation to hypoxia, and at the time of capture in a field survey of populations exposed to life-long hypoxia. Results from Chapter one demonstrate that repeated use of the holding water technique is not detectably stressful to P. multicolor, and that holding water measures of testosterone and estradiol provide a biologically robust and reliable index of plasma hormone levels. Results from Chapter two demonstrate that hypoxia does not affect sex hormone levels in P. multicolor exposed to low versus high dissolved oxygen conditions in the lab. Comparisons of field populations of P. multicolor from two high and two low dissolved oxygen sites indicated higher testosterone levels, a higher testosterone/estradiol ratio, and a lower percentage of brooding females in P. multicolor captured from the low dissolved oxygen field sites. Taken together, these results suggest that chronic or lifelong exposure to hypoxia may provide compensatory mechanisms, and that fishes may exhibit a threshold response when dealing with the energetic demands of hypoxia. / Les activités anthropiques, telles que l'eutrophisation et la pollution, augmentent la fréquence et l'intensité de l'hypoxie aquatique (taux faible d'oxygène dans l'eau) à travers le monde. Des études récentes démontrent que l'hypoxie peut nuire à la reproduction des poissons. Cependant, ces études se concentrent exclusivement sur l'exposition à court terme des espèces de poissons qui ne sont pas soumis à l'hypoxie dans leurs environnements naturels. Dans cette thèse, j'ai examiné l'effet de l'hypoxie sur les hormones sexuelles dans des populations de cichlidés d'Afrique avec couvaison buccale, Pseudocrenilabrus multicolor victoriae. Dans mon premier chapitre, j'ai validé une technique non-invasive de mesure d'hormone de P. multicolor dans l'eau de leurs bassins de rétention. Dans mon deuxième chapitre, j'ai appliqué cette technique pour déterminer l'effet de l'hypoxie sur les hormones sexuelles des P. multicolor femelles, au travers de leur cycle reproductif. J'ai utilisé cette technique dans une étude d'acclimatation à l'hypoxie à long terme dans un laboratoire et au moment de capture lors d'une étude dans un milieu naturel où les populations de poissons sont continuellement exposées à l'hypoxie. Les résultats du Chapitre un démontrent que l'utilisation répétée de la technique de rétention d'eau n'est pas stressante pour P. multicolor. De plus, mes résultats certifient que le taux de testostérone et d'estradiol mesuré dans les eaux du bassin de rétention sont des index biologiquement robustes et fiables des niveaux d'hormones dans le plasma des poissons. Les résultats du Chapitre deux démontrent que, lors d'études de laboratoire, l'hypoxie n'affecte pas le taux d'hormones sexuelles produites par P. multicolor exposé à des niveaux différentiels d'oxygène. Lors de la comparaison de populations naturelles de P. multicolor de sites avec les niveaux d'oxygène élevés et faibles, je constate que les femelles P. multicolor des sites moin oxygénés produisent plus de testostérone, ont un ratio de testostérone/estradiol plus élevé et ont un plus petite pourcentage de femelles en couvaison. Pris dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que l'exposition de l'hypoxie à long terme peut fournir des mécanismes compensatoires, où les poissons ont un seuil de réponse lorsqu'il s'agit des demandes énergétiques de l'hypoxie.

To develop an optimal cognitive neural prosthetic to assist patients with motor dysfunction we must have the ability to accurately decode reach goals from patient's neural activity. Implantable microelectrode arrays are often used to record neural activity. A challenge researchers typically face when using arrays is that only a small number of neurons can be isolated for recording. Moreover, these neurons tend to over-represent certain spatial locations while under-representing others, thereby outputting a bias towards only a portion of reachable directions. Several studies using brain-machine interface (BMI) experiments have shown that subject's neural activity undergoes a functional reorganization in response to constraints imposed by a BMI. In this study, we investigated whether we could use reward to not only actively induce the reorganization of neural activity, but also guide it to increase the amount of information extracted from a neural population. To address this, we recorded neural activity using 96 electrodes implanted in parietal and pre-motor areas of a Rhesus macaque monkey. We designed a brain-control task in which an adaptive Bayesian decoder used this activity to predict the intended reach goals of the monkey. A successful brain-control trial was established when the decoder predicted the instructed reach goal, for which the monkey was rewarded with juice. Real-time visual feedback of decode performance was provided by a visual cue. Decode performance also determined the size of the reward to be received. Our findings show that decoding performance improved over the course of a recording session and that this improvement coincided with both changes in neural firing activity as well as a more uniform distribution in the neuronal representation of reach space. These results suggest that reward can be used to actively induce neural changes that increase the amount of information that can be extracted from the brain to subsequently improve decoding. / Pour développer une prothèse neurale basée sur la cognition qui aiderait les patients souffrant de dysfonction moteur, nous devons être capable de décoder les intentions de mouvements des patients à partir de leur activité cérébrale. Des matrices de microélectrodes sont fréquemment employées pour échantillonner l'activité des neurones. Un défi auquel font habituellement face les chercheurs, lorsqu'ils utilisent des matrices de microélectrode, est que seul un petit ensemble de neurones peut être isolé et échantillonné adéquatement. De plus, ces neurones ont tendance à surreprésenter certaine région de l'espace et à présenter un manque dans la représentation des autres. Il y a donc un biais dans la représentation de l'espace dans lequel s'effectue normalement les mouvements. Plusieurs études réalisées sur des expériences impliquant des interfaces cerveau-machine (ICM) ont rapporté que l'activité des neurones des sujets entreprend une réorganisation fonctionnelle, suite aux contraintes imposées par l'ICM. Dans cette étude, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle nous pourrions utiliser la récompense pour, non seulement induire activement une reconfiguration de l'activité, mais aussi pour guider la réorganisation fonctionnelle de façon à ce qu'elle résulte en une augmentation de la quantité d'information qui peut être extraite d'une population de neurones. Pour ce faire, nous avons échantillonné l'activité des neurones du cortex pariétal et de l'aire pré-moteur d'un macaque Rhésus en y implantant 96 électrodes. Nous avons conçu une tâche de contrôle par la pensé dans laquelle un décodeur Bayesien adaptatif utilise l'activité des neurones pour prédire les intentions de mouvement du bras du singe. Lors des essais fructueux, le singe a été récompensé par du jus. Au cours d'un essai, une indication visuelle délivrée en temps réel informait le singe de la performance du décodeur à déduire ses intentions. La performance du décodeur fixait la quantité de jus donnée au singe en récompense. Nos résultats démontrent que les performances du décodeur ont augmenté au cours du déroulement de l'expérience en même temps que les changements dans l'activité des neurones ont entraîné une représentation plus uniforme de l'espace. Ces résultats suggèrent que la récompense peut-être utilisée pour induire des changements dans l'activité des neurones qui améliore les performances d'un décodeur en augmentant la quantité d'information qui peut-être extraite de l'activité cérébrale.

Juvenile hemochromatosis (JH), anemia of chronic disease (ACD) and various inflammatory conditions such as Hepatitis C and alcoholic steatohepatitis exhibit improper handling of systemic iron. Patients with JH have mutations in either the hemojuvelin (Hjv) or hepcidin genes. Hjv appears to control the levels of hepatic hepcidin, the master hormonal regulator of iron stores. Interestingly, Hjv exists in both a cellular and soluble form that is expressed primarily in the muscle and to a lesser extent in the liver. Cellular Hjv (cHjv), localized in the liver, is a GPI-anchored protein that enhances bone morphogenic protein (BMP) mediated induction of hepcidin. On the other hand, soluble Hjv (sHjv) is a negative regulator of hepatic hepcidin expression. We hypothesize that sHjv plays an important systemic role in regulating iron homeostasis. Thus, our goal was to 1) investigate the signals regulating shedding of muscle sHjv and 2) study the hormonal function of sHjv in the target liver. Surprisingly, using in vitro and in vivo models, we observed elevated release of Hjv during hemolytic conditions. Furthermore, in contrast to previously published reports, both cell culture and animal model studies reveal sHjv as a positive regulator of hepatic hepcidin. Upon induction of hepcidin expression in the liver, the hormonal peptide exerts its actions by binding and internalizing the iron exporter ferroportin in the reticuloendothelial system (RES) and duodenum. Using a co-culture system, we investigated the effects of secreted hepatic hepcidin on the iron metabolism of target monocytes. As a result, hepatic hepcidin was shown to inhibit iron export and promote iron retention within monocytes. Inappropriate levels of hepcidin, whether low or high, results in improper handling of iron stores which may potentially cause disease, on both sides of the iron spectrum. On one side of the scale, such as in hemochromatosis, inappropriately low hepcidin expression permits elevated mob / L'hemochromatose juvénile (HJ), anémie de maladie chronique (ACD) et des conditions inflammatoires variées, telles que l'Hépatite C et la steatopathie de l'alcoolique démontrent la mauvaise manipulation du fer systémique. Les patients atteints de l'HJ ont des mutations dans soit, les gènes hemojuvelin (Hjv) ou hepcidine. Jusqu'à maintenant, Hjv semble contrôler les niveaux d'hepcidine hépatique, le régulateur maître pour les réserves de fer. D'autre part, l'Hjv soluble (sHjv) est un régulateur négatif d'expression d'hepcidine hépatique. Nous avons élaboré l'hypothèse que le sHjv joue un rôle systémique important dans la régulation d'homeostasie du fer. Alors, notre objectif était de 1) rechercher les signaux régulant la perte de muscle sHjv et 2) d'étudier la fonction hormonale du sHjv dans le foie cible. Étonnement, en utilisant des modèles in vitro et in vivo, nous avons observé la perte élevée de Hjv pendant des conditions hémolytiques. De plus, en contraste à des rapports précédemment publiés, les cultures cellulaires ainsi que les modèles basés sur les animaux révèlent que la sHjv et un régulateur positif d'hepcidine hépatique. Dès l'induction d'expression d'hepcidine dans le foie, la peptide hormonale exerce son action en fusionnant et en internalisant l'exportateur de fer, ferroportine dans le système réticuloendothélial (RES). En utilisant un système de co-culture, nous avons cherché les effets d'hepcidine hepatique secrété sur le métabolisme du fer de monocytes cibles. Des niveaux inappropriés de hepcidine, soit bas ou élevés, résultent dans la manipulation inappropriée des réserves de fer qui peuvent potentiellement mener à des maladies, des deux côtes du spectre de fer. D'un côté de la balance, tel que dans l'hémochromatose, des niveaux bas d'expression d'hepcidine permettent des niveaux de mobilisation élevés dans les réserves de fer du RES. La mobilisation accrue sature éventuellement s

Anion transport drives fluid into the airways and is essential for humidifying inspired air and supplying surface liquid for mucociliary transport. Despite the importance of airway secretion in diseases such as cystic fibrosis, the cellular mechanisms of anion and fluid secretion remain poorly understood. To clarify these mechanisms, I studied the Calu-3 cell line, a widely used model for serous cells in airway submucosal glands.First, I studied anion transport using a technique which combines electrical measurement of ion transport and pH-stat. Although a small fraction of the Cl- secretion required basolateral entry through Na+, K+, 2Cl- cotransporter NKCC, I found that most Cl- uptake was mediated by basolateral Cl-/HCO3- exchange. The HCO3- required for this exchange process was supplied by the basolateral Na+, HCO3- cotransporter NBC and also by the hydration of CO2, which was catalyzed by carbonic anhydrase. The data were consistent with most HCO3- and Cl- secretion occurring via apical CFTR channels. Based on these findings, I propose a new model for transepithelial anion secretion, which may explain early studies in the 1980's which indicated that most tracheal submucosal gland secretion is surprisingly insensitive to bumetanide.This new scheme for anion transport was further tested using fluid secretion assays and was found to explain the ion dependencies and pharmacology of fluid secretion. Moreover, fluid was actively secreted in the first 6 hours during the 24-h fluid secretion assay, and secretions collected during that period had higher osmolality than the culture medium. These results suggest that airway surface fluid is regulated by osmolality and the water flux simply depends on the total amount of osmotically active solute on the apical surface.Finally, I explored the role of carbonic anhydrases because inhibitor studies indicated that it is critically important for anion transport by Calu-3 cells. I found that several isoforms of carbonic anhydrases are expressed in Calu-3 cells, namely CAII, CAIX and CAXII. Inhibitor studies revealed that CAIX is not required for anion transport. CAII is probably the isoform involved in bicarbonate secretion, although further studies are needed to exclude the involvement of CAXII. Taken together, these present findings support a novel cellular mechanism for anion and fluid secretion by Calu-3 cells. This scheme may be applicable to airway submucosal glands which control the pH, volume, and composition of airway surface liquid and are critical for airway host defense. / Le transport d'anions entraîne le fluide dans les voies aériennes et est essentiel pour l'humidification de l'air inspiré et pour apporter du liquide de surface nécessaire au transport mucoscilliaire. Malgré l'importance de la sécrétion au niveau des voies respiratoires dans le cas de maladies telles que la fibrose kystique, les mécanismes cellulaires de la sécrétion d'anions et de fluide ne sont pas tout à fait élucidés. Afin de clarifier les mécanismes, j'ai utilisé la lignée cellulaire Calu-3, un modèle connu de cellules séreuses dans les glandes submucosales des voies aériennes.En premier lieu, j'ai étudié le transport d'anions en utilisant une technique combinant la mesure électrique de transport d'ions et le pH-stat. Bien qu'une petite fraction de sécrétion de Cl- requiert l'entrée par le co-transporteur basolatéral Na+, K+, 2Cl- NKCC, j'ai démontré que la plupart de l'apport de Cl- est médié par l'échange Cl-/HCO3-basolatéral. Le HCO3- requis pour cet échange est apporté par le co-transporteur basolatéral Na+, HCO3- NBC et également par l'hydratation de CO2, qui est catalysée par l'anhydrase carbonique. Les données corrèlent avec la plupart de la sécrétion de HCO3- et Cl- par les canaux CFTR apicaux. D'après ces résultats, je propose un nouveau modèle de sécrétion transépithéliale d'anions, qui pourrait expliquer des études précédentes datant des années 1980, qui indiquaient que la sécrétion des glandes submucosales de trachée est majoritairement insensible au bumétanide.Ce nouveau modèle de transport d'anions a ensuite été testé par la méthode de sécrétion de fluide et a permis d'expliquer les dépendances en ions et la pharmacologie de la sécrétion de fluide. Aussi, le fluide est activement secrété pendant les 6 premières heures au cours d'un essai de sécrétion de fluide sur 24 heures, et les secrétions collectées pendant cette période ont une osmolarité plus importante que le milieu de culture. Ces résultats suggèrent que le fluide de surface des voies aériennes est régulé par l'osmolarité et que le flux d'eau dépend simplement de la quantité totale de soluté osmoticallement actif à la surface apicale.Enfin, j'ai étudié le rôle des anhydrases carboniques car mes expériences d'inhibition démontrent son importance dans le transport d'anions par les cellules Calu-3. J'ai mis en évidence qu'il existe trois isoformes d'anhydrases carboniques exprimées dans les cellules Calu-3 : CAII, CAIX et CAXII. Des expériences d'inhibition ont révélé que CAIX n'est pas impliqué dans le transport d'anions. CAII est probablement l'isoforme impliqué dans la sécrétion de bicarbonate, bien que des expériences complémentaires soient nécessaires pour exclure l'implication de CAXII.Pour conclure, ces résultats appuient un nouveau mécanisme cellulaire de sécrétion d'anions et de fluide par les cellules Calu-3. Ce modèle pourrait être applicable aux glandes submucosales des voies respiratoires qui contrôlent le pH, le volume et la composition du liquide de surface des voies aériennes et qui sont essentielles à leur défense.

Ubiquinone (Coenzyme Q, UQ or CoQ) is a small lipophilic molecule which is essential for all life forms that rely on mitochondrial respiration for energy production. It functions as an electron carrier in the respiratory chain and plays a role in many other cellular functions as well. In the past decade, an increasing number of patients have been described to have a genetic defect in UQ biosynthesis and present with severe and diverse clinical manifestations, making UQ research relevant to patient care. This thesis focuses on a particular enzyme of the UQ biosynthetic pathway in mice, which is encoded by the Mclk1/Coq7 gene and is responsible for the penultimate step of UQ biosynthesis: the hydroxylation of DMQ (demethoxy-UQ). I generated three conditional Mclk1 knockout (KO) models which are able to bypass the embryonic lethality of Mclk1 and allow us to examine the consequences of complete loss-of-function of Mclk1 in vitro and in vivo in adult animals. First, we created Mclk1 KO mouse embryonic fibroblasts (MEFs) in vitro. These cells do not synthesize UQ and accumulate DMQ. They are viable under standard (glucose) culture conditions. More interestingly, despite lacking UQ, they still have a functionally active electron transport chain. To understand this surprising phenomenon, we generated Pdss2 KO MEFs which are devoid of both DMQ and UQ. To our surprise, Pdss2 KO MEFs also are still capable of carrying out mitochondrial respiration. These observations suggest that 1) the respiratory phenotype of Mclk1 mutants can be considered essentially as a UQ-deficiency phenotype, and 2) mitochondrial respiration can occur in the absence of UQ. Mclk1 KO MEFs cannot survive in medium containing galactose instead of glucose as this forces cells to mostly rely on mitochondrial ATP production to sustain their viability. These characteristics make them a unique tool for testing the efficacy of UQ analogues in promoting electron transport in mammalian mitochondria. Next, we generated a mouse model with liver-specific loss of Mclk1. A large depletion of UQ in hepatocytes was found to cause only a mild impairment of respiratory chain function and no gross abnormalities. Therefore, liver mitochondrial function appears to have a high tolerance of severe UQ deficiency. Using this model, we also demonstrated that dietary UQ10 can functionally rescue the endogenous UQ deficiency of Mclk1 KO liver at the respiratory chain level. Furthermore, we generated an inducible Mclk1 KO model in which Mclk1 was knocked out in adult mice. These animals have a median survival time of 9 months after induction of global KO of the Mclk1 gene. We observed a very slow gradual decrement of tissue UQ contents after inducing the ablation of Mclk1, which could explain the slowly progressive phenotype in these mice. In the heart, kidneys and skeletal muscles severe deficits of UQ were found to severely impair mitochondrial respiration. Therefore, unlike the liver, the kidneys and muscle tissues need high levels of UQ to sustain sufficient respiratory function. I examined the efficacy of dietary UQ10 supplementation against the global KO model and found that dietary UQ10 cannot be taken up by other organs beside the liver, and accordingly it was almost completely ineffective in rescuing the Mclk1 KO phenotype. On the other hand, feeding the mutant animals with 2,4-dihydroxybenzoic acid, a synthetic analogue of the UQ ring precursor 4-hydroxybenzoic acid (4-HB), led to dramatic rescue of disease phenotypes in these animals, including their early lethality. 2,4-diHB structurally differs from 4-HB by having one more hydroxyl group at the position where the MCLK1 enzyme would catalyze the hydroxylation of DMQ. This finding suggests that some types of primary UQ deficiency could be relieved by treatment with the appropriate unnatural precursors, and more generally, that biosynthetic "by-pass" precursors could be a new treatment strategy for biosynthetic pathway defects. / L'ubiquinone (coenzyme Q, UQ, CoQ) est essentielle pour toutes les formes de vie qui s'appuient sur la respiration mitochondriale pour la production d'énergie. Elle fonctionne comme un transporteur d'électrons dans la chaîne respiratoire mitochondriale (ETC) et joue un rôle dans de nombreuses autres fonctions cellulaires. Au cours de la dernière décennie, un nombre croissant de patients ont été décrits comme ayant un défaut génétique produisant un problème de synthèse de l'UQ et présentant des manifestations cliniques graves et diversifiées. Ma thèse s'est concentrée sur une enzyme particulière de la synthèse de l'UQ chez la souris, codée par le gène Mclk1/Coq7 et responsable de l'hydroxylation du DMQ (demethoxy-UQ). Ici je décris 3 modèles de knockout (KO) conditionnels que j'ai créés qui permettent de contourner la létalité embryonnaire de Mclk1. Ces modèles nous permettent d'examiner les conséquences de la perte complète de la fonction de Mclk1 in vitro et in vivo chez les animaux adultes. Premièrement, j'ai créé des lignées de fibroblastes embryonnaires (MEFs) de souris KO pour Mclk1. Ces cellules ne synthétisent pas d'UQ et accumulent le DMQ. Elles sont viables dans les conditions standards de culture et en présence de glucose. De plus, malgré le manque d'UQ, elles ont encore une ETC fonctionnelle. Pour comprendre ce phénomène, j'ai généré des MEFs KO pour Pdss2 qui sont dépourvus de DMQ et d'UQ. À notre surprise, ces cellules sont également capables de respiration mitochondriale. Ces observations suggèrent que 1) le phénotype respiratoire des mutants Mclk1 peut être considéré essentiellement comme un phénotype dû à un manque d'UQ, et 2) la respiration mitochondriale peut se produire en l'absence d'UQ. Les MEFs KO pour Mclk1 ne peuvent survivre dans un milieu qui les forcerait à dépendre de la respiration mitochondriale pour la production d'ATP. Ces caractéristiques font de ces cellules un outil unique pour tester l'efficacité des analogues de l'UQ dans la ETC de mammifères. J'ai aussi créé un modèle de souris produisant une ablation hépatique de Mclk1. Il est intéressant de noter qu'une perte sévère d'UQ dans les hépatocytes ne cause qu'une diminution légère de l'activité de la ETC et que les souris ne présentent aucune anomalie flagrante. Par conséquent, la fonction mitochondriale du foie semble être capable de tolérer de graves carences en UQ. En utilisant ce modèle, nous avons aussi démontré que de l'UQ10 exogène peut être utilisé par le foie et rétablir la fonction de la ETC. J'ai aussi construit un modèle pour lequel Mclk1 est absent chez les souris adultes. Ces animaux ont une survie moyenne de 9 mois après la perte totale de Mclk1. Une très lente diminution du contenu en UQ des tissus après l'ablation de Mclk1 a été observée, ce qui pourrait expliquer la détérioration très lente de ces souris. J'ai trouvé que dans le cœur, les reins et les muscles squelettiques de profonds déficits en UQ compromettent gravement la respiration mitochondriale. Contrairement au foie il semblerait que ces tissus nécessitent de hauts niveaux d'UQ afin de maintenir une fonction respiratoire suffisante. J'ai trouvé que l'UQ10 exogène ne peut être utilisé que par le foie et que, même dans ce cas, il était presque totalement incapable d'aider les souris déficientes en Mclk1. Par contre, le traitement des animaux mutants avec l'acide 2,4 -dihydroxybenzoïque (2,4-diHB; un analogue synthétique de l'acide 4-hydroxybenzoïque (4-HB), qui est le précurseur naturel dans la biosynthèse de l'UQ) mène à une nette amélioration des symptômes de maladie des souris mutantes incluant la létalité précoce. Le 2,4 -diHB diffère structurellement du 4-HB par un groupe hydroxyle à la position où l'enzyme MCLK1 catalyse l'hydroxylation du DMQ. Ces données suggèrent que les symptômes de certaines déficiences en UQ pourraient être allégés par le traitement à l'aide de précurseurs non-naturels qui permettraient de contourner les voies de biosynthèses défectueuses.

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease affecting nearly 5 million of Canadians, with aneconomic impact of over $30 billion each year in direct and indirect costs. Pain is the prominent symptom of OA, yet its underlying mechanisms are not completely understood, leading to a lack of effective pain therapies. OA pain is manifested by a hypersensitivity to mechanical stimuli such as joint movement or palpation. Although the mechanical sensitization of pain-sensing nerve fibers, known as nociceptors, innervating the joint has been documented, the molecular and cellular mechanisms underlying this sensitization are currently unknown. The peripheral terminals of nociceptors express mechanosensitive ion channels (MSCs) that convert mechanical stimuli into depolarizing potentials. Our central hypothesis is that the sensitization of nociceptors to mechanical stimuli in OA can be explained by changes in the properties of these MSCs, whereby their activation threshold is reduced during the disease. Using the monoiodoacetate model of OA in mice, we demonstrate that mice develop chronic mechanical allodynia. Furthermore, cell–attached electrophysiological recordings of nociceptors isolated from OA mice indicate an increase in the current elicited by mechanical stimuli, as well as a reduced activation threshold of MSCs, when compared to naïve mice. An understanding of the molecular bases for these changes is presently impossible because the identity of the genes encoding MSCs isunknown. Interestingly, in a previous screen for MSC candidates, we identified five transmembrane proteins of unknown function (TMEMs). Our results indicate these candidates are expressed in sensory neurons and the mRNA of three of them is increased in OA. When expressed in COS-7 cells, two of these candidates, TMEM5B and TMEM1, caused an increase and decrease in cellular mechanosensitivity. This project will lead to a better understanding of the molecular mechanisms underlying arthritis pain. / L'ostéoarthrite (OA) est une maladie débilitante affectant près de 5 millions de Canadiens et ayant un impact économique de plus de 30 milliards de dollars en coûts directs et indirects. Bienque le symptôme principal de l'OA est la douleur, les mécanismes qui en sont responsables ne sont pas compris, et par conséquent, les thérapies effectives contre la douleur sont manquantes. La douleur causée par l'OA est manifestée par une hypersensibilité aux stimuli mécaniques tels le mouvement des jointures ou la palpation. Bien que la sensibilisation mécanique des fibres nerveuses qui détectent la douleur (nocicepteurs) innervant la jointure ait été documentée, les mécanismes moléculaires et cellulaires de base de la sensibilisation ne sont pas compris. Les terminaisons périphériques des nocicepteurs expriment des canaux ioniques mécanosensibles (MSCs) responsables de la conversion des stimuli mécaniques en potentiels dépolarisants. Notrehypothèse centrale est que durant l'OA, la sensibilisation des nocicepteurs aux stimulimécaniques peut être attribuée aux changements des propriétés de base des MSCs, où leur seuil d'activation est réduit lors de la maladie. Nous démontrons, en utilisant le modèle de monoiodoacetate de l'OA chez la souris, que cette dernière développe une allodynie mécaniquechronique. De plus, les enregistrements électrophysiologiques en configuration cellule-attachée faites à partir des nociceptors isolés des souris OA indiquent une augmentation du courant élicitépar les stimuli mécaniques, ainsi qu'une réduction dans le seuil d'activation des MSCs encomparaison aux souris naïves. Une compréhension de la base moléculaire de ces changements est présentement impossible car l'identité des gènes qui encodent les MSCs n'est pas connue. Dans des expériences antérieures, au cours desquelles nous avons fait un criblage différentiel afin d'identifier des candidats de MSC, nous avons identifié cinq protéines transmembranaires de fonctions inconnues (TMEMs). Nos résultats indiquent que ces candidats sont exprimés dans les neurones sensoriels et que l'ARNm de trois de ces derniers augmente durant l'OA. Lorsqu'exprimés dans les cellules COS-7, deux des candidats (TMEM5B et TMEM1) ont causé une augmentation et une diminution de la mécanosensibilité cellulaire. Ce projet nous donnera une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de base de la douleur arthritique.

Background & rationale. "Dyspnea" refers to the awareness of breathing discomfort that accompanies an increase in physical activity in health and across various diseases. It is arguably the most severe and burdensome symptom experienced by patients with chronic pulmonary disorders and is an important contributor to physical activity-limitation and adverse health outcomes, including hospitalization and death. Nevertheless, the mechanisms of dyspnea on exertion in health and disease remain partially understood. Accumulating evidence implicates neuromechanical uncoupling of the respiratory system as a likely mechanism of activity-related dyspnea, particularly in patients with chronic pulmonary diseases. According to this hypothesis, sensory intensity and unpleasantness ratings of dyspnea increase as a function of the widening disparity (as exercise progresses) between neural respiratory drive and the simultaneous response of the respiratory system, particularly as it relates to tidal volume (VT) expansion. An alternative and largely untested hypothesis states that the increased perception of dyspnea during exercise may reflect the awareness of increased neural respiratory drive needed achieve any given ventilation (V· E) in the presence of "abnormal" restrictive constraints on VT expansion. To date, the contribution of pathophysiological abnormalities in neural respiratory drive, dynamic respiratory mechanics and their interaction to the symptom of dyspnea during exercise in patients with chronic pulmonary disorders has proved difficult to study (beyond correlation) due to the presence of multiple co-morbidities that may independently contribute to the perception of dyspnea. Research Objectives. In light of the information cited above, the objectives of this research project were to better understand the physiological mechanisms of exertional dyspnea. Methods. This randomized cross-over study examined the acute effects of external thoracic restriction by chest wall strapping (CWS) – an accepted model of the "abnormal" restrictive constraints on VT expansion typical of patients with chronic pulmonary disorders - on detailed assessments of V· E, breathing pattern, dynamic respiratory mechanics, neural respiratory drive (as assessed by changes in the diaphragm electromyogram; EMGdi), and sensory intensity and unpleasantness ratings of dyspnea during symptom-limited incremental cycle exercise testing in 20 healthy, young men with normal lung function and cardiorespiratory fitness. Results. The key findings of this study include: [1] relatively greater dynamic mechanical constraints on VT expansion were evident during exercise with vs. without CWS; [2] EMGdi was consistently higher during exercise with vs. without CWS; [3] CWS had no effect on neuromechanical coupling of the respiratory system, as evidenced by relative preservation of the relationship between increasing EMGdi and VT expansion (adjusted for CWS-induced reductions in vital capacity) during exercise; [4] sensory intensity and unpleasantness ratings of dyspnea were significantly higher during exercise with vs. without CWS; and [5] CWS had no effect on the relationship between increasing EMGdi and each of the intensity and unpleasantness of dyspnea during progressive exercise. Conclusions & implications. We concluded that the increased perception of dyspnea during exercise with CWS could not be readily explained by increased neuromechanical uncoupling of the respiratory system, but that it likely reflected the awareness of increased neural respiratory drive needed to overcome the "abnormal" restrictive constraints on VT expansion. These findings may have implications for our understanding of the pathophysiological mechanisms of exertional dyspnea causation in patients with chronic restrictive lung disorders. This information, in turn, may aid in the development of more effective dyspnea relieving interventions for use in these patients. / Contexte et raisonnement. La «dyspnée» désigne une prise de conscience de gêne respiratoire se manifestant généralement à l'effort autant chez ceux en santé que ceux atteints de diverses maladies. Sans doute, il est symptôme le plus lourdement ressenti par patients atteints de maladies pulmonaires chroniques (MPC) pour son effet limitant sur l'activité physique et effet nocif sur la santé, y compris l'hospitalisation et la mort. Néanmoins, les mécanismes de la dyspnée d'effort en temps de santé et maladie restent que partiellement comprises. Des étudies ultérieurs suggèrent le découplage neuromécanique du système respiratoire comme mécanisme de dyspnée d'effort, en particulier chez patients atteints de MPC. Selon cette hypothèse, l'intensité sensorielle et le sentiment de malaise augmentent en fonction d'une disparité croissante entre pulsion respiratoire neuronale et réaction simultanée du système respiratoire, concernant notamment le volume courant (VT) d'extension. Une hypothèse alternative et largement non vérifiée suggère qu'une perception de la dyspnée élevée durant exercice reflète une prise de conscience d'une pulsion respiratoire neuronale nécessaire pour atteindre une ventilation (V· E) donnée lors de contraintes "anormales" sur l'expansion VT. À ce jour, la contribution des anomalies physiopathologiques sur la pulsion respiratoire neural, mécanique respiratoire dynamique et symptôme de la dyspnée au cours de l'exercice chez patients atteints de MPC s'est révélée difficile à étudier (au-delà de corrélation) en raison de présence de multiples comorbidités contribuant indépendamment à la perception de la dyspnée. Objectif. En guise de l'information présentée précédemment, nous tentons de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de dyspnée d'effort. Méthode. Cette étude randomisée, contrôlée et croisée a permis d'examiner les effets aigus de la restriction thoracique externe par le cerclage de paroi thoracique (chest wall strapping, CWS),- un modèle accepté qui assimile les contraintes restrictives "anormales" sur l'expansion du VT de patients avec troubles pulmonaires chroniques - sur la V· E, mode de respiration, mécanique respiratoire dynamique, pulsion respiratoire neural (évaluée par changements dans l'électromyogramme du diaphragme; EMGdi), cotes d'intensité sensorielle et malaise accompagnant la dyspnée au cours d'épreuve incrémental d'effort limitée par symptômes, dans 20 jeunes hommes en santé et à fonctions pulmonaire et cardiorespiratoire normaux. Résultats. Les résultats principaux furent : [1] Les contraintes mécaniques dynamiques sur l'expansion du VT étaient relativement plus grandes durant effort avec CWS que sans; [2] L'EMGdi était systématiquement plus élevé lors de l'effort avec CWS que sans; [3] Le CWS n'avait aucun effet sur le découplage neuromécanique du système respiratoire, comme la relation entre EMGdi et expansion du VT (normalisée selon la réduction de la capacité vitale causée par le CWS) durant effort a été maintenue. [4] L'intensité sensorielle et le sentiment de malaise accompagnant la dyspnée étaient sensiblement plus élevés durant effort avec CWS que sans; et [5] Le CWS n'a eut aucun effet sur la relation entre une l'EMGdi augmentée, et l'intensité sensorielle et malaise ressentie, pris séparément durant l'effort progressif. Conclusions. Nous concluons que la perception accrue de la dyspnée durant effort avec CWS n'est pas aisément expliquée par découplage neuromécanique du système respiratoire élevé, mais qu'elle reflète plutôt la prise de conscience de la pulsion respiratoire neural supplémentaire nécessaire pour surmonter les contraintes restrictives « anormales » sur l'expansion du VT. Nos résultants permettent d'approfondir notre compréhension des mécanismes physiopathologiques causant la dyspnée d'effort chez patients à troubles pulmonaires chroniques, et s'avère important pour le développement de modalités soulageant la dyspnée chez ces patients dans le futur.

Stability on ice and while wearing skates is a more challenging task than compared to bare foot and on ground; however, no studies exist to quantify how postural responses may specifically differ between these two conditions. Thus the purpose of this study was to compare the postural control responses due to a surface perturbation between bare foot (BF) and skate (SK) wearing conditions as well as between elite and recreational level hockey players. Eleven elite and 13 recreational level hockey players completed 18 crouched standing ("hockey ready posture") trials for both BF and SK conditions. Static (30s) and dynamic perturbation tests (10 cm, 40 cm/s, horizontal translations along each of the medio-lateral, and anterior-posterior axes) were conducted. A motion capture system recorded body kinematics and centre of mass (CoM), while two force plates measured the center of pressure (CoP). Overall, remarkably similar postural responses were observed between conditions. Interaction effects were noted; however they were small and generally less than 10 mm. Similarly, body kinematics yielded no statistical differences across conditions, with the exception of the knee response during the Anterior perturbation; where in it was determined that as a subjects' initial crouch position increased (i.e. greater than 40° hip flexion), their response reversed from knee flexion to knee extension. In summary, the adoption of the crouched and wide foot stance is believed to have mitigated the external perturbations effect on instability. These findings have practical coaching implications. Further research is warranted to address, for example, upper body perturbations. / La stabilité sur patins à la glace est généralement considérée plus difficile comparée à pieds nus sur terre ferme. Aucune étude jusqu'à présent ne quantifie la stabilité posturale due à des perturbations sous ces conditions. L'objectif de cette étude était de comparer la stabilité posturale due à une perturbation entre les conditions pieds nus (BF) et patin (SK), et entre joueurs de hockey élites et récréatifs. Onze joueurs élites et 13 joueurs récréatifs ont complété 18 essais en position accroupie sous les deux conditions, pour des perturbations statiques (30s) et dynamiques (10cm, 40cm/s, translation horizontale, axe médial-latéral et antérieur-postérieur). La cinématique du corps et le centre de masse (CoM) ont été mesurés avec un système d'analyse du mouvement,et le centre de pression (CoP) a été mesuré avec 2 plateformes de force. Des résultats semblables ont été observés sous les deux conditions. Des interactions ont été trouvées, mais les différences étaient petites (généralement moins que 10 mm). Aucune différence statistique entre conditions n'a été observée pour la cinématique du corps, avec l'exception de l'effet dû à la perturbation antérieure sur le genou : lorsque la position du sujet était plus accroupie, il y avait une réaction d'extension plutôt que de flexion (pour une position plus étroite). En résumé, la position accroupie avec pieds écartés semble avoir atténué les effets de perturbations externes sur l'instabilité. Ces résultats ont des implications pratiques pour l'entraînement. Des études futures sont nécessaires pour adresser, par exemple, les perturbations au haut du corps.

<p> The study presented here used "omic" technology to look at the mechanism behind the selective delayed death of hippocampus CA1 neurons after transient global brain ischemia. The main findings are summarized: 1. The main form of ELAV protein family member detected in CA1/CA3 in Hu protein immunoprecipitation and polysomes was HuB (Rel-N1). HuB is present in control CA3, 8 hr reperfused CA3, and 8 hr reperfused CA1, but absent from control CA1. AUF-1, hnRNP K, hnRNP M were also absent from control CA1 following Hu protein immunoprecipitation and Western blot, suggesting that HuB bound AUF-1, hnRNP K, hnRNP M in all experimental groups except control CA1. 2. mRNA populations were different between sucrose pad preparation and sucrose gradient preparations of polysomes, although both were enriched with ARE-mRNA. This suggests different RNA binding complexes were isolated by the two methods. 3. Polysomes fractionation on sucrose pad and Hu protein immunoprecipitations using post-mitochondrial supernatants from homogenized brain regions were shown by 316 liquid chromatography mass spectroscopy to be over 75% contaminated by neuron debris, cytoskeleton and internal membrane structures, in spite of showing no contamination by Western blots of organelle markers. This suggests proteomics should become the accepted standard for validating purity of reactions derived from homogenized tissues. To summarize the results, I have worked up a consistent method of isolating polysomes from whole animal model, which has less contamination than the sucrose density gradient method. Both results from Hu IP and polysomes experiments show that control CA1 is in a different state compared with control CA3. My results suggest that the selective vulnerability of CA1 after ischemia reperfusion injury may be due, in part, to the fact that CA1 is "weaker" from the beginning. This finding is significant as it shifts the focus of research from studying the difference of ischemia reperfusion injury to the different initial states of CA1 and CA3 neurons. This study has also reformed our general idea as revealed by the high resolution of proteomics, which is superior to Western blotting for detecting contamination of samples. It is shown here that contaminationmakes up a large proportion of subcellular fractionations. This result suggests proteomics should be the new standard for quantifying contaminants, particularly in fractions obtained from whole tissues in animal experimental models.</p>

Environmental stress is a fundamental factor that negatively impacts different cellular components and impinges on numerous aspects of cellular function. In fact, the ability of a cell to cope with different stressors determines its fate. One of the essential cellular systems which are targeted by stress is the nucleocytoplasmic transport apparatus. As such, the classical import pathway is inhibited by different forms of stress. The research presented in this thesis analyzed the effects of stress on nucleocytoplasmic transport with particular focus on how stress impinges on individual components of the transport apparatus. Furthermore, nuclear trafficking of the chaperone hsc70 and AMP-activated protein kinase (AMPK), which are implicated in numerous physiological processes have been analyzed under normal and stress conditions. / To gain further insight into how stress regulates nucleocytoplasmic trafficking in eukaryotes HeLa cells were used as model system to analyze the effect of mild oxidative stress on the localization of soluble transport factors. My research revealed that oxidative stress mislocalizes transport receptors importin-α, and CAS as well as nucleoporins Nup153, and Nup88 all of which accumulate in nuclei upon oxidant treatment. In addition, I have shown that these soluble transport factors became immobile in the nuclei of stressed cells where they were retained in large insoluble complexes. / A crucial component of the cell signaling machinery which is regulated by modulation of nuclear trafficking is AMPK. My research provided new insights into how different stressors affect the activation and subcellular localization of AMPK. As such, my results demonstrated that several forms of stress including heat, energy depletion and oxidants concentrate AMPK in nuclei. Furthermore, I showed that under normal growth conditions AMPK shuttles between the nucleus and cytoplasm, a process that depends on the nuclear exporter Crm1. Moreover, my results demonstrated that signaling through the MEK→ERK1/2 cascade plays a crucial role in controlling the localization of AMPK. / In addition to AMPK, I focused on the effect of stress on heat shock protein 70 (hsc70), an essential component of the chaperoning machinery which plays a crucial role in the repair of stress-induced damage. Following stress exposure, hsc70 accumulates in nuclei, but relocates to the nucleoli and subsequently the cytoplasm when cells recover from stress. I have defined at the molecular level the mechanisms that control hsc70 transport in and out of the nucleus upon stress. Specifically, retention in nuclei and nucleoli of stressed cells was identified as the main cause that delays hsc70 exit from the nucleus. My research has identified the nucleolar components fibrillarin and the rpS6 ribosomal protein as interacting components of hsc70 which possibly anchor the chaperone in nucleoli upon stress. In addition, I have shown that libration of hsc70 from these anchors is a prerequisite to exit the nucleus. / As part of my research objectives, my work was directed towards improving the technical approaches that are used to detect the subcellular distribution of proteins. To this end, I have developed a new quantitative immunofluorescence approach to analyze in a quantitative fashion the distribution of proteins in different subcellular compartments, including the nucleus, cytoplasm and nuclear envelope NE. The protocols described in this thesis were successfully employed to analyze the distribution of transport receptors and signaling molecules under normal and stress conditions. Developing new tools to quantify the levels of proteins in the different subcellular location opens the door to understand the dynamic organization of different cellular components and how such dynamic state regulates their function. / Le stress environnemental est un facteur fondamental qui a des effets négatifs sur diverses composantes cellulaires. En fait, la capacité d'une cellule à faire face à différents éléments stressants va déterminer son sort. Un des systèmes cellulaires essentiel qui est ciblé par le stress est l'appareil du transport nucléocytoplasmique. Les recherches présentées dans cette thèse analysent les effets du stress sur le transport nucléocytoplasmique. De plus, le transport nucléaire de la chaperone hsc70 et de la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK) ont été analysées sous des conditions normales et de stress. / Afin d'obtenir un meilleur aperçu de la capacité du stress à réguler le transport nucléocytoplasmique chez les eucaryotes, les cellules HeLa furent utilisées comme système model pour analyser les effets d'un stress oxydatif léger sur la localisation des facteurs de transport solubles. Mes recherches révèlent que le stress oxydatif modifie la localisation des récepteurs de transport importine-α et CAS, ainsi que les nucléoporines Nup153 et Nup88 qui s'accumulent toutes dans les noyaux suite à un traitement oxydatif. De plus, je démontre que ces facteurs solubles de transport deviennent immobiles dans les noyaux de cellules stressées où elles sont retenues dans de grands complexes insolubles. / Une composante cruciale de la machinerie de la signalisation cellulaire qui est régulée par la modulation du transport nucléaire est l'AMPK. Mes recherches fournissent de nouveaux aperçus sur la façon dont les différents éléments stressants affectent l'activation et la localisation subcellulaire de l'AMPK. Par exemple, mes résultats démontrent que plusieurs formes de stress incluant la chaleur, la réduction d'énergie et les agents oxydants concentrent l'AMPK dans les noyaux. De plus, je démontre que sous des conditions normales de croissance cellulaire, l'AMPK voyage entre le noyau et le cytoplasme, un processus qui dépend sur l'exportateur nucléaire Crm1. Par ailleurs, mes résultats ont démontrés que la signalisation par la cascade MEK-ERK1/2 joue un rôle crucial dans le contrôle de la localisation de l'AMPK. / En plus de l'AMPK, je me suis concentré sur l'effet du stress sur la protéine de stress à la chaleur hsc70 (heat shock protein 70), une composante essentielle de la machinerie des chaperones qui joue un rôle crucial dans la réparation des dommages induits par le stress. Suite à une exposition à un stress, hsc70 s'accumule dans les noyaux, mais est ensuite relocalisée dans les nucléoles et subséquemment dans le cytoplasme pendant le rétablissement des cellules. J'ai défini, au niveau moléculaire, les mécanismes qui contrôlent le transport de hsc70 vers et hors du noyau lors d'un stress. Spécifiquement, la rétention dans les noyaux et les nucléoles des cellules stressées fut identifié comme cause majeure qui retarde la sortie de hsc70 du noyau. Mes recherches ont identifié la fibrillarine, composantes nucléolaire, ainsi que la protéine ribosomale rpS6 comme composantes qui interagissent avec hsc70 en ancrant possiblement la chaperone dans les nucléoles lors d'un stress. / Faisant partie de mes objectifs de recherche, mon travail fut dirigé vers l'amélioration des approches techniques employées pour la détection de la distribution subcellulaire des protéines. Pour cette fin, j'ai développé une nouvelle approche quantitative de la fluorescence afin d'analyser de manière quantitative la distribution des protéines dans différents compartiments subcellulaires, incluant le noyau, le cytoplasme et l'enveloppe nucléaire (NE). Le développement de nouveaux outils afin de quantifier les niveaux de protéines dans divers endroits subcellulaires ouvre la voie vers la compréhension de l'organisation dynamique des différentes composantes cellulaires, ainsi que de la manière dont leur état dynamique régule leur fonction.