Introduction: Compromised mitochondrial integrity leads to neuronal cell death in Parkinson's disease and other neurodegenerative diseases. Cells have several quality control mechanisms in place to counteract dysfunction and preserve a healthy mitochondrial network. Recent studies have implicated the autosomal recessive Parkinson's disease genes, Parkin and Pink1, in a common pathway regulating mitochondrial quality control. Together, Parkin and Pink1 promote isolation and selective degradation of damaged mitochondria, but the mechanisms governing this process are unclear. Methods: The goal of our study was to use a genetically sensitized Drosophila model of Parkinson's disease to identify novel regulators of the Pink1/Parkin pathway. We screened deficiencies spanning the second and third chromosome for dominant enhancers and suppressors of the Pink1/parkin wing posture phenotype, which derives from mitochondrial defects in these mutants. Results: From this screen we identified several cytological regions that strongly interact with Parkin and/or Pink1. Of these, four were further dissected revealing five interacting genes. Among them, opa1 and drp1 have been previously implicated in the Pink1/Parkin pathway. The other three genes, p60, β4galNacTA, and debra, represent novel regulators of Parkin and Pink1 function. Conclusion/implications: The unbiased identification of previously known Pink1/Parkin interactors demonstrates the validity of this approach. Moreover, the discovery of novel genes involved in the Pink1/Parkin pathway will allow better understanding of the mechanisms governing mitochondrial quality control and will aid in the development of therapeutic treatments. / Introduction : L'altération de la fonction mitochondriale entraîne la dégénérescence de certains neurones chez les personnes atteintes de maladies neurodégénératives dont la maladie de Parkinson. Les cellules saines sont dotées d'un système de contrôle leur permettant de faire face et de réparer les dysfonctionnements des mitochondries et ainsi de préserver leur intégrité. Des études récentes ont révélé l'implication de deux gènes à l'origine de syndromes parkinsoniens autosomiques récessifs, Pink1 et Parkin, dans une voie de signalisation commune contrôlant le maintien de la fonction mitochondriale. Pink1 et Parkin interviennent ensemble dans l'isolation et la dégradation des mitochondries défectueuses. Cependant, à l'heure actuelle, les mécanismes moléculaires contrôlant ce processus restent à élucider. Méthodes : Le but de notre étude a été d'identifier de nouveaux régulateurs de la voie de signalisation Pink1/Parkin par crible génétique dans un modèle drosophile de la maladie de Parkinson. Pour cela, nous avons criblé une collection de lignées de drosophiles déficientes sur les chromosomes deux et trois pour leur capacité à modifier (augmenter ou diminuer) le phénotype de posture de l'aile caractéristique de la mutation de Pink1/Parkin. Résultats: Nous avons identifié plusieurs régions cytologiques qui interagissent fortement avec Parkin et/ou Pink1. Quatre de ces régions ont été disséquées de façon à révéler cinq gènes. Parmi eux, opa1 et drp1 avaient déjà été impliques dans la voie de signalisation Pink1/Parkin. Les trois autres gènes p60, β4galNacTA et debra représentent de nouveaux régulateurs de la fonction de Pink1 et Parkin. Conclusion/implications : D'une part, l'identification non biaisée de gènes déjà connus comme interagissant avec Pink1/Parkin démontre la validité de cette approche. D'autre part, la découverte de nouveaux gènes candidats de la voie Pink1/Parkin pour le maintien de l'intégrité mitochondriale permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant ce processus et aidera à l'élaboration de traitements.

Vitamin B12 (cobalamin, Cbl) is an essential coenzyme in mammals for two reactions: the conversion of homocysteine to methionine by the enzyme methionine synthase and the conversion of methylmalonyl-CoA to succinyl-CoA by the enzyme methylmalonyl-CoA mutase. In cells, cobalamin is converted to the two active coenzyme forms of the vitamin: methylcobalamin and 5'-deoxyadenosylcobalamin. Eight groups of patients have been described with intracellular disorders of cobalamin metabolism, named cblA-cblG and mut. Three groups of patients present with an inability to produce both methylcobalamin and 5'deoxyadenosylcobalamin: cblF, cblC and cblD. We located the gene responsible for the cblF type of cobalamin disorder to chromosome 6 by microcell-mediated chromosome transfer, leading to the discovery of the LMBRD1 gene. We identified three novel mutations in LMBRD1 among cblF patients. We reviewed phenotypic and genetic data on three cblD patients and were able to confirm previous genotype-phenotype correlations. We purified the MMADHC protein defective in the cblD group of cobalamin disorder and predicted that interactions with the protein defective in the cblC group occur in a domain homologous to a bacterial domain involved also in protein-protein interactions. / La vitamine B12 (cobalamine, Cbl) est une coenzyme essentielle chez les mammifères pour deux réactions : la conversion entre l'homocystéine et la méthionine par l'enzyme méthionine synthase et la conversion entre le méthylmalonyl-CoA et le succinyl-CoA par l'enzyme méthylmalonyl-CoA mutase. Dans les cellules, la cobalamine est transformée en ses deux formes coenzymatiques actives : la méthylcobalamine et l'adénosylcobalamine. Huit groupes de patients ont été décrits qui présentent des défauts intracellulaires de la voie métabolique de la cobalamine, nommés cblA-cblG et mut. Trois groupes de patients présentent une inhabilité à synthétiser la méthylcobalamine et l'adénosylcobalamine : cblF, cblC et cblD. Nous avons localisé le gène responsable de la forme cblF de désordre de cobalamine sur le chromosome 6 par transfert de chromosome par microcellules, menant à l'identification du gène LMBRD1. Nous avons identifié trois nouvelles mutations dans LMBRD1 chez des patients cblF. Nous avons passé en revue des données phénotypiques et génotypiques pour trois patients cblD et avons pu confirmer des corrélations génotype-phénotype observées auparavant. Nous avons purifié la protéine MMADHC défectueuse dans le groupe cblD et prédit que l'intéraction avec la protéine défective dans le group cblC implique le domaine homologue à un domaine d'une protéine bactérienne aussi impliqué dans des intéractions protéiques.

The field of medical informatics has been primarily driven by advances in technology. In recent years, “next-generation sequencing” (NGS) has emerged as an affordable and quick means for accurate, large-scale sequencing at a single-base resolution, generating many gigabases of data per sequencing run. As with all new technological innovations, considerable development and improvements of analysis software is required, specifically to accurately extract relevant information from these large datasets. In this thesis, we explore two applications of next-generation sequencing to human health: sequencing of all protein coding exons (i.e. exome sequencing) of patients with Fowler Syndrome, a rare, prenatally lethal Mendelian disease, and sequencing of mRNA (i.e. RNA-Seq) of breast cancer cell lines and tumors from BRCA1 germline mutation carriers. We focus on both the bioinformatics developments and the application to human health in a “simple” Mendelian disease and in a genetically complex cancer. Indeed, in both these studies, we aim to find genetic events which may improve patient care. The discovery of the gene causing Fowler Syndrome will lead to improved genetic counseling for affected families and may influence choices such as family planning or preventive measures (e.g. prenatal or preimplantation genetic diagnosis). Delineation of transcripts which unambiguously characterize or contribute to BRCA1-related breast cancers could lead to new biomarkers or therapeutic options. In the first study, we develop a bioinformatics pipeline capable of identifying Mendelian disease genes from exome sequencing data. These diseases are typically caused by a single mutation which affects the protein coding sequence; thus, exome sequencing can be used to detect all coding variants in an individual which are then filtered to identify the most likely causative mutation. The successful application of this pipeline is demonstrated in Fowler Syndrome. We found that mutations in the gene FLVCR2 are responsible for this recessive disease using only two affected individuals. Next, we use mRNA sequencing to identify alternative splice isoforms which may contribute to tumorigenesis in breast cancers caused by BRCA1 germline mutations. This subtype of breast cancer accounts for a large proportion of familial breast cancers and is associated with a poorer than expected prognosis. These breast cancers are characterized by several dysregulated cellular processes but the role of alternative splicing in tumorigenesis has not been investigated in BRCA1-related breast cancers. We find several highly recurrent splice junctions that are more abundant in BRCA1-related breast cancers than in controls but none which clearly contribute to breast cancer tumorigenesis. This study illustrates the heterogeneity of BRCA1-related breast cancers at the level of RNA splicing. In summary, in this thesis we show that NGS is an effective tool for global identification and analysis of genetic events in an individual and will thus enable the transition to personalized-medicine. / Le domaine d'informatique médicale avance primordialement grâce aux développements technologiques. Durant les années récentes, le « séquençage de nouvelle-génération » (SNG) a émergé comme un moyen abordable et rapide pour le séquençage à grande échelle. Cette technologie possède une grande précision, avec une résolution au niveau d'une seule base d'ADN, générant plusieurs gigabases d'information. Comme toutes innovations technologiques, des développements et améliorations des logiciels analytiques sont essentiels, en particulier pour extraire avec précision les informations pertinentes à partir de ces grands ensembles de données. Dans cette thèse, nous explorons deux applications de SNG à la santé humaine: le séquençage de tous les exons codant les protéines (i.e. séquençage d'exome) des patients avec le Syndrome Fowler, une maladie Mendélienne rare et létale, et le séquençage des ARNm (i.e. ARN-Seq) des lignées cellulaires et tumeurs des patients du cancer de sein portant une mutation germinale de BRCA1. Nous nous concentrons sur les développements bioinformatiques et les applications pour la santé humaine dans une maladie Mendélienne « simple » et dans un cancer génétiquement complexe. En effet, dans les deux études, nous essayons de trouver des événements génétiques qui pourraient améliorer le soin des patients. La découverte du gène qui cause le Syndrome Fowler rendra les conseils génétiques plus complets pour les familles atteintes par cette maladie et pourrait influencer les choix de planification familiale ou de mesure préventive (par exemple, le diagnostic génétique prénatal ou préimplantatoire). La découverte des isoformes qui caractérisent ou contribuent sans ambigüité au cancer de sein relié à BRCA1 pourrait mener à des nouveaux biomarqueurs et traitements. Dans la première étude, nous développons une approche bioinformatique capable d'identifier les gènes causant les maladies Mendéliennes à partir des données du séquençage d'exome. Ces maladies sont généralement causées par une seule mutation qui change la séquence des protéines; ainsi, le séquençage d'exome peut être utilisé pour identifier toutes les variations dans l'exome d'un individu qui sont ensuite filtrées pour trouver la mutation causative la plus probable. Nous démontrons notre succès avec l'application de cette approche dans le Syndrome Fowler. Nous avons trouvé que des mutations dans le gène FLVCR2 causent cette maladie récessive, en utilisant seulement deux individus. Ensuite, nous utilisons le séquençage des ARNm pour identifier des isoformes alternatifs qui pourraient contribuer à la tumorigenèse dans les cancers de sein causé par des mutations de BRCA1. Ce type de cancer de sein représente une grande proportion des cancers de sein familiale et est associé avec une prognose moins favorable. Ces cancers de sein sont caractérisés par des processus cellulaires dérégulés; pourtant, le rôle de l'épissage alternatif dans la tumorigène n'a jamais été exploré dans les cancers de sein relié à BRCA1. Nous trouvons plusieurs jonctions d'épissages très récurrents qui sont plus abondantes dans les cancers de sein relié à BRCA1, par rapport aux autres cancers de sein, mais aucune contribuant clairement à la tumorigène du cancer de sein. Cette étude démontre le hétérogénéité des cancers de relié à BRCA1au niveau de l'épissage alternatif. En bref, dans cette thèse nous montrons que le SNG est un outil effectif pour l'identification et l'analyse globale des événements génétiques dans un individu, permettant ainsi la transition vers la médicine personnalisée.

DNA methylation is an epigenetic modification that is essential for germline and embryo development. DNA methylation establishment occurs in the germline in a gender and site specific manner through the action of DNA cytosine-5-methyltransferase (DNMT) enzymes. Spermatozoa have been shown to have a unique configuration of DNA methylation as compared to somatic cells. Germline DNA methylation may also depend on the availability of methyl donors provided by the folate pathway through the action of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR). Absence of MTHFR has been associated with methylation loss in mature sperm as well as decreased male fertility. This thesis presents new data exploring the dynamics of DNA methylation at nonpromoter intergenic sites during the perinatal period in normal conditions and in the setting of perturbed expression of Dnmt3L and Mthfr. The key phase of DNA methylation acquisition in male germ cells was determined to occur during prenatal development of the germline suggesting that DNA methylation may be particularly vulnerable to in utero insults. DNA methylation acquisition was found to be a dynamic process at individual sites including loci that demonstrated incomplete erasure suggesting a potential for transgenerational inheritance of DNA methylation errors. Perturbation of the expression of Dnmt3L, a DNMT with no endogenous methylation activity, revealed that it may be responsible for not only directing DNA methylation to specific loci but also for controlling the timing of DNA methylation acquisition. Spermatogonial stem cell (SSC) cultures were developed as a model for examining DNA methylation in the male germline. While DNA methylation was stable in normal culture conditions, it could be perturbed by haploinsufficiency of either Dnmt3L or Mthfr. Further modification of culture conditions through changes of methionine concentration in Mthfr+/- SSC cultures resulted in increased variability of DNA methylation indicating a generalized effect of MTHFR on DNA methylation and possibly its interaction with other methyl group dependent processes such as histone methylation. This thesis presents a number of novel findings that begin to unravel the mechanisms of DNA methylation and epigenetic modification of the male germline. / La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique essentielle au développement germinal et embryonnaire. Elle est établie en une région et un genre spécifiques sous l'action des ADN cytosine-5-méthyltransférases (DNMT). Il a précédemment été démontré que les spermatozoïdes se distinguent des cellules somatiques au niveau de la méthylation de leur ADN. Celle-ci dépend entre autres de la disponibilité des groupes méthyles fournis par l'action de la 5,10-méthylènetétrahydrofolate réductase (MTHFR), une enzyme impliquée dans le cycle des folates. L'absence de cette enzyme a été associée à une perte de la méthylation de l'ADN spermatique ainsi qu'à une baisse de la fertilité masculine. De nouvelles données sur la méthylation de régions intergéniques en période périnatale, impliquant ou non une altération de l'expression des gènes Dnmt3L et Mthfr, sont exposées dans la présente thèse. Une méthode d'analyse chromosomique a d'abord confirmé que l'acquisition de la méthylation sur l'ADN des cellules germinales mâles a lieu durant l'embryogénèse. Cette assimilation de la méthylation s'est avérée être un processus dynamique en lien à des loci démontrant un effacement incomplet de l'empreinte génomique. Ces données suggèrent non seulement une vulnérabilité de la méthylation de l'ADN aux perturbations in utero, mais également un possible héritage transgénérationnel des erreurs de méthylation. L'altération de l'expression de Dnmt3L a révélé que cette enzyme joue probablement un rôle dans l'emplacement et la synchronisation de la méthylation de l'ADN. Afin d'étudier cette modification épigénétique dans l'ADN spermatique, des cellules souches spermatogoniales (CSS) ont été cultivées. Les cellules développées dans des conditions normales ont présenté une régulière méthylation de leur ADN, alors que les cellules haploinsuffisantes des gènes Dnmt3L ou Mthfr ont révélé une méthylation variable. Des modifications apportées aux concentrations de méthionine des cultures de CSS Mthfr+/- ont également exercé un effet perturbateur sur la méthylation. Ces résultats indiquent que MTHFR influence la méthylation de l'ADN et intervient possiblement dans d'autres processus impliquant des groupes méthyles, tels que la méthylation des histones. Les conclusions présentées dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes de méthylation de l'ADN et de modification épigénétique de la lignée germinale masculine.

Aggressive behaviour is a complex phenomenon that often arises in early childhood and typically decreases with age. Studies have shown that adults with severe aggression often have lower serotonin (5-HT) neurotransmission. The hypothesis of this thesis is that 5-HT alterations associated with childhood aggression are also defined by epigenetic mechanisms through differential methylation of critical genes in the 5-HT pathway that can be detected in peripheral white blood cells. Serotonin transporter (SLC6A4) was chosen in this study based on its importance in 5-HT function and preliminary genomic DNA microarray data. We first determined the state of DNA methylation of SLC6A4 promoter using pyrosequencing in T cells and monocytes isolated from blood of adult males with low or high childhood-limited aggression (N=25) and who have been followed since childhood. We then examined whether the state of DNA methylation of SLC6A4 promoter in the blood is associated with in vivo measures of brain 5-HT synthesis by integrating previously obtained Positron emission tomography (PET) data from these participants. Lastly, a luciferase reporter construct was generated to test whether SLC6A4 promoter methylation plays a functional role in its transcriptional activity. Significantly higher levels of methylation in high childhood-limited physical aggression (C-LHPA) group were observed in both T cells and monocytes at specific CpG sites. In addition, greater mean methylation of significantly altered CpGs was associated with lower 5-HT synthesis in the left and right lateral orbitofrontal cortex (OBFC) in both cells (N = 20). Moreover, in vitro methylation of the SLC6A4 promoter dramatically suppressed gene expression suggesting that methylation plays a functional role in gene regulation. Taken all together, these novel findings imply that SLC6A4 is epigenetically modulated by DNA methylation and that DNA methylation is associated with in aggression level observed during childhood. The association between higher DNA methylation and lower brain 5-HT synthesis supports the relevance of using DNA methylation in peripheral white blood cells as a marker for human brain 5-HT function. If these results can be confirmed in a larger sample, the identification of such 5-HT biomarkers may be beneficial for the prediction, prevention and evaluation of treatment of psychiatric disorders with 5-HT involvement. / Le comportement agressif est un phénomène complexe qui survient souvent lors de la petite enfance et diminue typiquement avec l'âge. Des études ont montré qu'une agressivité sévère chez l'adulte est associée à une plus faible neurotransmission de sérotonine (5-HT). L'hypothèse de cette thèse est que les modifications de neurotransmission de 5-HT associées à l'agressivité infantile sont également dépendantes de mécanismes epigénétiques, notamment du niveau de méthylation des gènes critiques à la régulation de la neurotransmission de la 5-HT qui peut être mesuré dans les leucocytes périphériques. Le transporteur de la sérotonine (SLC6A4) a été choisi dans cette étude dû à son importance dans la régulation du niveau de 5-HT ainsi qu'au vu de données provenant d'analyses préliminaires de micropuces d'ADN génomique. Nous avons premièrement déterminé les niveaux de méthylation d'ADN du promoteur de SLC6A4 en utilisant la méthode de pyroséquençage dans des cellules T et des monocytes isolés à partir de sang prélevé chez des hommes adultes ayant présenté des niveaux d'agressivité faibles ou importants durant l'enfance (N=25). Nous avons ensuite examiné si les niveaux de méthylation d'ADN du promoteur de SLC6A4 mesurés dans les cellules sanguines sont corrélés aux niveaux de synthèse cérébrale de 5-HT mesurés in vivo par tomographie par émission de positrons (TEP) chez les mêmes participants. Enfin, nous avons évalué in vitro grâce à une technique utilisant le gène rapporteur luciférase si le niveau de méthylation du promoteur de SLC6A4 est directement impliqué dans la modulation de son niveau de transcription. Nous avons mesuré des niveaux de méthylation de CpG spécifiques de SLC6A4 significativement plus importants dans les cellules T ainsi que dans les monocytes du groupe d'hommes ayant présentés une forte agressivité durant l'enfance (C-LHPA) par rapport au groupe ayant présenté une faible agressivité durant l'enfance. De plus, nous avons montré que ces niveaux de méthylation importants sont associés à une synthèse réduite de 5-HT au sein des cortex orbitofrontaux latéraux (OBFC) gauche et droit (N = 20). De plus, nous avons mesuré in vitro que la méthylation du promoteur SLC6A4 réprime fortement son expression. Ces données suggèrent que le niveau d'expression de SLC6A4 est modulé épigénétiquement par la méthylation de l'ADN et que les niveaux de méthylation du gène corrèlent avec les niveaux d'agressivité observés durant l'enfance. L'association entre les niveaux de méthylation d'ADN et de synthèse cérébral de 5-HT renforce la pertinence d'utiliser les niveaux de méthylation d'ADN de leucocytes périphériques comme indicateur du niveau de neurotransmission de 5-HT cérébrale. Ces résultats demandent à être confirmés au sein d'une cohorte plus importante. Cependant, l'identification d'un tel marqueur biologique pourrait être utile à la prédiction, la prévention et l'évaluation de traitements de désordres psychiatriques associés à des problèmes de neurotransmission de 5-HT.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a composite of conditions that include an abnormal inflammatory response and emphysema. Cigarette smoking is the main risk factor for developing COPD and mouse models are widely used in the study of smoking induced emphysema. The C57BL/6 mouse strain develops airspace enlargement after chronic smoke exposure, with no change in lung mechanics. The broad objective of this thesis is to try to identify in mice, candidate genes that cause a difference in susceptibility to the development of the disease and to better understand the inflammatory process that occurs in response to smoke exposure. / A detailed introduction to COPD and proposed mechanisms of its pathophysiology are presented in Chapter I. / Chapter II consists of a manuscript containing data comparing the genetic expression profiles and inflammation in lung tissue of mice (C57BL/6) chronically exposed to cigarette smoke, with age-paired controls. The findings presented in Chapter II are discussed in greater detailed in Chapter III.

A sample of 100 male vervets was appraised with the Object Retrieval Task (ORT- a test of general cognitive ability) and Time-Restricted Arousal Induction Test (TRAIT- a response performance task based on ethological observations) and genotyped for a VNTR residing in exon III of the dopamine receptor 4 (DRD4) gene. A factor analysis of the combined measurements has revealed 3 factors, accounting for 70% of the variability. They were interpreted as cognitive ability (eigenvalue=4.3), cautiousness (eigenvalue=2.1) and impulsive responding (eigenvalue=1.3). No association was found between the DRD4 VNTR alleles and impulsive responding (F1,93 =0.082, p=0.775). The smallest and youngest within this sample of young adults have been found to display the most cautious behavior (p=0.002). The heaviest subjects displayed the most uninhibited response-style (p=0.045). And lastly, monkeys with cognitive difficulties had the highest CSF levels of the dopamine metabolite, HVA (p=0.017). / The ORT and TRAIT provide rapid screening measures of cognitive ability, cautiousness and impulsive-responding, but extensive validation of these measures with classical cognitive tests was beyond the scope of this project. The relationship between cognitive performance and resting levels of dopamine metabolites suggests that the battery may be useful in future studies of various psychopathological models in this species.

Bone resorption requires the adhesion of osteoclasts to extracellular matrix (ECM) components, a process mediated by the alphavbeta 3 integrin. Following engagement with the ECM, integrin receptors signal via multiple downstream effectors, including the Integrin-Linked Kinase (ILK). In order to characterize the physiological role of ILK in bone resorption, we generated mice with an osteoclast-specific ILK gene ablation. Mice with one inactivated ILK allele (ILK+/-) were mated with TRAP-Cre transgenic mice. Progeny from this cross (TRAP-Cre;ILK+/-) was bred to mice homozygous for a floxed ILK allele (ILKfl/fl) to yield mutant mice with ILK-deficient osteoclasts (TRAP-Cre;ILK+/fl ). The mutant animals thus had one ILK allele inactivated in all tissues, and both alleles disrupted in osteoclasts. Mutant mice appeared phenotypically normal, but histomorphometric analysis of the proximal tibia revealed an increase in bone volume and trabecular thickness. Osteoclastogenesis, assessed by TRAP staining of bone sections or in vitro cultures, was not affected. Indeed, osteoclast-specific ILK ablation was associated with an increase in osteoclast number both in vitro and in vivo. Primary cultures of osteoclasts were generated on synthetic calcium phosphate discs, as well as dentin, and the mutant cells displayed a decrease in resorption activity. We also measured decreased serum concentrations of the C-terminal telopeptide of collagen, a marker of osteoclastic activity, in mice with ILK-deficient osteoclasts. Our results show that ILK is important for the function, but not the differentiation, of osteoclasts. The characterization of the molecular mechanisms responsible for the observed phenotype will identify novel pathways regulating bone resorption.

Pathogenic variants in the MMAB gene (OMIM 607958) are responsible for the cblB class of cobalamin-responsive methylmalonic aciduria (MMA) (OMIM 251110). MMAB encodes cobalamin adenosyltransferase, a mitochondrial enzyme responsible for the formation of adenosylcobalamin (AdoCbl). AdoCbl subsequently functions as a cofactor for methylmalonyl-CoA mutase (MCM) during the isomerization of L-methylmalonyl-CoA to succinyl-CoA. Somatic cells studies have been used to evaluate patient samples for cobalamin related disorders. Due to high basal levels of propionate incorporation, some patients with mild MMA biochemical phenotypes cannot be diagnosed by complementation analysis. A high resolution melting analysis (HRMA) assay was developed to rapidly scan the coding exons and flanking intronic regions for variants in the MMAB gene.Three cohorts of samples were scanned by HRMA: an unaffected reference population, 42 samples assigned to the cblB by complementation analysis and 181 patients with unresolved isolated MMA. HRMA correctly identified all of the previously reported mutations in the cblB cohort as well as seven additional variants including a novel nonsense variant (c.12C>A, p.C4X). Scanning of the unresolved MMA cohort identified six samples containing MMAB variants. Two samples, WG3948 and WG4034, contained compound heterozygous variants. They shared a c.572 G>A (p.R191Q) mutation. WG3948, the index case for this study, was found to have c.398 C>T (p.S133F) as the second mutation, and WG4034, the second patient, contained a novel variant c.394 C>T (p.C132R). Samples from four other affected patients contained a single variant. The c.572 G>A (p. R191Q) was found in both WG3546 and WG4090. WG3759 contained a c.521C>T ( p.S174L) substitution, and WG4029 contained a novel c.185 C>T (p.T62M) substitution. The identification of two patients with compound heterozygous variants in the MMAB gene suggests the existence of an infrequent but distinct atypical cblB phenotype. This subclass is characterized by levels of propionate incorporation and of AdoCbl synthesis within reference ranges, preventing diagnosis by somatic cell studies. / Des variantes pathogéniques dans le gène MMAB (OMIM 607958) sont responsables de la classe cblB d'acidurie méthylmalonique (AMM) respondant à la cobalamine (OMIM 251110). MMAB encode cobalamine adénosyltranférase, une enzyme mitochondriale responsable de la formation de l'adénosylcobalamine (AdoCbl). AdoCbl fonctionne par la suite en tant que cofacteur pour méthylmalonyl-CoA mutase (MCM) durant l'isomérisation de L-méthylmalonyl-CoA vers succinyl-CoA. Des analyses sur des cellules somatiques ont été utilisées pour évaluer des échantillons de patients pour des troubles reliés à la cobalamine. En raison de niveaux de base élevés d'incorporation de propionate, certains patients présentant des phénotypes biochimiques bénins d'AMM ne peuvent être diagnostiqués par analyse de complémentation. Une analyse de fusion à haute résolution (AFHR) a été développée pour balayer rapidement les exons codants et les régions introniques avoisinnantes pour des variantes dans le gène MMAB.Trois cohortes d'échantillons ont été balayées par AFHR : une population de référence non-affectée, 42 échantillons assignés au groupe cblB par analyse de complémentation et 181 patients avec une AMM isolée sans diagnostique. L'AFHR a correctement identifié toutes les mutations précédemment rapportées dans la cohorte cblB ainsi que sept variantes additionelles, incluant une nouvelle variante non-sens (c.12C>A, p.C4X). Le balayage de la cohorte avec de l'AMM isolée a identifié six échantillons contenant des variantes dans MMAB. Deux échantillons, WG3948 et WG4034, étaient des porteurs de variantes hétérozygotes composés. Ils partageaient la mutation c.572G>A (p.R191Q). WG3948, le cas index pour cette étude, était porteur du c.398C>T (p.S133F) pour la deuxième mutation et WG4034, le deuxième patient, contenait une nouvel variante c.394C>T (p.C132R). Les échantillons provenant de quatre autres patients atteints contenait une seule variante. Le c.572G>A (p.R191Q) a été trouvé dans WG3546 et WG4090. WG3759 contenait une substitution c.52C>T (p.S174L), et WG4029 contenait une nouvelle substitution c.185C>T (p.T62M).L'identification de deux patients avec des variantes hétérozygotes composées dans le gène MMAB suggère l'existence d'un phénotype rare mais distinct de cblB. Cette sous-classe est charactérisée par des niveaux d'incorporation de propionate et de synthèse d'AdoCbl dans les valeurs normales, empêchant le diagnostique par analyse des cellules somatiques.

Brain tumours are the largest group of solid neoplasms in children, and they are currently the leading cause of cancer-related mortality and morbidity in the pediatric years. In Canada, pediatric astrocytomas account for 44% of all brain tumours in children. While the low-grade tumours have significant morbidity on the developing brain, the high-grade tumours have a dismal three-year survival rate varying from 10%-30%. Although extensive documentation is available on adult astrocytomas, relatively little is known about the molecular mechanisms underlying the development and progression of pediatric astrocytomas. The main goal of the work presented in this thesis was to better characterize the molecular pathogenesis of pediatric high-grade and low-grade astrocytomas (pediatric HGA and pediatric LGA). First, we aimed to identify and characterize chromosomal alterations in pediatric HGA using the Illumina Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)-based array. Results from this study showed an unexpectedly low frequency of genetic amplification and of complete deletions, and a high frequency of loss-of-heterozygozity in the pediatric samples. Despite some commonalities, most copy-number alterations in pediatric HGA were distinct from those described in adult HGA. This study constituted the first complete profiling of the tumour cell genome using high-resolution SNP arrays. Second, using the same technique, we identified and characterized recurrent tandem duplication on chromosome 7q34, leading to an in-frame gene fusion between 2 adjacent genes: KIAA1549 and BRAF, in a subset of pediatric LGA. Our results demonstrated that this duplication occurs mainly in sporadic juvenile pilocytic astrocytomas (JPA) and is rare in other low-grade brain tumours. Moreover, this duplication showed neuroanatomomical specificity for JPA located in the cerebellar regions. Finally, using in vivo and in vitro models of JPA, we showed up-regulation of several known senescence markers indicative of the activation of an oncogene-induced senescence (OIS) program in these tumour cells. Results from these two studies suggest that the KIAA1549-BRAF gene fusion is a biological marker of JPA, and that constitutive activation of BRAF leading to oncogene-mediated senescence may explain their tendency toward growth arrest. Collectively, these studies have uncovered new chromosomal alterations specific to pediatric low-grade and high-grade astrocytomas, and they have helped elucidate molecular mechanisms leading to the development of these tumours. / Chez les enfants atteints de cancer, les tumeurs cérébrales représentent la première cause de mortalité et de morbidité. Au Canada, près de 44% d'entre elles sont des astrocytomes. Quel que soit leur grade, ces tumeurs sont majoritairement délétères pour les enfants atteints. Les tumeurs de bas grade peuvent altérer de manière significative le développement sensoriel et cognitif de patients souvent très jeunes, alors que les enfants atteints d'un astrocytome de haut grade ont une survie globale variant entre 10%-30% à cinq ans. À la différence des astrocytomes de l'adulte, il existe peu de données génétiques et moléculaires sur les mécanismes du développement des astrocytomes pédiatriques. L'objectif principal de l'étude présentée dans cette thèse est de caractériser sur le plan génétique et moléculaire la pathogénèse des astrocytomes pédiatriques de haut grade (pHGA) et de bas grade (pLGA). Tout d'abord, nous avons décrit le génome des pHGA en utilisant une puce de polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP), qui détecte les variations génétiques en termes de nombre de copie chromosomique. L'analyse des données montrent que les tumeurs pédiatriques présentent un taux élevé de perte d'hétérozygotie, alors que les amplifications et délétions sont des événements rares. De plus, la plupart des altérations chromosomiques détectées chez les pHGA sont différentes de celles décrites chez leurs homologues adultes. Cette étude a été la première à caractériser le profil génomique des pHGA avec la puce SNP. Dans un deuxième temps, en utilisant la même technique, nous avons identifié et caractérisé une duplication en tandem sur le chromosome 7q34, récurrente dans un sous-groupe de pLGA. Cette duplication produit un gène de fusion entre deux gènes adjacents: KIAA1549 and BRAF. Dans notre cohorte de pLGA, nous avons établi que cette duplication est spécifique aux astrocytomes pilocytaires (JPA) de l'enfant alors qu'elle est rare chez les autres tumeurs cérébrales de bas grade. De plus, cette duplication est prédominante dans les tumeurs pilocytaires du cervelet. Dans la dernière partie de cette thèse, en utilisant des modèles in vivo et in vitro de JPA, nous avons démontré que plusieurs marqueurs de sénescence sont surexprimés, suggérant une activation du programme de sénescence induite par l'oncogène (OIS) dans les cellules tumorales. Ces deux dernières études montrent que le gène de fusion BRAF est un marqueur des JPA. De plus, son activation constitutive, en induisant le phénomène d'OIS pourrait expliquer l'évolution spontanée des JPA vers l'arrêt de croissance tumorale. En conclusion, ces études ont mis en évidence de nouvelles altérations chromosomiques spécifiques aux pHGA et aux pLGA, contribuant à élargir notre connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de ces tumeurs.