Leprosy (Hansen's disease) is a human infectious disease that can be effectively treated with 6-12 month administration of multi-drug therapy. In 2008, approximately 250,000 new cases were reported to the World Health Organization. The etiological agent, Mycobacterium leprae, was identified by G.H.A. Hansen in the nineteenth century. Subsequent to exposure, epidemiological studies maintain the importance of host genetics in leprosy susceptibility. A previous model-free genome-wide linkage scan in multi-case families from Vietnam detected linkage between chromosome region 6p21 (lod = 2.62) and leprosy per se and between 10p13 (lod = 1.98) and the paucibacillary sub-type. A ‘first-round' high-density association scan (307 SNPs) of a 10.4 Mb target interval on 6p21 (BAT1→CCND3) in 194 single-case families from Vietnam led to the identification of a SNP in lymphotoxin-alpha (LTA) – LTA+80 – as major risk factor for early-onset leprosy (P = 4.0×10-5). The association was replicated in 364 cases and 371 controls from North India (P = 0.006) and 104 single-case families from Vietnam (combined Vietnam P = 4.0×10-7). A ‘second-round' ultra-high-density association scan (682 SNPs) of a 1.9 Mb sub-interval on 6p21 (HCG27→HLA-DPA3) in 198 single-case families from Vietnam led to the identification of two intergenic SNPs in the HLA class I region – rs2394885 (P = 0.0063) and rs2922997 (P = 0.0094) – as risk factors for leprosy. The associations were replicated in 292 single-case leprosy families from Vietnam (P = 8.8×10-5 and P = 0.0037, respectively) and the population-based sample from North India (P = 3.0×10-8 and P = 2.0×10-5, respectively). Finally, mannose receptor, C type 1 (MRC1) was selected as a candidate paucibacillary gene in the 10p13 region. In 490 single-case and 90 multi-case families from Vietnam a non-synonymous SNP in exon 7 – rs1926736 (G396S) – was associated with leprosy (P = 0.035) but not the paucibacillary sub-type. The ass / La lèpre (maladie de Hansen) est une maladie infectieuse des humains qui peut être traitée avec succès par une antibiothérapie d'une durée de 6-12 mois. En 2008, environ 250 000 nouveaux cas ont été rapportés à l'Organisation Mondiale de la Santé. L'agent étiologique, Mycobacterium leprae, fut identifié par G.H.A. Hansen au XIXe siècle. Suite à l'exposition, des études épidémiologiques continuent de souligner l'importance de la génétique de l'hôte dans la susceptibilité à la lèpre. Une analyse génomique de liaison accomplie préalablement à partir de familles Vietnamiennes à cas multiples a détecté une liaison entre la région chromosomique 6p21 (lod = 2,62) et la lèpre per se et entre 10p13 (lod = 1,98) et le sous-type paucibacillaire. Une analyse primaire d'association de haute densité (307 SNP) d'une intervalle cible de 10,4 Mb dans le 6p21 (BAT1→CCND3) chez 192 familles à cas unique a mené à l'identification d'un SNP dans le gène de la lymphotoxine alpha (LTA) – LTA+80 – un facteur de risque majeur de la lèpre à début précoce (P = 4,0×10-5). L'association a été répliquée chez 364 cas et 371 témoins du nord de l'Inde (P = 0,006) et 104 famille Vietnamiennes à cas unique (P = 4.0×10-7 en combinant tout le Vietnam). Une analyse secondaire d'association à ultra-haute densité (682 SNP) d'une sous-intervalle de 1,9 Mb dans 6p21 (HCG27→HLA-DPA3) chez 198 familles Vietnamiennes à cas unique a permis l'identification de deux SNP intergéniques dans la région HLA de classe I – rs2394885 (P = 0,0063) et rs2922997 (P = 0,0094) – en tant que facteurs de risque à la lèpre. Les associations ont été répliquées chez 292 familles Vietnamiennes à cas unique (P = 8,8×10-5 et P = 0,0037, respectivement) et chez l'échantillon de population du nord de l'Inde (P = 3,0×10-8 et P = 2,0×10-5, respectivement). Finalement, le récepteur du mannose, C type 1 (MRC1) a été sélectionné comme gène candidat de$

Retinoblastoma tumour suppressor Rb is a cell cycle regulator that is active during early G1 preventing the transition from G1 to S-phase. This is achieved by Rb inhibiting E2F transcription factors from activating expression of genes required for G1 to S-phase progression and DNA synthesis. In our initial genetic test searching for genes that interact with mutations of rbf1, the homologue of rb in Drosophila melanogaster, one of the genes identified was tsc1, which is also a tumour suppressor gene that regulates translation and cell growth. We found that in Drosophila eye imaginal disc cells, tsc1 and rbf1 mutations have a synergistic effect on increasing the level of cell death and promoting ectopic S-phase entry. In addition, I found that dE2F1 protein level increased in tsc1 mutant eye disc cells, which implies that Tsc1 is a negative regulator of dE2F1 expression. The goal of my thesis study was to characterize the synergistic relation between Rbf1 and Tsc1 as well as the regulation of dE2F1 expression by Tsc1. In cells triple-mutant for rbf1, tsc1, and de2f1, I found that the observed elevation in cell death in rbf1 and tsc1double-mutant cells was suppressed, which suggests that the cooperation between Rbf1 and Tsc1 is dE2F1-dependent. Moreover, by using a reporter construct for dE2F1 activity, PCNA-GFP, and performing in situ hybridization with anti-sense RNA probes of dE2F1 target genes, rnrS, Cyclin E, and PCNA, I showed that activities of de2f1 downstream target genes were activated by tsc1 mutations, suggesting that Tsc1 also regulates dE2F1 target gene expression. Through clonal analysis of loss-of-function mutant alleles of the canonical Tsc pathway genes, I found that Tsc1 regulates dE2F1 via the Tsc pathway, specifically tsc/rheb/Tor/s6k. Finally, my RTq-PCR result showed that the regulation of dE2F1 protein expression by Tsc1 is at post-transcriptional level. To address whether the regulation is at the level of translation, I cloned the 5' untran / Le suppresseur de tumeur du Rétinoblastome, Rb, est un régulateur du cycle cellulaire qui est actif dans la phase précoce G1, prévenant le passage en phase S. Pour ce faire Rb inhibe le facteur de transcription E2F, l'empêchant d'activer l'expression de gènes requis pour le passage de la phase G1 à la phase S et pour la synthèse d'ADN. Dans nos tests génétiques initiaux, cherchant des gènes interagissant avec la mutation rbf1, l'homologue de rb chez Drosophila Melanogaster, un des gènes identifié fut tsc1, qui est également un gène suppresseur de tumeur qui régule la traduction et la croissance cellulaire. Nous avons découvert que dans les cellules des disques imaginaux des yeux, les mutations tsc1 et rbf1 ont un effet synergique sur l'augmentation du taux de mort cellulaire et promeuvent l'entrée en phase ectopique S. Il fut également découvert que le taux de la protéine dE2f1 augmente dans les cellules mutantes du disque des yeux, ce qui implique que Tsc1 est un régulateur négatif de l'expression de dE2F1. Le but de ma thèse était de caractériser la régulation de l'expression de dE2F1 par Tsc1 et la relation de synergie entre Rbf1 et Tsc1. Dans les cellules triples mutantes pour rbf1, tsc1, et de2f1, j'ai trouvé que l'augmentation du taux de mort cellulaire observé disparaissait dans les cellules doubles mutantes rbf1 et tsc1, ce qui suggère que la coopération entre Rbf1 et Tsc1 est dE2F1-dependante. Egalement, en utilisant un gène rapporteur de l'activité de de2f1, PCNA-GFP, et en réalisant des hybridations in situ avec des sondes ARN anti sens, rnrS, Cyclin E, and PCNA, j'ai montré que l'activité de la région en aval des gènes cibles de de2f1 était activé par la mutation tsc1, suggérant que Tsc1 régule également l'expression des gènes cible de dE2F1. Par l'analyse de clones possédant des allèles mutants perte de fonction pour les gènes de la cascade canonique Tsc, j'ai trouvé que Tsc1 régule dE2F1 par le biais$

Malting quality of barley is a complex but important trait for the malting and brewing industries. Several malting quality QTLs have been located on the chromosome 4H of barley. However, the genes associated with these QTLs regions are unknown. The Ac/Ds transposon system was used to dissect these malting quality QTLs. New single-copy Ds insertion lines (TNPs) were generated through sequential re-activation of Ds transposon in the candidate parental lines – TNP-29 and -79, in which the Ds insertion sites were mapped in the vicinity of the malting quality QTLs on chromosome 4H. Reactivation of Ds was carried out by crossing these TNPs with AcTPase expressing plants as well as through in-vitro expression of AcTPase in immature barley embryos. Furthermore, a new PCR based approach – HE-TAIL PCR was devised to expedite the detection of new transposition events. This study will contribute to a better understanding of genes involved in the barley malting quality. / La qualité du malt de l'orge est un trait complexe mais important pour les secteurs du maltage et de l'industrie brassicole. Plusieurs QTLs associés à la qualité du malt sont localisés sur le chromosome 4H de l'orge. Cependant, les gènes associés à ces QTLs sont inconnus. Par conséquent, nous avons utilisé le système de transposons Ac/Ds afin de caractériser ces QTLs. De nouvelles lignées comprenant une insertion unique de l'élément Ds (TNPs) ont donc été produites grâce à la réactivation séquentielle du transposon Ds chez des lignées reconnues comme ayant un élément Ds unique à proximité de ces QTLs. La réactivation de l'élément Ds a été réalisée en croisant les lignées parentales TNP-29 et TNP-79 avec une lignée exprimant l'AcTPase ainsi que par l'insertion par transformation de l'AcTPase chez des embryons immatures obtenus à partir de ces mêmes lignées. De plus, nous avons développé l'approche HE-TAIL PCR afin d'accélérer la détection de nouveaux événements de transposition. Par conséquent, mes travaux contribuent à améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de la qualité du malt de l'orge.

Vitamin B12 (cobalamin, Cbl) is required as a cofactor for two human enzymes: methylmalonyl-CoA mutase (MCM) and methionine synthase (MS). Fibroblasts from patients with inborn errors of cobalamin metabolism have been classified into nine distinct complementation classes ( cblA-cblH and mut). Previous studies have shown that cobalamin binds MCM in mitochondria and MS in the cytosol. Cobalamin binding patterns were analyzed in crude mitochondrial fractions obtained from normal and mutant fibroblasts. Crude mitochondrial fractions from wildtype fibroblasts confirmed that the majority of [57Co]Cbl eluted with MCM. However, in six of the nine disorders, at least one previously unidentified mitochondrial cobalamin binding protein was observed to bind [57Co]Cbl. The proportion of [57Co]Cbl that binds, is increased when a deficiency in either adenosylcobalamin synthesis or utilization prevents binding to MCM. Furthermore, unique cobalamin binding profiles emerged, demonstrating how known mutations in these patients affect cobalamin binding to accessory proteins.

X-linked recessive brachytelephalangic chondrodysplasia punctata (CDPX1) is a disorder of bone development characterized clinically by chondrodysplasia punctata (CDP), nasomaxillary hypoplasia and brachytelephalangy. There is a wide range of clinical severity in affected males. CDPX1 is caused by inherited deficiency of Arylsulfatase E (ARSE), a Golgi enzyme whose natural substrate is unknown and, is inhibited by warfarin, a drug that reduces vitamin K levels. Nevertheless, almost half of the patients with CDPX1 phenotypes do not have identifiable ARSE mutations. Although this could be due to undetected ARSE mutations or genetic heterogeneity, some could be phenocopies due to fetal deficiency of vitamin K in the first trimester of pregnancy. This has been observed with maternal warfarin use and maternal small bowel disease, pancreatitis and severe hyperemesis gravidarum, leading to the belief that fetal vitamin K deficiency could inhibit a normal ARSE enzyme, thus generating CDPX1 phenocopies. In addition, CDPX1 phenocopies are found in offspring of mothers with maternal autoimmune diseases. Since 2008, with the help of the Collaboration Education and Test Translation program (CETT) for CDPX1, 20 novel variations in ARSE and 24 potential phenocopies have been identified. Clinical data on all patients evaluated was collected and analyzed. In order to determine the effect of the variations on protein function, all ARSE mutant constructs were engineered and transiently expressed in COS1 cells. ARSE activity was measured using the fluorogenic artificial substrate, 4-methylumbelliferyl sulfate. Results showed that (1) frequency of ARSE mutation identification in patients with CDPX1 phenotype is ~ 53%, (2) all missense alleles had negligible ARSE activity suggesting they are pathological and, (3) since the mutations are located throughout the protein and patients with gene deletions show the same phenotype as the ones with missense alleles, genotype-phenotype correlations for ARSE are unlikely. / La chondrodysplasia ponctuée brachytelephalangique liée à l'X récessive (CDPX1) est un trouble du développement des os caractérisée cliniquement par la chondrodysplasia ponctuée (CDP), la hypoplasie nasomaxillaire et la brachytelephalangie. Il y a un large éventail de sévérité clinique chez les sujets masculins touchés. CDPX1 est causée par une carence héréditaire de l'Aryl-sulfatase E (ARSE), une enzyme de l'appareil de Golgi dont le substrat naturel est inconnu et est inhibée par la warfarine, un médicament qui réduit les niveaux de vitamine K. Néanmoins, près de la moitié des patients présentant des phénotypes CDPX1 n'ont pas de mutations d'ARSE identifiables. Bien que cela pourrait être dû à des mutations non détectées ou à une hétérogénéité génétique, certains pourraient être phénocopies dues à une carence fœtale en vitamine K durant le premier trimestre de la grossesse. Cela a été observé avec l'utilisation maternelle de la warfarine et la maladie de l'intestin grêle chez la mère, la pancréatite et vomissements incoercibles sévères, conduisant à croire que la carence en vitamine K fœtale pourrait inhiber une enzyme ARSE normale, générant ainsi des phénocopies CDPX1. Depuis 2008, avec l'aide du programme CETT (Collaboration Education and Test Translation program) pour la CDPX1, 20 nouvelles variations dans ARSE et 24 phénocopies potentielles ont été identifiées. Les données cliniques sur tous les patients évalués ont été recueillies et analysées. Afin de déterminer l'effet des variations sur la fonction des protéines, toutes les constructions de mutant ARSE ont été conçues et exprimées de façon transitoire dans les cellules COS1. L'activité d'ARSE a été mesurée en utilisant le substrat fluorogénique artificiel, 4-methylumbelliferyl sulfate. Les résultats ont montré que (1) la fréquence de l'identification de mutation d'ARSE chez les patients ayant le phénotype CDPX1 est de ~53%, (2) que tous les mutants avaient une activité négligeable d'ARSE suggérant qu'ils sont pathologique, (3) que étant donné que la localisation des mutations et que les patients ayant des délétions du gène exhibe le même phénotype que ceux ayant les allèles missense, les corrélations entre génotype et phénotype sont peu probables.

Congenital anomalies of the kidney and urinary tract (CAKUT) are the most common cause of chronic kidney disease in infants. CAKUT includes a spectrum of urinary tract anomalies that can be found alone or in combination, such as vesicoureteral reflux, and duplex kidneys. Murine models of these defects have been instrumental in identifying novel genetic regulators of both normal and aberrant kidney development. In mammals, kidney formation proceeds through three phases; pro-, meso- and metanephric development. Gene inactivation studies have identified essential regulators at each stage of normal kidney development. Specifically, the individual roles of transcription factors (TFs) Pax2, Gata3, Lim1, Emx2 and Evi1 in urogenital system development have been described by our lab and others. Here we explore the genetic network of interactions and cooperativity between these TFs in the context of normal and aberrant urogenital system (UGS) development. In order to establish a genetic transcriptional hierarchy between Pax2, Gata3, Lim1, Emx2 and Evi1, we investigated the expression of these TFs, as well as selected downstream developmental effectors, in each homozygous mutant embryo. In addition, we performed microarray analyses on the mesonephros of Pax2 and Gata3 mutant embryos, establishing their genetic expression profiles. Through these complementary approaches, we have established a genetic network in which Pax2, Gata3 and Lim1 are at the top of a transcriptional hierarchy during early kidney development. Having identified Pax2, Gata3 and Lim1 as the 'core' regulators of mesonephric development, we then addressed which interactions were direct via extensive chromatin immunoprecipitation (ChIP-PCR) experiments from cell lines expressing tagged recombinant versions of Pax2, Gata3 and Lim1. We found that both Pax2 and Gata3 associate to Lim1 enhancers. We also identified Gata3 binding sites in enhancers of multiple cellular effectors, including Formin1, Diap1 and Ret. In addition, we found that Lim1 associates with enhancers on the extracellular matrix protein Npnt locus. Finally, we confirmed through in vitro reporter assays that Gata3 activates a Gata-binding site in the Ret promoter region, thus identifying Ret as a direct target gene of Gata3 in the kidney. Finally, we tested the genetic cooperativity between Pax2, Emx2, Gata3, Lim1, and Evi1 by screening a series of compound heterozygous mice for UGS anomalies. We found a high incidence of urinary tract anomalies in Pax2;Emx2 compound heterozygotes that are not found in either single heterozygotes or other allellic combinations. Pax2+/-;Emx2+/- mice harbour duplex systems associated with urinary tract obstruction, bifid ureter and a high penetrance of vesicoutreteral reflux. Remarkably, most compound heterozygotes display lower intravesical reflux pressure compared to controls. Earlier analysis of Pax2+/-;Emx2+/- embryos identified ureter budding defects as the primary cause of urinary tract anomalies. We additionally establish Pax2 as a direct regulator of Emx2 expression in the mesonephric duct. Together, these results identified a haploinsufficient combination of transcriptional kidney regulators resulting in a novel CAKUT-like phenotype in mouse. / Les anomalies congénitales du rein et des canaux urinaires (CAKUT) sont les causes les pus communes de maladies rénales chroniques chez les enfants en bas âge. CAKUT comprend un spectre d'anomalies des canaux urinaires qui se manifestent seules ou en combinaison, telles le reflux vesico-urétéral et les reins dupliqués. Les modèles de souris ont été instrumentaux dans l'identification de nouveaux régulateurs du dévelopment rénal. Chez les mammifères, le dévelopement rénal se fait en trois phases, les stades pro-, meso- et métanéphriques. Les études d'inactivations génétiques ont permis d'identifier des régulateurs essentiels à chaque stade du dévelopement rénal. Spécifiquement, les rôles individuels des facteurs de transcription Pax2, Gata3, Lim1, Emx2 et Evi1 lors du dévelopement du système urogénital ont été décrits aussi bien par notre laboratoire que par d'autres. Ici, nous explorons le réseau d'interactions et de coopérativité génétiques entre ces facteurs de transcription dans le contexte du dévelopement normal et aberrant du système urogénital. Afin d'établir la hiérarchie génétique transcriptionelle entre Pax2, Gata3, Lim1, Emx2 et Evi1, nous avons procédé à l'analyse de l'expression de ces facteurs, ainsi qu'à une sélection d'effecteurs dévelopementaux en aval, dans chacun des embryons mutants homozygotes respectifs. De plus, nous avons réalisé les profils d'expression génétique de Pax2 et de Gata3 par des analyses sur micropuces. Avec ces approches complémentaires, nous avons établi un réseau génétique dans lequel Pax2, Gata3 et Lim1 sont au sommet de la hiérarchie transcriptionelle lors du dévelopment rénal. Ayant identifié Pax2, Gata3 et Lim1 comme étant le 'noyau' régulateur du dévelopement mésonéphrique, nous avons ensuite déterminé quelles interactions étaient directes grâce à des immunoprécipitations de chromatine dans des lignées cellulaires exprimant des versions étiquettées (tagged) de Pax2, Gata3 et Lim1. Nous avons déterminé que Pax2 et Gata3 se lient au locus de Lim1. Nous avons également trouvé des sites où Gata3 se lie sur les locus d'effecteurs cellulaires, nottament Formin1, Diap1 ainsi que Ret. De surcroît, nous avons déterminé que Lim1 s'associe au locus de la protéine de la matrice extracellulaire Npnt. Nous avons également confirmé, grâce à une analyse in vitro, que Gata3 active un site dans la région du promoteur de Ret, identifiant ainsi Ret comme un gène cible direct de Gata3 dans le rein. Finalement, nous avons testé la coopérativité génétique entre Pax2, Gata3 Lim1, Emx2 et Evi1 en dépistant des anomalies urogénitales dans une série d'embryons de souris doubles hétérozygotes. Nous avons trouvé une haute incidence d'anomalies des canaux urinaires chez les embryons doubles hétérozygotes Pax2;Emx2, qui ne sont présentes ni chez les homozygotes ni dans les autres combinaisons alléliques. Les souris Pax2+/-;Emx2+/- ont des systèmes dupliqués associés avec des obstructions de l'uretère, des uretères bifides et une haute pénétrance de reflux vésico-urétéral. En effet, la plupart des doubles hétérozygotes ont une pression intravésicale de reflux moindre que les contrôles. L'analyse précoce des embryons Pax2+/-;Emx2+/- a permis d'identifier des défauts de bourgeonnement urétéral comme cause primaire des anomalies des canaux urinaires. De sucroît, nous avons établi Pax2 comme un régulateur direct de l'expression de Emx2 dans le tube mésonéphrique. Ensemble, ces résultats ont permis d'identifier une combinaison génétique entre deux facteurs de transcription résultant en un nouveau phénotype ressemblant au CAKUT chez la souris.

Improper acquisition of DNA methylation patterns during the fetal period in germ cells of male mice is associated with impaired meiosis and infertility. MTHFR is a key folate pathway enzyme involved in providing methyl groups for DNA methylation. The goal of these studies was to evaluate DNA methylation patterns in spermatogonia from mice heterozygous for a targeted deletion in Mthfr (Mthfr+/-) as compared to those of their wildtype, Mthfr+/+, littermates. DNA methylation patterns were similar at imprinted genes and intergenic sites across chromosome 9 in neonatal spermatogonia of Mthfr+/+ and Mthfr+/- mice. We then established spermatogonial stem cell (SSC) cultures from Mthfr+/+ and Mthfr+/- mice to examine the stability of DNA methylation patterns over time in culture and determine whether methionine supplementation could restore any DNA methylation defects caused by MTHFR haplosufficiency. There were no differences detected between early and late passages, suggesting DNA methylation patterns in SSC clusters are generally stable in culture. Cultured SSC clusters treated with 20-fold normal medium methionine concentrations showed an overall increase in the levels of DNA methylation across chromosome 9, indicating DNA methylation can be perturbed in culture. Additionally, Mthfr+/- SSC clusters cultured in varying concentrations of methionine demonstrated a significantly increased variance of DNA methylation at multiple loci across chromosome 9 compared to Mthfr+/+ SSC clusters treated the same way. Together our results provide evidence that DNA methylation patterns of SSC clusters are stable in culture but can be perturbed by altered methionine and MTHFR levels. / L'acquisition inexacte de patrons de méthylation d'ADN des cellules germinales pendant la période fœtale chez la souris mâle est associée à des désordres de méiose et d'infertilité. L'enzyme MTHFR joue un rôle clé dans le processus de méthylation d'ADN puisqu'elle est impliquée dans une cascade produisant les groupements méthyles nécessaires à la réaction. L'objectif des travaux présentés dans ce mémoire était d'évaluer les profiles de méthylation d'ADN dans les spermatogonies provenant de souris hétérozygotes pour une suppression ciblée de Mthfr (Mthfr+/-), en comparaison avec celles découlant des compagnons de type sauvage de la même portée (Mthfr +/+). Nous avons déterminé que dans les spermatogonies néonatales de souris Mthfr+/+ et Mthfr+/- les patrons de méthylation sont demeurés similaires au niveau des gènes à empreinte ainsi qu'à divers sites intergéniques retrouvés à travers le chromosome 9. Subséquemment nous avons établi un système de culture de cellules souches spermatogoniales (SSC) à partir de souris Mthfr+/+ et Mthfr+/- afin d'examiner la stabilité des profiles de méthylation en culture et de déterminer si un supplément de méthionine peut restaurer un dérèglement de méthylation d'ADN causé par une haploinsuffisance de MTHFR. La période de culture (nombre de passages faible vs élevé) n'a nullement altérée les patrons de méthylation d'ADN, ce qui suggère que cette modification épigénétique est globalement très stable dans les SSCs en culture. Le traitement de ces même SSCs avec un milieu 20 fois plus élevé en méthionine occasionne par contre une augmentation des niveaux globaux de méthylation d'ADN à travers le chromosome 9, démontrant que cette modification post-traductionnelle peut être perturbée en culture. De plus, la culture des SSCs Mthfr+/- dans diverses concentrations de methionine démontre une augmentation significative de la variance des niveaux de méthylation d'ADN pour une multitude de loci à travers le chromosome 9 comparativement aux SSCs Mthfr+/+ soumis aux mêmes traitements. Ensemble, nos résultats suggèrent que les patrons de méthylation d'ADN des SSCs sont normalement stables en culture mais peuvent cependant être perturbés par les niveaux de méthionine et MTHFR.

The androgen receptor (AR) mediates the various actions of androgens and is responsible for the male reproductive system and male phenotype. AR mutations result in variable degrees of androgen insensitivity in XY individuals, ranging from complete to mild androgen insensitivity syndrome (AIS). Most of the AR-mutations are located in the ligand-binding-domain (LBD) and result in a complete or near complete loss of ligand binding. As revealed by several AR-LBD crystal structures, most of these mutations are located far from the bound-ligand, therefore their severe ligand-binding abnormalities must reflect more widespread LBD structural aberrations rather than local distortions at the mutated residues. / To better understand the structural/functional relationship of such mutations, I have characterized the abnormalities associated with alternate substitutions at two identical positions in the AR-LBD (R855H and R855C) and (P892A and P892L) identified in unrelated AIS patients. Results of these analyses have explained the mechanism by which the AR-R855H and AR-R855C resulted in significantly different AIS phenotypes. These studies also revealed that the AR-P892 residue is critical for the dynamic properties of the C-terminal helix (helix 12) of the LBD. Helix 12 dynamic properties are crucial for ligand-binding and for the transactivational properties of the receptor. / To further analyse the properties of the AR-LBD within the context of multiple domains, I have developed a high-yield bacterial-expression method for the production of soluble AR fragment that contains the DNA-binding-domain, the hinge region and the LBD (AR-DBDLBD). This will allow for detailed analyses of the structural and functional properties of these domains and their intra-molecular communications in the presence and absence of DNA and/or ligand. This method is likely to be generally applicable to other nuclear receptors and may resolve the low solubility, instability, and toxicity problems associated with their overexpression. / Furthermore, I have reached the final stages in generating a knockout mouse for a newly identified AR-coregulator, the Androgen Receptor N-terminal- Interacting Protein (ARNIP).

One of the main goals of this project was to systematically evaluate the virus-inducible properties of the individual human interferon-beta (IFN-$ beta$) enhansons. Synthetic oligonucleotides representing the different enhansons were subcloned into an enhancerless SV$ sb1$CAT vector; the hybrid plasmids obtained were tested in different human cell lines by transient expression assay. The P2 motif, which is 80% homologous to the NF-$ kappa$B recognition sequence, was inducible by Sendai virus. In contrast, the P1 enhanson was transcriptionally silent. Unexpectedly, a multimer of the P5 motif conferred significant virus inducibility to a heterologous transcription unit. A DNA fragment encompassing P5, P1, and P2 mimicked the transcriptional activity of the whole IFN-$ beta$ promoter, indicating that the three enhansons act synergistically to confer a virus-inducible expression pattern. The effect of certain trans-acting factors on the individual IFN-$ beta$ enhansons was also assessed. Together, these experiments indicate that the synergism between the P5, P1, and P2 enhansons is mediated by at least two distinct transcription factors, NF-$ kappa$B and IRF-1.

HDL-C levels, are an independent risk factor for heart disease, and are influenced by multiple genes and environmental factors. Choosing an isolated population could reduce the heterogeneity and increase power to discover susceptibility genes for low HDL-C. To identify novel genetic determinants that contribute to HDL-C levels, I used several genetic approaches on highly informative families of French Canadian descent with probands selected for HDL-C levels < 5th% (age and sex specific). The estimated heritability of HDL-C for this cohort was 0.73. Using a candidate gene approach, I identified a novel mutation of ApoAI (apo AIE136X) in three probands. Segregation analysis showed a strong co-segregation of the ApoAI allele with the low HDL-C trait in these kindreds. I also performed whole genome linkage analysis using 485 markers situated at intervals of 6 centiMorgans (cM). In parametric two-point linkage analyses, the highest two-point LOD score of 4.6 was observed with the marker D4S424 on chromosome 4q31.21. I further refined the linked region from 12.2 cM to 2.9 cM (2.37 Mb) by genotyping 15 additional markers in the three families with the highest LOD-scores. None of the genes residing in the significantly restricted 2.37 Mb region has previously been associated with HDL-C metabolism. In quantitative linkage analysis, I identified significant linkage to a locus on chromosome 16q23-24 that had been previously implicated in linkage scans for HDL-C. I examined this region for association using both family-based and case-control analyses. Within an 18.1 cM region (7.8 Mb) four families demonstrated segregation. All coding regions and exon-intron boundaries of all genes within this region were sequenced. A missense variant in the CHST6 gene showed segregation in four families. An association analysis that included all of the French Canadian families as well as other cohorts showed association for one com / IL est bien établi qu'un niveau bas de HDL-C représente un facteur de risque des maladies coronariennes, le HDL-C est influencé par plusieurs gènes et facteurs environnementaux. Des études génétiques récentes ont montré que le ciblage d'une population bien définie pourrait réduire l'hétérogénéité et contribuerait à découvrir de nouveaux gènes de susceptibilité aux niveaux bas du HDL-C. Dans le but d'identifier de nouveaux gènes qui control la régulation du HDL-C, nous avons utilisé plusieurs approches génétiques sur les familles d'ascendance canadienne-française avec des probands sélectionnés pour les niveaux HDL-C <5 e percentile (âge et sexe). Nos analyses démontrent une augmentation de l 'héritabilité estimée de HDL-C dans cette cohorte (0.73). D'autre part, l'utilisation d'une approche gène candidat, nous a permis l'identification d'une nouvelle mutation de l'apo AI (apo AIE136X) dans trois familles de cet échantillon avec une forte co-ségrégation de l'allèle ApoAI avec un HDL-C bas. J'ai également effectué une analyse de liaison du génome en utilisant 485 marqueurs situés à des intervalles d'environ 6 centiMorgans (cM). Nos résultas démontrent un LOD score de 4-6 sur la base de l'utilisation du marqueur D4S424 sur le chromosome 4q31.21. Une analyse quantitative de liaison génétique a permis l'identification des liens avec un locus sur le chromosome 16q23-24 impliqués dans la régulation HDL-C. Nos résultas démontrent qu'une variante dans le gène CHST6 (missence) montré une ségrégation dans quatre familles. D'autre part, l'analyse de toutes les familles canadiennes-françaises, ainsi que d'autres cohortes ont montré une association commune pour un intron, SNP (rs2548861) dans le WWOX gène, chromosome 16q23.3 cartes-q24. En outre, les résultats de RT-PCR à partir de cellules en culture ont démontré une différence significative dans le niv