Major depressive disorder (MDD) is a common and complex disorder with consistent evidence of genetic influence on predisposition. The search for susceptibility genes has proved to be an arduous task with studies having ever increasing sample numbers still not leading to replicable findings. It is generally believed that the failure of common genetic studies to identify replicable genetic associations is a consequence of the multifactorial and heterogeneous nature of MDD. This etiological heterogeneity may also explain significant variability in treatment response. Accordingly, while effective treatments for MDD are available, approximately half of the patients fail to respond to conventional antidepressant treatment. We hypothesized that peripheral gene expression could help us better understand illness heterogeneity and mechanisms of antidepressant response, possibly helping to identify biomarkers. To test this hypothesis, we have prospectively followed, and treated with the antidepressant citalopram for eight weeks, a cohort of medication naive individuals with MDD. RNA and DNA from pre- and post-treatment blood samples of this cohort were used to perform high-throughput pharmacogenomic and genetic studies to identify genes involved in treatment response and in the pathophysiology of MDD. Significant gene expression alterations in immune related genes were observed after citalopram treatment, pointing to a possible mode of action of the treatment response, as well as possible biomarkers for future treatment response. Additionally, we identified copy number variable regions differentiating MDD and controls and having a significant impact on gene expression. These results provide important additional information which can be used to identify the genomic and molecular underpinnings of MDD and antidepressant response. / La dépression majeure est un trouble complexe et commun dans la population et pour laquelle il existe des évidences suggérant de manière consistante une influence génétique sur sa prédisposition. La recherche pour des gènes de susceptibilité pour la DM s'est avérée particulièrement compliquée avec des études ayant des échantillons de plus en plus grands mais qui ont révélé des résultats non reproductibles. Il est généralement accepté que l'absence de réplication des résultats obtenus dans des études génétiques classiques est une conséquence du caractère multifactoriel et hétérogène de la DM. Cette hétérogénéité clinique peut aussi expliquer la variabilité significative observée dans la réponse aux antidépresseurs. Ainsi, même s'il existe des traitements disponibles, seulement autour de la moitié de patients traités répondent aux traitements antidépresseurs conventionnels. Notre hypothèse de départ était que l'expression génique dans du tissus périphérique pourrait nous aider à comprendre d'avantage l'hétérogénéité de la maladie et les mécanismes de réponse aux antidépresseurs, ainsi qu'aider à l'identification de biomarqueurs. Pour tester cette hypothèse, nous avons suivi prospectivement et traité avec l'antidépresseur citalopram, un échantillon de patients avec DM pendant huit semaines, cette cohorte n'avait jamais sous médication préalablement. ARN et ADN extraits à partir d'échantillons sanguins collectés avant et après le traitement ont été utilisés pour effectuer des analyses pharmacogénomiques et génétiques dans le but d'identifier des gènes impliques dans la réponse au traitement ou dans la physiopathologie de la DM. Des changements significatifs en termes de niveaux d'expression génique ont été observés pour des gènes impliqués dans la réponse immunitaire après le traitement au citalopram, indiquant un possible mode d'action pour la réponse au traitement mais aussi des possibles biomarqueurs pour la réponse. De plus, nous avons identifié des régions avec des variations au niveau du nombre de copies permettant la différentiation des patients et des sujets témoins et qui ont un impact significatif sur les niveaux d'expression génique. Ces résultats apportent des informations supplémentaires importantes pour l'identification des bases génétiques et moléculaires de la DM et de la réponse aux antidépresseurs.

Cardiac left ventricular mass (LVM) correlates tightly with cardiovascular morbidity and mortality in human populations, and constitutes an important independent predictor of cardiovascular risk. Using 24 mouse AxB/BxA recombinant inbred strains (RIS) (derived from crosses between A/J and C57BL/6J parents), our laboratory previously detected one major QTL linked to LVM on Chromosome (chr) 13. To extend these data, our laboratory used Illumina microarrays to obtain the profile of gene expression in 4 hearts of male mice from all RIS. By using first a publicly available genomic map, our laboratory identified initially a total of 456 cis-acting eQTLs (cis-eQTLs), 15 of which showing expression levels correlating with LVM. Although little functional annotation was available for these genes, the SymAtlas database indicated that most of them were expressed at higher levels in cells from the myeloid lineage (i.e. macrophages and/or mast cells) than in cardiac myocytes. By further using bone-marrow derived macrophages (BMDMΦ) from Balb/c mice, we: 1) verified that these genes were indeed expressed in such cells; 2) observed that their expression level was modulated by conditions known to affect the phenotypic properties of macrophages; 3) demonstrated that their expression could be knocked down by transfection with Dicer silencing RNAs. In a second phase of the project, the laboratory obtained a denser genetic map that allowed for the identification of a total of 1195 cis-eQTLs. Among corresponding genes, 33 showed significant correlation (p < 0.05) with LVM, and 10/33 genes clustered within a 10 MB interval centered around the QTL linked to LVM on chr 13. Further RT-PCR analyses revealed that the expression levels of these genes varied in BMDMΦ cells according to the A/B genotype. Since the clustering of 10 cis-eQTLs all correlating with LVM suggested the presence of a common regulator, we further analyzed genome databases and noticed that the same interval contained the locus of the mir-23b-27b-24-1 microRNA gene cluster. Interestingly, mir-27b has been reported to be functionally related to changes in LVM. Altogether, these experiments establish the feasibility of using primary macrophage cultures for further biologic validation of the roles and/or properties of candidate genes linked to LVM. Using these cells, it will be possible to test whether alterations in the intracellular concentration of miR-27b may regulate the abundance of the transcripts of other candidate genes from our locus of interest. In light of evidence reporting that macrophages may play a role in left ventricular remodeling, this may lead to future experiments testing how these genes may contribute via expression within macrophages to changes in LVM. / La masse ventriculaire gauche (MVG) du coeur corrèle étroitement avec la mortalité et morbidité cardio-vasculaires chez l'humain, et constitue un important facteur de risque indépendant. En utilisant une collection de 24 souches de souris recombinantes consanguines AxB/BxA (dérivées de croisements entre les cousches parentales A/J et C57BL/6J), notre laboratoire avait précédemment identifié sur le chromosome (chr) 13 un locus majeur en liaison avec la MVG. Pour élargir ces données, notre laboratoire a utilisé des micropuces à ADN Illumina pour mesurer le profil d'expression de gènes de 4 cœurs de souris mâles de chacune des souches recombinantes consanguines. Sur la base d'une analyse préliminaire (utilisant une carte génomique d'une banque de données publique, notre laboratoire utilisa des puces à ADN Illumina pour analyser les profils d'expressions des gènes de 4 cœurs de souris mâles de chacune des souches recombinantes consanguines. Une analyse préliminaire (utilisant une carte génomique disponible d'une banque de données publiques) permit ainsi d'identifier un total de 456 "cis-acting eQTLs » (cis-eQTLs), parmi lesquels 15 avaient des niveaux d'expression corrélant avec les valeurs de MVG. Bien que les banques de données contenaient peu d'annotation concernant ces gènes, la banque de données SymAtlas indiquait que la plupart d'entre eux étaient exprimés de façon plus importante dans les cellules provenant de la lignée myéloïde (comprenant les macrophages et les mastocytes) que dans des myocytes cardiaques. En faisant d'autres investigations à l'aide de cultures primaires de macrophages dérivées de moëlle osseuse de souris Balb/c, nous pûmes : 1) vérifier que ces gènes étaient effectivement exprimés dans ces cellules ; 2) observer que leur niveau d'expression était modulé par des conditions modifiant le phénotype des macrophages ; et 3) démontrer que leur niveau d'expression peut être diminué en transfectant les cellules par des « Dicer silencing RNAs ». Lors d'une deuxième phase du projet, notre laboratoire obtint une carte génomique plus dense, ce qui permit d'identifier un total de 1195 cis-eQTLs. Parmi ces gènes, 33 corrélaient de façon significative (P < 0.05) avec les valeurs de MVG, et 10/33 étaient concentrés dans un intervalle de 10 MB centré autour du locus du chr13 en liason avec la MVG. D'autres analyses de RT-PCR révélèrent que l'expression de ces gènes dans des cultures primaires de macrophages variaient en fonction du génotype A/B de ces cellules. Comme une telle concentration de multiples cis-eQTLs corrélant tous avec les valeurs de MVG suggérait la présence d'un régulateur commun, nous avons poursuivi nos recherches dans des banques de données génomiques, et avons pu constater que ce même intervalle de 10 MB contenait le locus du gène de micro-ARN mir-23b-27b-24-1. De façon intéressante, il a été rapporté que le micro-ARN mir-27b pouvait être lié à des changements de MVG. En résumé, ces travaux ont confirmé qu'il était faisable d'utiliser des cultures primaires de macrophages pour faire des validations biologiques concernant les rôles et/ou les caractéristiques de gènes candidats liés à la MVG. L'utilisation de telles cellules permettra de tester si des altérations de la concentration intracellulaire de mir-27B peut réguler l'abondance des transcrits de certains de nos autres gènes candidats. Puisque d'autres données de la littérature indiquent que les macrophages peuvent jouer un rôle dans les processus de remodelage ventriculaire, ces résultats pourront mener à d'autres expériences menant à déterminer si ces gènes peuvent mener à des changements de MVG via leur niveau d'expression dans les macrophages.

Tuberculosis (TB) is a major global health problem with an estimated 2 billion people worldwide infected with M. tuberculosis, the causative agent of TB, and 9.2 million new cases of active TB disease reported in 2008. Despite the enormity of the problem, little is known about the anti-mycobacterial immune responses used to detect TB infection. The aim of my studies was to investigate how host factors impact on anti-mycobacterial immune responses and to evaluate if these responses can provide clues about host susceptibility to infection and progression to disease. Healthy nuclear families were enrolled from a hyper-endemic TB region of Cape Town, South Africa. We measured in vivo tuberculin skin test (TST) responses, and used in vitro whole blood assays to determine antigen-specific IFNg cytokine release as well as the frequency of antigen-specific IFNg+CD4+ and IFNg+CD8+ cells. We showed that the in vivo TST and in vitro IFNg release assays, two assays used to detect M. tuberculosis infection, measure non-redundant pathways of anti-mycobacterial immunity. We observed a significant impact of age, but not sex, on all the immune phenotypes measured. We calculated the heritability of the immune phenotypes and observed high estimates. We performed the first genome-scan of the TST and identified a major locus on 11p14 (p = 0.000015) impacting on TST positivity (i.e. T-cell independent resistance to M. tuberculosis) and a second major locus on 5p15 (p < 0.00001) controlling the extent of the TST response. The results of the genome-scan suggested that host genetics confounds the use of TST in detection of TB infection and critically, modulates the protective immune response to M. tuberculosis infection. Finally, we provided evidence for the functional impact of NRAMP1 TB disease risk alleles on protein function. Together, the studies demonstrated the importance of host factors, in particular host genetic / La tuberculose reste un problème majeur de santé publique à travers le monde. On estime qu'environ 2 milliards de personnes dans le monde sont infectées par la bactérie M. tuberculosis, l'agent causal de la tuberculose, et on a rapporté 9,2 millions de nouveaux cas de tuberculose évolutive en 2008. Malgré l'énormité du problème, on en sait peu sur les réponses immunitaires anti-mycobactériennes utilisées pour dépister l'infection tuberculeuse. L'objectif de mon travail était de rechercher l'impact des facteurs de l'hôte sur les réponses immunitaires anti-mycobactériennes et de déterminer comment ces réponses peuvent fournir des indices sur la susceptibilité de l'hôte à développer une infection tuberculeuse et sa progression en maladie. Nous avons recruté des familles nucléaires en bonne santé vivant dans une zone hyperendémique tuberculeuse du Cap en Afrique du Sud. Nous avons interprété les réponses de l'intradermo-réaction (IDR) à la tuberculine in vivo et avons réalisé des essais immunologiques sanguins in vitro pour mesurer la production spécifique de cytokines IFNg vis-à-vis d'antigènes ainsi que la fréquence de production spécifique de cellules IFNg+CD4+ et IFNg+CD8+ vis-à-vis d'antigènes. Nous avons démontré que l'IDR à la tuberculine in vivo et les essais sanguins in vitro, deux essais servant au dépistage de l'infection tuberculeuse, mesurent les réponses immunitaires anti-mycobactériennes sans redondance. Nous avons observé que l'âge a un effet significatif, mais non le sexe, sur les essais immunitaires. Nous avons évalué l'héritabilité des phénotypes immunologiques et observé des taux élevés d'héritabilité. Nous avons effectué pour la première fois un balayage du génome à partir de l'IDR à la tuberculine et avons identifié un locus majeur sur 11p14 (p = 0.000015) ayant un impact sur la positivation de l'IDR à la tuber

The transcription factor FoxA2 and its closely related family member FoxA1 have been shown to both be expressed in the visceral and definitive endoderm, node, notochord and floor plate. Both factors have been shown to function as transcriptional activators and recognize the same DNA elements in vitro, suggesting that they may be functionally equivalent. However, there is increasing evidence, which suggest that they may play different roles in vivo. In order to begin to address whether FoxA1 is equivalent to FoxA2 in vivo, I used a gene targeting approach to replace the FoxA2 gene with the coding region of FoxA1, thus placing FoxA1 under the control of the FoxA2 regulatory elements. Screening of over 1600 clones allowed the identification of two correctly targeted ES cell lines. These ES cell lines will be an essential tool to address the functional equivalence of FoxA1 and FoxA2 in vivo.

Introduction. Programmed Death 1 is a molecule that becomes expressed on the surface of B and T cells once they are activated. Binding with its ligands, PD-L1 and PD-L2 which are found on T cells, antigen-presenting cells and peripheral tissues, causes inhibition of the PD-1-bearing cell. Knockout of the PD-1 gene in mice causes autoimmune nephritis, arthritis and cardiomyopathy. A study in humans demonstrated that an intronic SNP, named PD-1.3, is associated with lupus in several different populations. Studies on whether this polymorphism affects gene expression proved inconclusive and its biologic significance remains unknown. / Methods. We began by sequencing the gene which led to the discovery of one previously unreported SNP. Using this and twenty-six publicly available SNPs, we genotyped ninety individuals. We measured total gene expression by real-time PCR on cDNA from EBV-immortalized B cells. We tested for allelic imbalance by fluorescence polarization. As a preliminary test for alternate splicing, PCR was done on cDNA using primers that covered the exons adjacent to PD-1.3. / Results. We found five polymorphic sites in significant linkage disequilibrium with PD-1.3. One of these SNPs, PD-1.4, had shown only weak association with lupus in the above-mentioned study and another of the five is in complete disequilibrium with PD-1.4. We demonstrated that PD-1.3 lies in a region of high linkage disequilibrium. None of the twenty-seven polymorphic sites, including PD-1.3, correlated with gene expression assayed by real-time PCR or allelic imbalance. We did not demonstrate an association between PD-1.3 and alternate splicing.

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) is an enzyme involved in homocysteine metabolism. A common polymorphism in the MTHFR gene (677C→T) can result in the condition hyperhomocysteinemia when concurrent with low dietary folate intake. In several clinical studies, this polymorphism has been associated with low bone mineral density and increased fracture risk. / The MTHFR knockout mouse, a model for human hyperhomocysteinemia, was used to further investigate the bone phenotype associated with this condition by comparing heterozygous mutants to wild-type animals. Effects of a low folate diet were also assessed. / Bone strength was not decreased, and osteoclast numbers were not increased in heterozygotes or due to low folate. Expression levels of several genes involved in protection against oxidative stress were altered in heterozygotes as compared to wild-types. Bone mineral density was decreased and bone architecture changed as a result of low folate intake, especially in heterozygotes. These findings shed light on possible mechanisms of homocysteine toxicity in bone.

Salmonella cause a broad spectrum of diseases in humans ranging from asymptomatic carriage to life-threatening sepsis. The disease outcome depends partly on the host genetic background. / The contribution of genes controlling the late phase of a Salmonella infection was studied using a model based on the inoculation of a sublethal dose of S. Enteritidis in 129S6 and C57BL/6J mice. C57BL/6J mice were able to eliminate completely S. Enteritidis from their RES, whereas 129S6 mice could not. Linkage analysis of 302 (C57BL/6J X 129S6) F2 progeny identified three QTLs, Ses1, Ses2, and Ses3. They were associated with disease susceptibility in 129S6 mice, and their estimated effects on bacterial clearance were greater in females. A statistical interaction was detected between Ses1 and Ses2. The model included the QTLs, the interaction and sex as a covariate, and explained 32% of the phenotypic variance suggesting that unidentified modifiers contributed to the phenotype. / A two-locus epistasis QTL linkage analysis conducted separately in the F2 females and males identified additional QTLs with individual effects and epistasic QTLs associated with the Salmonella carrier state of 129S6 mice. The model for females included Ses3 and two significant interactions (Ses1-D7Mit267 and Ses1-DXMit48 ) accounting for 47% of the total phenotypic variance. The model for males included Ses1.1, three interactions (Ses1-D9Mit218, D2Mit197-D4Mit2 and D3Mit256-D13Mit36) and explained 47% of the phenotypic variance. / We constructed congenic mice carrying the Ses1.1, Ses1, Ses2 and Ses3 regions to validate their existence in vivo and to study their impact on Salmonella clearance (129.136). Double congenic mice Ses1/Ses2 were constructed to test functionally the statistical interaction between these QTLs. Phenotypic analysis confirmed that Ses1 and Ses1.1 contribute to bacterial clearance. / The candidacy of Nramp1 as the gene underlying Ses1 was evaluated using Nramp1-deficient mice. 129S6-Nramp1tm1Mcg mice have a significantly lower bacterial load compared to 129S6 mice, suggesting that Nramp1 influences the S. Enteritidis clearance during the late phase of infection. We observed that the 129S6 mice mounted an early and strong TH1 response, whereas the 129S6-Nramp1 tm1Mcg mice mounted an earlier and more vigorous TH 2 response that seems to improve the late phase Salmonella clearance.

Osteopetrosis is a genetic disease characterized by an excess of bone resulting from a defect in the bone resorbing osteoclasts. The discovery by our lab of the Osteopetrosis associated transmembrane protein 1 (Ostm1) gene responsible for the most severe recessive osteopetrosis in both grey-lethal (gl/gl) mice and humans provides us with the unique opportunity to decipher the role of this novel protein in a normal and pathological context. Functional rescue was undertaken by directing Ostm1 expression in multiple hematopoietic lineages including osteoclasts with a PU1-Ostm1-BAC transgene. These mice show complete rescue of the standard bone and hematopoietic osteopetrotic phenotypes however they still die prematurely. Knowing Ostm1 is highly expressed in brain tissue, we hypothesized that death was associated with CNS defects. These mice consistently display a severe neurodegenerative phenotype with stimulation of autophagy. To demonstrate the functional link of Ostm1 with the CNS we developed mouse models targeting Ostm1 to neuronal cells and astrocytes by using the specific Synapsin and GFAP promoters respectively. By rescue of neurodegeneration in these gl/gl transgenic mice using the Synapsin promoter, we established a major role for Ostm1 in neuronal cells independent of the hematopoietic and osteoclast defects. / L'ostéopétrose est une maladie génétique qui se caractérise par un défaut des ostéoclastes responsables de la résorption osseuse. Il en résulte une accumulation anormale de tissu osseux entraînant des défauts hématopoïétiques et une mort prématurée. Les travaux antérieurs du laboratoire ont permis la découverte et la caractérisation du gène gl (Ostm1) qui est responsable de la plus sévère forme d'ostéopétrose récessive chez la souris gl/gl et l'humain. Cette découverte constitue une occasion unique de décrypter le rôle de cette protéine peu connue dans un contexte normal et pathologique. / Lors d'un essai de complémentation des phénotypes hématopoïétiques dans la souris gl/gl, l'expression du gène Ostm1 a été ciblée dans des souris transgéniques en utilisant les séquences régulatrices du gène PU.1. Ce facteur transcriptionnel est exprimé très tôt au cours de l'hématopoïèse dans plusieurs lignées incluant l'ostéoclaste. Ces souris transgéniques ont été caractérisées et ensuite croisées successivement pour générer les souris PU.1-Ostm1-gl/gl. Ces souris n'étaient plus ostéopetrotiques, ne présentaient plus de défauts hématopoïétiques affectant les cellules B et T mais cependant mourraient prématurément. / Sachant qu'Ostm1 est fortement exprimé dans le cerveau, nous avons émis l'hypothèse selon laquelle cette mort prématurée pouvait être reliée à un defaut du systéme nerveux. En effet, ces souris démontrent une neurodégénération progressive associée à une stimulation de l'autophagie. Afin de prouver le lien fonctionnel entre Ostm1 et le phénotype neuronal, nous avons générer deux modèles de souris ciblant l'expression d'Ostm1 respectivement dans les neurones et les astrocytes en utilisant les promoteurs spécifiques Synapsin et GFAP. En complémentant cette neurodégénérescence dans les souris transgéniques gl/gl avec le promoteur Synapsin, nous avons réussi à établir un rôle majeur pour Ostm1 spécifique aux cellules neuronales indépendamment des défauts hématopoïétiques et des ostéoclastes.

Thesis (Ph.D.)--University of California, San Francisco, 2005. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 66-12, Section: B, page: 6393. Adviser: Cynthia Kenyon.

Thesis (Ph.D.)--University of California, San Francisco, 2005. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 66-12, Section: B, page: 6395. Adviser: Renee Reijo Pera.