Brain tumours are currently the leading cause of cancer related mortality and morbidity in the pediatric years and astrocytomas are the most common type of central nervous system tumours. High grade astrocytomas in children are rare; however, they have a high rate of morbidity and mortality. Our first focus was to identify gene expression profiles specific to grade IV pediatric astrocytomas also known as glioblastomas (GBM). We demonstrated that pGBM is distinct from adult GBM in their gene expression profile and also showed that there are at least two subsets of pGBM that can be distinguished based on their association or lack of association with an aberrantly active Ras and Akt pathway in a sample. These results were further confirmed using an independent data set consisting of formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) pGBM samples. We further aimed to characterize whether grade III and IV pediatric astrocytomas had distinct gene expression profiles. Our results indicate that Grade III astrocytomas have unique gene expression signatures when compared to pGBM, including upregulation of the mTOR pathway, which was found to be the most differentially regulated between the two tumour grades. Analysis of our microarray results to identify genes differentially regulated specifically in pGBM and accounting for gliomagenesis led us to focus on sorting nexin 3 (SNX3), a protein involved in endosomal trafficking, based on its role in modulating EGFR, Ras and PI3K/Akt activation; which are major targets and signaling pathways in GBM. We showed that SNX3 is upregulated specifically in primary GBM tumours, and that this upregulation correlates with increased EGFR and MET expression in samples. Overexpression of SNX3 in pGBM cell lines, delayed EGFR degradation, sustained EGFR and MET signaling, increased cell proliferation, and induced tumorigenesis in vivo. Our work indicate that there are specific targets in gliomagenesis in children and identify the mTOR pathway and deregulation of endosomal recycling as potential drivers of gliomagenesis in respectively pediatric grade III and IV astrocytomas. / Les tumeurs cérébrales sont actuellement la principale cause de mortalité et de morbidité liée au cancer chez l'enfant. Parmi elles, les astrocytomes sont le type de tumeur le plus fréquent. Les astrocytomes de haut grade sont rares à l'âge pédiatrique, avec cependant, un taux de morbidité et de mortalité particulièrement élevé. Durant ma thèse, le principal objectif a initialement été d'identifier les profils d'expression génétique spécifiques aux astrocytomes de grade IV ou glioblastomes pédiatriques (pGBM). Nous avons montré que les pGBM diffèrent des GBM adultes par leur profil d'expression génique et nous avons également identifié deux sous-ensembles de pGBM, distincts par l'activation ou non des voies de signalisation Ras et Akt. Ces résultats ont été validés sur un échantillon indépendant de pGBM fixés dans du formol et inclus dans la paraffine. Cette thèse a eu également pour but de caractériser les profils d'expression génique des astrocytomes pédiatriques de grade III et IV. L'analyse des données obtenues par microarray a identifié une signature unique aux astrocytomes de grade III par rapport aux pGBM, notamment par une suractivation de la voie mTOR. . Parmi les gènes spécifiquement dérégulés dans le groupe des pGBM, nous avons identifié Sorting Nexin 3 (SNX3) comme potentiellement impliqué dans l'oncogénèse des pGBM avec une activation des voies Ras et Akt. SNX3 est une protéine jouant un rôle dans le trafic endosomal des plusieurs récepteurs membranaires, dont EGFR. Par immunohistochimie, nous avons confirmé la surexpression de SNX3 et sa corrélation avec celle de récepteur tyrosine kinases telles que EGFR et MET. In vitro, la surexpression de SNX3 dans des lignées cellulaires de GBM entraine un retard de la dégradation d'EGFR, augmentant la signalisation de la voie Ras. Les cellules acquièrent ainsi un avantage de prolifération in vitro et de tumorigenèse in vivo. Nos travaux ont identifié de nouvelles cibles potentielles impliquées dans l'oncogenèse de ces tumeurs, telles que la voie mTOR dans les astrocytomes de grade III et SNX3 et la dérégulation du trafic endosomal dans les pGBM.

Vitamin B12 (cobalamin, Cbl) is an essential cofactor for two human enzymes: methylmalonyl-CoA mutase (MUT) and methionine synthase (MTR). MUT utilizes 5'-deoxyadenosylcobalamin (AdoCbl) to convert methylmalonyl-CoA to succinyl-CoA in the mitochondria, whereas MTR utilizes methylcobalamin (MeCbl) to convert homocysteine to methionine in the cytoplasm. To date, eight complementation groups (cblA-G and mut), each the result of mutations at a different gene, have been discovered to be involved in the intracellular metabolism of cobalamin. A patient presented at birth, following an abnormal newborn screen, with hypotonia, lethargy, poor feeding and bone marrow suppression. There were elevated levels of methylmalonic acid and homocysteine, suggestive of a defect in vitamin B12 metabolism. Studies of cultured fibroblast showed decreased function of the cobalamin-dependent enzymes, MTR and MUT. There was increased uptake of labelled cyanocobalamin (CNCbl) but decreased synthesis of the cobalamin cofactors MeCbl and AdoCbl, with accumulation of "free" (i.e. non-protein bound) CNCbl in the cells. The cellular phenotype mimicked that of the cblF disorder caused by mutations in the LMBRD1 gene encoding the lysosomal membrane protein LMBD1 that is thought to play a role in transfer of cobalamin across the lysosomal membrane into the cytoplasm. However, cells from the patient complemented those from all known complementation groups, including cblF, and no mutations in LMBRD1 were found. Whole-exome sequencing led to the identification of two mutations in the ABCD4 gene: c.956A>G (p.Y319C) and c.1746_1747insCT (p.E583LfsX9). Two additional patients with deleterious ABCD4 mutations were later found. Transfection of patient fibroblasts with wild type ABCD4 led to rescue of all abnormal cellular phenotypes. This thesis reports that this novel disorder, named cblJ, is an autosomal recessive disorder caused by mutations in ABCD4. The findings suggest that ABCD4, an ABC half-transporter, is another essential component of intracellular cobalamin metabolism. / La vitamine B12 (cobalamine, Cbl) est un cofacteur essentiel pour deux enzymes de l'homme: la méthylmalonyl-CoA mutase (MUT) et la méthionine synthase (MTR). La MUT utilise 5'-deoxyadenosylcobalamin (AdoCbl) pour convertir la méthylmalonyl-CoA en succinyl-CoA dans la mitochondrie, alors que MTR utilise la méthylcobalamine (MeCbl) pour convertir l'homocystéine en méthionine dans le cytoplasme. À ce jour, huit groupes de complémentation (cblA-G et mut) ont été découverts à être impliqués dans le métabolisme intracellulaire de la cobalamine. Chacun est le résultat de mutations au niveau d'un gène différent. Un patient s'est présenté à la naissance, suite à une anomalie sue le dépistage nouveau-né, avec l'hypotonie, la léthargie, la mauvaise alimentation et la suppression de la moelle osseuse. Le patient avait des niveaux élevés d'acide méthylmalonique et d'homocystéine, suggérant un défaut dans le métabolisme de la vitamine B12. Les études de fibroblastes cultivés ont démontré une diminution de la fonction des enzymes dépendants sur la cobalamine, MTR et MUT. Il avait aussi une augmentation de l'absorption de la cyanocobalamine (CNCbl), mais une diminution de la synthèse de cofacteurs cobalamine la MeCbl et AdoCbl, avec une accumulation de CNCbl "libre" (c'est à dire non liée aux protéines plasmatiques) dans les cellules. Le phénotype cellulaire imitait celle de la maladie cblF, causée par des mutations dans LMBRD1, le gène codant pour la protéine membrane lysosomale LMBRD1, qui semble jouer un rôle dans le transfert de la cobalamine à travers la membrane lysosomale dans le cytoplasme. Cependant, les cellules des deux patients complémentaient celles de tous les groupes de complémentation connus, y compris cblF, et aucune des mutations dans LMBRD1 ont été trouvés. Le séquençage de l'exome a mené à l'identification de deux mutations dans le gène ABCD4: c.956A>G (p.Y319C) et c.1746_1747insCT (p.E583LfsX9). Deux autres patients avec des mutations dans ABCD4 ont été retrouvés. Toutes les mutations ont été prévues d'être nocives. La transfection de fibroblastes de patients avec ABCD4 de type sauvage a conduit à sauver tous les phénotypes cellulaires anormaux. Cette thèse rapporte que ce trouble inédit, nommé cblJ, est une maladie autosomique récessive causée par des mutations dans ABCD4. Les résultats suggèrent qu'ABCD4, un demi-ABC transporteur, est un autre élément essentiel du métabolisme de la cobalamine intracellulaire.

Retinoblastoma, Rb, tumor suppressor protein is a cell cycle regulator preventing transition from G1 to S phase. Rb also regulates various biological processes during development and tumorigenesis. While the molecular mechanism by which pRb controls cell cycle progression is well characterized, how pRb promotes cell-type specification and differentiation is less understood. A genetic overexpression screen searching for factors cooperating with mutations in rbf1, the Drosophila homologue of Rb, lead to the identification of emc, extramacrochaetae, whose mammalian homologue Id2 has a known role in pRb-deficient tumorigenesis. The goal of my project is to understand the role of rbf1 in development and differentiation through a study of the genetic interaction between rbf1 and emc. In my thesis, I have demonstrated that RBF1 deficiency during Drosophila melanogaster eye development deregulates EMC, causing defects in the development of photoreceptors and cone cells; consequently, I have shown EMC is an important protein contributing to the developmental defects caused by RBF1 deficiency. My first aim is to characterize the defects associated with emc overexpression in rbf1 mutant background as well as the intrinsic defects associated with the rbf1 mutant background. I found that EMC overexpression in rbf1 hypomorphic eye imaginal discs of third instar Drosophila larvae, induces cone cell and photoreceptor, two types of eye-specific cells, defects while having no such effects in the wild-type background. Examination of the differentiating photoreceptors, indicated that EMC overexpression interferes with photoreceptors that are specified at later stages of Drosophila eye development, specifically in the rbf1 mutant background. Furthermore, given the role of RBF1 as a transcriptional repressor, I examined the effect of RBF1 on EMC level and discovered that, in rbf1 null clones, EMC was upregulated, in particular, within the photoreceptors. I then proceeded to characterize the photoreceptor clusters and discovered that more than one third of the rbf1 null ommatidia exhibit similar cone cell and photoreceptor defects in the absence of ectopic EMC expression.My next aim was to elucidate the mechanism of the interaction between rbf1 and emc. To test for conservation of the physical interaction demonstrated in mammals in Drosophila, I tested for an interaction between EMC and RBF1 but no conservation was observed either in S2 cells or in vivo. Moreover, I determined the level of regulation of EMC by RBF1 is post-transcriptional and can be ubiquitin-dependent. To be able to follow EMC protein, I generated a transgenic fly line carrying a GFP tagged EMC which I used to observe that RBF1 suppresses expression of ectopic EMC protein in photoreceptors. This could explain the synergistic effect between EMC overexpression and rbf1 mutations, as well as the developmental defect observed in rbf1 null ommatidia. In summary, EMC cooperates with RBF1 in Drosophila eye development and is post-transcriptionally regulated. My findings demonstrate that ID family proteins are an evolutionarily conserved determinant of pRb deficient cells, playing an important function during development. / Le suppresseur de tumeurs Rétinoblastome, Rb, est une protéine régulatrice du cycle cellulaire qui empêche le passage de la cellule de la phase G1 à la phase S. En même temps, Rb est aussi un régulateur de plusieurs processus biologiques durant le développement normal et la tumorigénèse. Même si le mécanisme moléculaire utilisé par Rb pour contrôler la progression du cycle cellulaire est bien connu, le processus par lequel Rb promouvoit la spécification cellulaire et la différentiation est moins bien comprise. Un criblage génétique de surexpression cherchant des facteurs qui coopèrent avec des mutations de rbf1, l'homologue de Rb pour Drosophila, a mené à l'identification de emc, extramacrochaetae, dont l'homologue mammifère Id2 a un rôle bien connu dans la tumorigénèse en l'absence de Rb. Le but général de mon projet est de comprendre le rôle de Rb dans le développement et la différentiation à travers une étude de l'interaction génétique entre rbf1 et emc. Dans ma thèse, j'ai démontré que l'absence de Rb pendant le développement de l'œil de Drosophila melanogaster dérégule EMC, ce qui cause des défauts dans le développement des cellules photoréceptrices et des cônes; en conséquence, j'ai confirmé qu'EMC est une protéine importante qui contribue aux défauts développementaux causés par la déficience de Rb. Mon premier objectif est de caractériser les défauts associés à la surexpression de emc en absence de rbf1 et aussi de caractériser les défauts intrinsèques associés au profil où rbf1 est déficient. J'ai trouvé que la surexpression de EMC dans les disques imaginaires oculaires de larves de drosophiles au troisième stade possédant une forme hypomorphe de rbf1 mène aux défauts dans les photorécepteurs et dans les cônes, deux types de cellules oculaires spécifiques, mais ne mène pas à des effets similaires dans le profil de type sauvage. Mes études des cellules photoréceptrices en différentiation indiquent que la surexpression d'emc interfère avec le développement des photorécepteurs spécifiés tard dans le développement oculaire de Drosophila, en particulier dans le profil ou rbf1 est muté. De plus, connaissant le rôle de RBF1 en tant que répresseur transcriptionnel, j'ai examiné l'effet de RBF1 sur les niveaux de la protéine EMC et j'ai découvert que, dans les clones nuls pour rbf1, EMC était régulé positivement, en particulier dans les cellules photoréceptrices. Ensuite, j'ai caractérisé les ensembles de cellules photoréceptrices et j'ai découvert que plus d'un tiers des ommatidia nuls pour rbf1 présentent des photorécepteurs et des cônes ayant des défauts développementaux en l'absence de la surexpression ectopique d'EMC.Mon deuxième objectif est d'élucider le mécanisme d'interaction entre rbf1 et emc. Chez les mammifères, il y a une interaction physique observée entre pRb et ID2. Afin de tester la conservation de cette interaction physique dans Drosophila, j'ai examiné l'interaction entre RBF1 et EMC, mais je n'ai pas observé de conservation de cette interaction ni dans les cellules S2, ni in vivo. D'ailleurs, j'ai déterminé que la régulation de EMC par RBF1 est au niveau post-transcriptionnel et qu'il peut dépendre de l'ubiquitin. Dans le but d'être capable de suivre la protéine EMC ectopique, j'ai produit une ligne de mouches transgéniques portant GFP-EMC. J'ai utilisé cette ligne pour observer que RBF1 régule négativement l'expression de la protéine EMC ectopique dans les photorécepteurs. Ceci pourrait expliquer l'effet synergique entre la surexpression d'EMC et les mutations de rbf1 ainsi que les défauts développementaux observés dans les ommatidia déficientes pour rbf1. En résumé, EMC coopère avec RBF1 dans le développement de l'œil de Drosophila et est régulé de manière post-transcriptionnelle. Mes découvertes démontrent que les protéines de la famille ID sont un déterminant des cellules dans lesquelles Rb est absent qui est conservé évolutionnairement et qui possède une fonction importante durant le développement.

In most eukaryotes, efficient energy generation depends on the presence of a functional mitochondrial respiratory chain. The respiratory chain is composed of five protein complexes, with dozens of accessory factors that participate and are essential to their correct assembly. However, little is known about the assembly process for the first and largest complex, NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I). This work describes the first experimental evidence of the involvement of Pro1853 in the assembly of complex I. This protein was found through sequence comparison and phylogenetic analysis, and its knockdown in human cell culture and zebrafish embryos was shown to cause a specific reduction in fully assembled complex I. These results contribute to increase the current knowledge on complex I assembly and in the future might shed light on the understanding of unexplained mitochondrial diseases due to complex I deficiency. / Chez la plupart des eucaryotes, la production efficace d'énergie dépend de la présence d'une chaîne respiratoire mitochondriale fonctionnelle. La chaîne respiratoire est composée de cinq complexes protéiques, avec des dizaines de facteurs accessoires qui participent et sont essentiels pour leur assemblage correcte. Néanmoins, le processus d'assemblage du premier et plus grand des complexes, NADH:ubiquinone oxidoréductase, est peu connu. Le présent travail décrit la première preuve expérimentale de la participation de la Pro1853 dans l'assemblage du complexe I. Cette protéine a été identifiée par des comparaisons de séquences et des analyses phylogénétiques et l'inhibition de son expression dans des cultures de cellules humaines et dans des embryons de poisson-zèbre mène spécifiquement à une diminution des quantités de complexe I. Ces résultats contribuent à augmenter les connaissances actuelles du processus d'assemblage du complexe I et dans le futur peuvent prendre part à la compréhension de maladies mitochondriales liées à ce complexe dont les causes sont encore inexpliquées.

Signals from the extracellular matrix (ECM), mediated by integrins, play critical roles in regulating gene expression, differentiation, function, and survival of osteoblasts. Following engagement with the ECM, integrin receptors signal via multiple downstream effectors, including the Integrin-Linked Kinase (ILK). The net effect of stimulating the ILK signaling cascade is to modulate gene transcription: ILK-dependent phosphorylation of the cJun transcriptional coactivator, aNAC, induces the nuclear accumulation of the coactivator and potentiates c-Jun-dependent transcription. In order to determine the role of ILK in osteoblasts, we first inactivated ILK using RNA knockdown in osteoblastic cells. In parallel, we engineered mice with specific inactivation of ILK in osteoblasts and analyzed the phenotype of the mutant animals, as well as the behavior of primary cultures of ILK-deficient osteoblasts. MC3T3-E1 preosteoblasts were stably transfected with expression plasmid vectors encoding specific ILK siRNAs or a control, unrelated siRNA. Pools of cells stably transfected with each of the expression vectors were established and analyzed. ILK protein expression was efficiently inhibited in the ILK siRNA-transfected cells. Inhibition of Ilk expression led to cytoplasmic retention of aNAC and increased expression of the osteoblastic differentiation markers, collagen type I, bone sialoprotein, and osteocalcin. Strikingly, ILK-deficient osteoblasts showed dramatically increased mineralization. Mice with one inactivated ILK allele (ILK+/-) were mated with Col-I-Cre transgenic mice. Progeny from this cross (Col-I-Cre;ILK+/-) was bred to mice homozygous for a floxed ILK allele (ILKfl/fl) to yield mutant mice with ILK-deficient osteoblasts (C / Les signaux de la matrice extracellulaire (ECM) qui sont transmis par les récepteurs intégrines sont essentiels pour contrôler l'expression génique, la différenciation, la fonction, et la viabilité des ostéoblastes. Suite à la liaison entre les intégrines et l'ECM, ces récepteurs transmettent leur signal via des messagers secondaires, incluant l'Integrin-Linked Kinase (ILK). La stimulation de ILK a comme effet de moduler l'expression génique : ILK est capable de phosphoryler le coactivateur transcriptionnel aNAC, ce qui induit la translocation nucléaire de ce dernier. Notre but était d'étudier le rôle de ILK dans les ostéoblastes. Premièrement, nous avons inhibé ILK en utilisant des ARN interférents dans les ostéoblastes MC3T3-E1. En parallèle, nous avons développé des souris déficientes en ILK dans les ostéoblastes seulement, et nous avons analysé le phénotype osseux ainsi que le comportement en cultures primaires des cellules ostéoblastiques déficientes en ILK. L'inhibition de ILK par interférence à l'ARN induit la rétention cytoplasmique d'aNAC, et augmente l'expression de marqueurs ostéoblastiques, tel le collagène de type I, la sialoprotéine de l'os, et l'ostéocalcine. De plus, nous avons mesuré une augmentation dramatique de la minéralisation. Des croisements précis ont permis de produire des souris dont un allèle de ILK est inactif dans tous les tissus, et l'autre allèle est inactif seulement dans les ostéoblastes (génotype : ColI-Cre; ILK-/fl). Les os ont été récoltés à plusieurs intervalles, et analysés par µCT et histomorphométrie. Les souris déficientes en ILK dans les ostéoblastes ne présentent aucun changement des paramètres histomorphométriques statiques ou d

Transforming growth factor-p (TGFp) pathways have been shown to regulate renal branching morphogenesis, one of the key processes determining the final number of nephrons. Although Smads are known to be downstream mediators of these signals, little is known about their role in kidney development. Using RT-PCR and in situ hybridization we investigated the expression of Smads during kidney development. We have found that the receptor regulated Smads (1, 2, 3, 5 and 8) as well as the common partner (Smad4), are expressed in the developing kidney during nephrogenesis. These factors have a specific expression pattern that overlaps with the expression of the signalling molecules BMP-4 and TGFpi. Expression of Smads 1, 3, 4, 5 and 8 is mainly found in undifferentiated mesenchymal cells of the nephrogenic zone as well as ureteric bud tips, but is downregulated in condensing mesenchymal structures. Smad 2 is mostly expressed in the stromal cell compartment. The distinct, yet overlapping, expression of Smads suggests that the specificity of TGFp signals might be determined in part by the combination of Smads expressed in a particular cell type. To better characterize the role of TGFP in kidney development, mouse embryonic kidney explants were treated with soluble TGFP ligands. Addition of BMP-2 and TGFpi inhibited renal branching morphogenesis through their effects on proliferation and survival. Similarly, proliferation and survival appeared to be the critical processes affected by TGFP signalling in the mIMCD-3 model of tubulogenesis. The direct role of Smads was examined by overexpression of a Smad3-GFP fusion protein in mIMCD-3 cells. Apoptosis was most frequently co-localized to Smad-3 transfected cells, which was consistent with the effects observed from the ligand, TGFpi. To test these observations in vivo, we developed a novel method for the manipulation of embryonic kidney explants in culture. GFP-expression vectors were introduced in kidney explants without loss in viability, and the expression of GFP was found to be rapid and sustained for several days in culture. In summary, this study has placed Smads downstream of TGFP signals in the developing kidney, and it opens the door to finding molecules that might be affected by these signals.

The establishment of methylation patterns is initiated during gametogenesis and continues during early embryonic development. DNA (cytosine-5)-methyltransferase (Dnmt1) is the major enzyme that catalyzes the formation of 5-methyl cytosine. Dnmt1 is the predominant de novo and maintenance methyltransferase in mammals. Recently, Dnmt1 has been shown to interact with Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), a marker for DNA replication and repair. Here, PCNA is proposed to localize to sites of Dnmt1, suggesting a role in the maintenance and establishment of DNA methylation patterns. Adult male testis was examined and Dnmt1 staining was found in spermatogenesis from the type A spermatogonia to the meiotic pachytene cells at stages II--III where it was down regulated. PCNA staining was also found in the same cell types and was down regulated at stage VIII of spermatogenesis. Dnmt1 and PCNA co-localize in spermatogenesis starting in the mitotic type A, intermediate (In) and type B spermatogonia, and continuing in preleptotene spermatocytes, meiotic leptotene/zygotene and early pachytene spermatocytes. The co-localization rate of PCNA to Dnmt1 positive cells was high. Subcellular examination of isolated cells from day 14 male testis revealed nuclear foci of both Dnmt1 and PCNA in the meiotic cells, and a co-localization of foci in other mitotic cells. Furthermore, PCNA was also found to be present within the nucleus of the primary, secondary and germinal vesicle stage oocytes of the adult female mouse. These results provide evidence supporting a role for the collaboration of PCNA with Dnmt1 at sites of DNA methylation. (Abstract shortened by UMI.)

When faced with unsatisfactory environmental conditions, young C. elegans larvae can enter a diapause-like stage called dauer. The decision to form dauer is controlled by three parallel signalling pathways (TGF-β, cGMP and insulin/IGF-like signalling) that converge on DAF-12, a nuclear hormone receptor that prompts either dauer formation or reproductive growth depending on the environmental cues presented to C. elegans during its development. DAF-12 is related to the Vitamin D, Liver-X, and Androstane receptors, and similar to these human NHRs, responds to cholesterol-derived hormones. Ligand-bound DAF-12 has transcriptional activity directing reproductive development, while unliganded DAF-12 forms a dauer-specifying complex that regulates the transcription of genes required for dauer development with its interacting protein DIN-1S. I report here that din-1S is required in the germ cells upstream of insulin-like signalling (IlS) and in parallel to LKB1/par-4 signalling to establish dauer germline quiescence. I also observed that din-1S is important for post-dauer reproductive fitness when IlS is impaired. Moreover, I demonstrate that din-1S is necessary for long dauer life span in response to reduced insulin signalling, either downstream of, or in parallel to, AMPK/aak-2. Finally, I show that din-1S acts upstream of IlS pathway components to restrict somatic gonad precursor cell proliferation during dauer development, and uncover a conditional role for LKB1/par-4 signalling in this process. / Chez C. elegans, des conditions de croissance inadéquates promeuvent l'entrée dans un stade de dormance appelé dauer. La décision d'entrer en dauer est contrôlée par trois cascades de signalisation parallèles qui convergent sur DAF-12, un récepteur d'hormone nucléaire qui, dépendamment des signaux environnementaux qui se présentent à l'animal pendant son développement, l'incite à entrer en dauer ou à croître reproductivement. DAF-12 est apparenté aux récepteurs de la Vitamine D, des oxystérols et des androstanes et, comme ces récepteurs nucléaires humains, réagit à des hormones dérivées du cholestérol. En présence de son ligand, DAF-12 possède une activité transcriptionnelle qui dirige le développement reproductif, tandis qu'en l'absence de cette hormone, DAF-12 forme un complexe spécifique au stade dauer avec son partenaire DIN-1S et régule la transcription de gènes requis pour le développement de ce stade. Mes analyses génétiques suggèrent que din-1S est requis dans la lignée germinale en amont de la cascade de signalisation par l'insuline et en parallèle de LKB1/par-4, afin d'établir la dormance des cellules germinales pendant le développement du stade dauer. Je démontre que din-1S est nécessaire pour le succès reproductif après ce stade lorsque la cascade de signalisation par l'insuline est perturbée. Je révèle aussi que din-1S est essentiel pour la longue vie des larves dauer en réponse à une réduction de signalisation par l'insuline, en aval ou bien en parallèle de AMPK/aak-2. Finalement, je montre que din-1S fonctionne en aval des composantes de la voie de signalisation par l'insuline afin d'empêcher la prolif

Mammalian mitochondrial DNA (mtDNA) is a maternally inherited, multi-copy, small circular genome approximately 16 kb in size that codes for 13 polypeptides of the mitochondrial respiratory chain. Typically, mtDNA is present as only one genotype in a cell, a state known as homoplasmy. In rare circumstances, two or more mtDNA sequence variants can be present in a cell, a state known as heteroplasmy, and these sequence variants can segregate during mitosis and meiosis. In this thesis, I have investigated the basis for a novel tissue-specific segregation of mtDNA in a heteroplasmic mouse model that had been previously constructed from two inbred strains (NZB/BinJ and BALB/c mtDNA). In these mice, four tissues showed directional selection for an mtDNA genotype: in the liver and kidney for the NZB mtDNA genotype; and in the spleen and blood for the BALB mtDNA genotype. I investigated the mechanism responsible for selection of NZB mtDNA, focusing on the liver which showed the strongest effect. In this tissue, selection for the NZB mtDNA genotype is constant with time, independent of allele frequency and does not appear to be mediated through an advantage of respiratory chain function or replication rate of mtDNA. To identify the genetic basis for this mtDNA selection, I set up an intersubspecific intercross and used quantitative trait loci (QTL) mapping to map three QTL in F2 mice that are strong gene effects in the liver, kidney, and spleen. These QTLs, Smdq-1 (liver), Smdq-2 (kidney), and Smdq-3 (kidney & spleen) (s&barbelow;egregation of m&barbelow;itochondrial D&barbelow;NA Q&barbelow;TL-#) map to chromosome 5, 2, and 6 respectively. Smdq-1 was a dominant QTL in the liver that mapped to a 2 LOD support interval of approximately 1 cM and accounted for 34% of the variation in the trait. To reduce the interval size of Smdq-1 and confirm the map position, BALB chromosome 5 interval-specific congenic mice lines are being generated across a 20 cM interval. This is the fir

Spontaneous mutations occur in all genomes as the result of normal cellular mechanisms and interactions with the environment. In addition to their important contribution to genetic diversity and evolution, spontaneous mutations are associated with several genetic disorders and certain cancers. Spontaneous mutational events comprise an impressive heterogeneity of DNA alterations which can be categorized into two major classes: "moderate" and "potent" mutations. Spontaneous moderate mutations are defined here as comprising mutations with a subtle (i.e. leaky, reversible) effect on the encoded phenotype of a gene. In contrast, potent mutations can severely and permanently alter a gene's phenotype and may result in more important DNA alterations. The selective enrichment for the isolation and characterization of potent mutations can be hindered by the frequent occurrence of more moderate mutations. / A selection procedure was thus developed to enrich for spontaneous potent mutations in the KT cell line, comprising a chromosomally-integrated, single-copy plasmid pSV2neoKT, which contains the $neo sp{ rm R}$ and the HSV-1 thymidine kinase (tk) genes. Spontaneous $tk sp-$ mutants were selected on the basis of their resistance to nucleoside analogues (acyclovir (ACV), trifluorothymidine (TFT), and ganciclovir (DHPG)). In order to enrich for potent mutations bearing severe consequences for the function of the tk gene, over the "background" of more simple moderate mutations, an enrichment procedure was established and verified. Combinations of nucleoside analogues reduced the apparent mutation frequency in the tk gene and allowed the enrichment for potent mutations with a severe impact on the TK phenotype. The different potencies of the compounds and their potential synergisms during the selection for $tk sp-$ mutants is also discussed. / Mutants resistant to ACV + TFT + DHPG demonstrated a stable TK$ sp-$ phenotype, as they did not revert to wild type at a detectable frequency, and the severe effect on gene function was exemplified by the absence of a TK protein, discernible by Western blotting, in $>$85% of these multiple drug resistant mutants. In contrast, the moderate $tk sp-$ mutants resistant to TFT only, demonstrated phenotype reversal at a high frequency and a detectable TK polypeptide. Between 14.5% and 25% of the potent $tk sp-$ mutants resistant to combinations of drugs underwent a major DNA alteration, consisting mostly of partial, or complete, deletions of the tk gene. Complex rearrangements of the tk gene were also obtained, and an intragenic deletion/duplication event is presented and characterized. However, it was observed that more than 75% of the spontaneous potent mutational events implicated less than 5 bp of the tk gene, yet presented a null phenotype of stable complete alteration of the TK phenotype. The level of mutated tk transcripts was affected in 64% to 70% of the small potent $tk sp-$ mutants, as demonstrated by Northern blotting. Extensive DNA methylation and multidrug resistance (MDR) seemed not to be implicated in the generation of the TK$ sp-$ phenotype observed in the small potent $tk sp-$ mutants. / Thus, the KT cell line, combined with the use of multiple nucleoside analogues, allows the enrichment for, and the characterization of, potent (and infrequent) spontaneous mutations in a human chromosomal context. The mutational events characterized in this study may then reflect the diversity, the complexity, and the dynamics of the human genome.