Mounting evidence now converges towards an altered cholesterol metabolism in Alzheimer's disease (AD). Other recent reports suggest that statins, or 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) inhibitors, the rate-limiting enzyme in the biosynthetic pathway of cholesterol, protect against AD. Using a large French Canadian cohort, we demonstrate that a single nucleotide polymorphism (SNP) within Hmgr gene greatly diminishes the risk of developing AD, while a second SNP appears as a risk factor, by influencing the age of onset of the disease. This latter SNP may interfere in neurofibrillary tangles (NFT) formation, one of the neuropathological hallmarks of AD, as well as in HMGR expression and protein levels in the frontal cortex, a region severely affected by AD. Thus, the involvement of Hmgr gene and its downstream metabolic pathway in AD onset, and perhaps also in its progression, seems more than likely. / Maintes preuves convergent aujourd'hui vers un métabolisme du cholestérol anormal dans la maladie d'Alzheimer (MA). D'autres constats suggèrent que les statines, ou inhibiteurs de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase (HMGR), l'enzyme limitante de la voie de synthèse du cholestérol, protégeraient contre cette maladie. À partir d'une large cohorte de Canadiens français, nous démontrons qu'un polymorphisme du gène codant pour HMGR diminue fortement le risque de développer la MA, alors qu'un second constitue un facteur de risque influençant l'âge de début de la maladie. Ce dernier semble intervenir dans la formation d'enchevêtrements neurofibrillaires, l'une des marques neuropathologiques de la MA, ainsi que sur l'expression et les niveaux de protéines de HMGR dans le cortex frontal, l'une des régions gravement touchée par la maladie. L'implication de ce gène, et la voie métabolique s'y rattachant, dans le développement, et possiblement la progression, de la MA semble donc plus que probable.

Glucocorticoid (GC) stimulation of both branching morphogenesis and cytodifferentiation in the developing lung is mediated by the Glucocorticoid Receptor (GR). Seventy-five percent of mice homozygous for a targeted disruption of the GR gene (GR hypo) die shortly after birth due to respiratory failure. Surviving GRhypo mice are normal and fertile. We used Differential Display Reverse Transcription PCR (DD-PCR) and then cDNA microarrays to identify differentially expressed genes in GR hypo compared to wildtype mice. The retinoic acid responsive gene, midkine (MK) was up-regulated in GRhypo mice at fetal day 18 and at neonatal day 1 (in both survivors and non-survivors). At fetal day 16.5, MK was down-regulated in GRhypo mice compared to wildtype. GC treatment up-regulated MK expression in fetal day 20 rat lung Epi cells in primary culture. These results indicate that in the absence of GR, MK is disregulated in the lung: in the pseudoglandular and canalicular stage, MK is down-regulated, but by the saccular stage, and then shortly after birth, the absence of GR results in up-regulation of MK expression. Our findings suggest that down-regulation of the growth factor MK in late gestation is essential to normal terminal differentiation of the fetal lung.

Coxsackievirus B3 (CVB3) is a relatively common cause of infection. Infection by coxsackieviruses is typically mild and resolves quickly without lasting complications. In a subset of individuals, coxsackievirus infection can be severe, leading to permanent damage of vital organs or even death. The mouse presents an ideal model to study natural variation in response CVB3 infection as human isolates of CVB3 productively infect the mouse, and lead to similar pathologies as found in humans. Inbred strains of mice respond differently to CVB3 infection, therefore the genetic background of the host can determine susceptibility to CVB3 infection. We hypothesize that interrogation of genetically determined susceptibility to CVB3 infection will help to identify genes whose direct involvement in control of CVB3 was previously unsuspected. To characterize the contribution of host genetics to coxsackievirus, we screened a panel of recombinant congenic strains (RCS) generated from susceptible A/J and C57BL/6 progenitors. While most C57BL/6 background (BcA) strains were more susceptible than C57BL/6, BcA86 in particular was particularly susceptible to early lethality and hepatic necrosis. A segregating [BcA86xC57BL/10]F2 mapping cross led to the identification of a locus on distal chromosome 13 controlling liver damage during coxsackieviral hepatitis. Previously through the analysis of a segregating we detected the Vms1 (viral myocarditis susceptibility) locus on distal chromosome 3. Vms1 controls viral replication, inflammation and necrosis within the heart during CVB3 infection. We have further refined this locus in additional mapping crosses and congenic lines of mice. We have also determined that Vms1 controls viral replication before inflammation becomes evident within the heart. The cardiac specific kinase Tnni3k is a candidate gene for Vms1. We found that overexpression of TNNI3K greatly enhanced necrosis and inflammation in the heart following CVB3 infection. Furthermore, we found increased viral replication and gene expression and changes within isolated cardiomyocytes, indicating TNNI3K is implicated in a heart specific immune pathway. Altogether, our results provide new functional insight into the host determinants of pathogenesis following infection with coxsackievirus B3. / Les virus Coxsackie du groupe B3 (CVB3) sont retrouvés partout dans le monde et il y a une prévalence saisonnière. L'infection par CVB3 se manifeste de manière différente selon les personnes. Certains individus ne développent pas de maladies cliniquement apparentes et guérissent spontanément, tandis que d'autres risquent de développer des complications plus sévères comme des affections cardiaques, des hépatites où des atteintes du système nerveux central. Les cas les plus graves peuvent entraîner la mort du sujet. La souris de laboratoire constitue un modèle idéal pour étudier les mécanismes inhérents à ces formes diverses des maladies induites par l'infection. En effet, des lignées des souris consanguines peuvent être infectées expérimentalement avec des souches humaines du virus CVB3. Les lignés des souris présentant un large spectre des signes cliniques indique que la constitution génétique des individus infectés est un facteur déterminant dans la gravité de l'infection. Nous avons donc formulé l'hypothèse que l'investigation des facteurs génétiques étant à l'origine de la réponse de l'hôte à l'infection par CVB3 devrait nous conduire à identifier des gènes et des mécanismes moléculaires directement impliqués dans le contrôle de cette infection dont on n'aurait pas eu connaissance dans le passé.Dans le but de mieux cerner la contribution des facteurs génétiques de l'hôte dans l'évolution de l'infection par CVB3, nous avons utilisé une approche de cartographie génétique. En ce sens, nous avons examiné une collection des lignées de souris recombinantes consanguines (RCS) issues des lignées parentales A/J et C57BL/6. Nous avons constaté que la plupart des lignées BcA (dont le fonds génétique est majoritairement issu de la lignée C57BL/6) présentaient une susceptibilité accrue en comparaison à C57BL/6. Dû à son taux précoce de mortalité, la lignée BcA86 a été particulièrement visée. En ayant recours à un croisement (BcA86 x C57BL/10)F2 il nous a été possible de détecter un locus dans la région distale du chromosome 13 liée à la sévérité des lésions du foie pendant l'hépatite coxsackievirale. Une étude préalable de liaison génétique, nous avait permis de mettre en évidence le locus Vms1 (viral myocarditis susceptibility) dans la région distale du chromosome 3. Le locus Vms1 est responsable du niveau de la réplication virale, de la nécrose du myocarde et de l'infiltration cellulaire que l'on observe dans le cœur des souris infectées par CVB3. En étudiant des lignées de souris consomiques ainsi qu'en réalisant de nouveaux croisements entre souris sensibles et souris résistantes, nous avons élaboré une cartographie fine de l'intervalle critique contenant le locus Vms1. Aussi avons-nous pu constater que le contrôle de la multiplication virale par Vms1 précède l'infiltration des cellules inflammatoires dans les tissus cardiaques.Le gène Tnni3k code pour une kinase dont l'expression étant spécifique aux cellules cardiaques apparaît comme un gène candidat de choix pour le locus Vms1. En comparant avec les souris normales, nous avons trouvé que la surexpression du gène Tnni3k dans des souris transgéniques leur confère un phénotype de nécrose et d'inflammation extrêmes du tissu cardiaque suite à l'infection par CVB3. Nous avons également établi que l'infection des cardiomyocytes isolés à partir de ces mêmes souris provoque un accroissement de la réplication du virus CVB3 ainsi qu'un profil d'expression unique des gènes inflammatoires. Les résultats ainsi obtenus ont mis en lumière que la kinase TNNI3K est impliquée dans un circuit de signalisation immunitaire propre au cœur. Ainsi, pris dans leur ensemble, nos travaux apportent des nouvelles voies pour la compréhension du déterminisme génétique de l'hôte dans la sensibilité aux infections par CVB3 ainsi qu'une meilleure connaissance de la pathogénèse de ce virus dévastateur.

Coronary artery disease (CAD) is the leading cause of mortality and morbidity worldwide. Low levels of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) constitute a major independent risk factor for CAD, influenced by a combination of genetic and environmental factors. In this thesis, we aimed to advance our understanding of the genetic regulation of HDL-C, through the identification and characterization of novel candidate genes, and to delineate the molecular mechanisms underlying HDL biogenesis, in the hopes of better elucidating the complexities of HDL metabolism. First, we examined whether variation at the PCSK5 gene locus influences HDL-C levels. Through familial segregation analyses and two-stage genetic association studies in unrelated subjects of French Canadian descent and low HDL-C Finnish families (ntotal=883), we reported a region-wide significance of PCSK5 SNPs with HDL-C, suggesting that genetic variability at the PCSK5 locus regulates HDL-C levels, possibly through the inactivation of endothelial lipase. Second, to search for rare-low frequency variants responsible for low HDL-C, we used whole exome sequencing in a multigenerational French Canadian family (n=75) with HDL-C<5th age-sex specific percentile. Through this approach, we identified a complex combination of two non-synonymous variants, in the ATP-binding cassette transporter (ABCA1) and the lipoprotein lipase genes, predicted to be damaging and causing low HDL-C. These results emphasize the need for exome sequencing of complex lipid traits in unexplained familial cases. Third, we sought to characterize a novel genetic determinant involved in HDL-C regulation. Recent studies from our group identified the WW domain-containing oxidoreductase (WWOX) gene locus to be associated with low serum HDL-C levels in 9,798 subjects. In this study, we examined the role of WWOX in lipoprotein and HDL metabolism using a combination of in vivo functional studies, by means of total Wwox knock-out and Wwox liver-specific mouse models, gene microarray and next generation resequencing analyses in HDL-deficient French Canadian families. We demonstrated that the effects of WWOX on lipoprotein metabolism involve multiple mechanisms, including cholesterol homeostasis, apoA-I and ABCA1-mediated pathways and fatty acid/triglyceride metabolism. Fourth, with novel insight into genetic regulations of HDL metabolism, we focused on elucidating the mechanistic basis of nascent HDL formation. Specifically, we investigated the lipidation of ApoA-I and its interaction with an ABCA1/phosphatidylcholine(PC)-rich microdomain, the high-capacity binding site (HCBS). Using sucrose gradient fractionation, we also demonstrated that the ABCA1/ HCBS partitions to nonraft domains, thus playing a pivotal role in the selective desorption of PC molecules by apoA-I, creating an optimal environment for nascent HDL formation and cholesterol release.In summary, this work has collectively advanced our understanding of the molecular and genetic basis of HDL metabolism. It has brought to light novel genes governing plasma HDL-C levels in humans, highlighting the need to use multiple integrative genetic approaches to identify causal common and rare variants conferring susceptibility to low HDL-C. These findings have also helped elucidate the mechanistic basis of the nascent HDL genesis pathway. Together, this thesis has combined genetic and biochemical strategies to provide a more comprehensive understanding of the complexities of the HDL metabolism and cellular cholesterol transport, which may lead to the characterization of novel therapeutic targets for CAD. / La maladie coronarienne athérosclérotique (MCAS) est la principale cause de mortalité et de morbidité à l'échelle mondiale. Un niveau bas des lipoprotéines de cholestérol de haute densité (HDL-C) représente un facteur de risque majeur pour la MCAS et est influencé par une combinaison des facteurs génétiques et environnementaux. Dans cette thèse, nous avons abordé la régulation génétique des HDL-C grâce à l'identification et la caractérisation de nouveaux gènes candidats, et de mécanismes moléculaires liés à la biogenèse des HDL, dans l'espoir de mieux élucider la complexité du métabolisme des HDL.En premier, nous avons examiné si la variation au niveau du locus du gène proprotéine convertase PCSK5 peut affecter les niveaux de HDL-C. Grâce aux analyses de ségrégation familiale et aux études d'association génétique dans une population canadienne-française et chez des familles finlandaises (nTotal=883) avec un niveau de HDL-C bas, nous avons constaté une large corrélation régionale entre les variations polymorphiques (SNPs) de PCSK5 et HDL-C. Ceci suggère que la variabilité génétique au niveau du locus PCSK5 réglemente le HDL-C, éventuellement par le biais de l'inactivation de la lipase endothéliale, une enzyme clé dans la modulation des niveaux plasmatiques de HDL-C. Deuxièmement, pour rechercher des variants de fréquence rare qui sont responsables d'un bas niveau de HDL-C, nous avons utilisé la technique du séquençage de l'exome dans une famille multi-générationnelle canadienne-française (n=75) avec un HDL-C<5e percentile spécifique (âge-sexe). Grâce à cette approche, nous avons identifié une combinaison complexe de deux variants non-synonymes dans le transporteur ABCA1 et dans le gène de la lipoprotéine lipase provoquant un taux faible de HDL-C. Ces résultats soulignent la nécessité du séquençage de l'exome des traits lipidiques complexes dans les cas familiaux inexpliqués. Troisièmement, nous avons caractérisé un nouveau gène impliqué dans la régulation du HDL-C. Nous avons examiné le rôle de WWOX dans le métabolisme du HDL en utilisant des études fonctionnelles in vivo avec des souris Wwox total knock-out (KO) et des souris Wwox KO spécifiques au foie, une technologie des puces à ADN et du reséquençage dans des familles canadiennes-françaises déficientes en HDL. Nous avons démontré que l'effet de WWOX sur le métabolisme des lipoprotéines implique plusieurs mécanismes, y compris l'homéostasie du cholestérol, les voies de régulation à travers l'ApoA-I et l'ABCA1 et le métabolisme d'acides gras/triglycérides. Quatrièmement, nous voulions élucider le mécanisme de formation du HDL naissant. Plus précisément, nous avons étudié la lipidation de l'ApoA-I et son interaction avec des sites constitués de microdomaines ABCA1/phosphatidylcholine (PtdC) que nous avons appelés « site de liaison de grande capacité (HCBS) ». En utilisant un gradient de densité de sucrose, nous avons observé que l'ABCA1 et le HCBS sont localisés dans des domaines membranaires solubles aux détergents et que l'ApoA-I désorbe sélectivement la PtdC de ces domaines ainsi créant un environnement optimal pour la formation des molécules naissantes de HDL et la libération de cholestérol.Collectivement, ce travail a élargi notre compréhension des sciences moléculaires et génétiques du métabolisme du HDL. Il a mis en lumière de nouveaux gènes impliqués dans la régulation des niveaux de HDL-C, soulignant la nécessité d'utiliser plusieurs approches intégratives génétiques pour identifier les causes des variants communs et rares conférant une susceptibilité à un faible taux de HDL-C. Ces résultats ont également contribué à élucider le mécanisme de biogenèse du HDL naissant. Ainsi, cette thèse a combiné des stratégies génétiques et biochimiques pour fournir une meilleure compréhension de la complexité du métabolisme des HDL et du transport du cholestérol cellulaire, qui pourrait ainsi conduire à l'élaboration des nouvelles cibles thérapeutiques pour la MCAS.

Meiosis is a reductional cell division that produces haploid gametes and uniquely allows the introduction of genetic diversity via crossover recombination between homologous chromosomes. Any defect during this process could lead to the non disjunction of chromosomes, which in turn leads to aneuploidy in the resulting progeny, a condition that is generally lethal but in certain cases results in serious developmental abnormality. In C. elegans, at the onset of meiosis, chromosomes condense and cis-acting regions near each chromosome end called pairing centers recruit zinc-finger proteins which help chromosomes associate with nuclear envelope bridge proteins. These bridge proteins are in turn linked to the cytoskeleton network. This association is important to facilitate chromosome clustering and homology search. Once chromosomes are properly homologously paired, the process of division continues until eventually four haploid cells are produced. Though the successful coordination and regulation of each step in meiosis is critical for the survival of a species, many components of the process remain unclear. During prophase I, chromosome movement resulting in proper homologous pairing is controlled and regulated in a manner that is not well understood. The objective of my research therefore, is to try and identify factors involved in this chromosome movement. To do this, a candidate RNAi screen of 482 genes was conducted and 156 genes were positively identified as having a lack of chromosome movement. Since any mistakes in pairing and subsequent stabilization of homologous chromosomes could lead to non disjunction and possible embryonic lethality (emb) from loss of an autosome or a high incidence of males (him) from loss of the X chromosome, positive candidates were also screened for emb and him. Of the 156 positive candidates, 24 were also positive for emb and 1 was additionally positive for him. These candidates present many possibilities for further validation and characterization in future projects. / La méiose est une division cellulaire réductionnelle qui produit des gamètes haploïdes et permet d'une façon unique l'introduction de diversité génétique à travers la recombinaison entre les chromosomes homologues. Tout problème dans le processus peut causer une impossibilité de séparation entre les chromosomes, ce qui à son tour cause l'aneuploïdie dans la génération suivante, une condition qui est généralement mortelle, mais résulte en anomalie dans le développement dans certains cas. Les chromosomes de C. elegans, au tout début de la méiose, se condensent et les régions "cis" à la fin de chaque chromosome appelées centres paires recrutent les protéines avec des doigts de zinc qui aident les chromosomes associer avec le pont de protéines sur l'enveloppe nucléaire. Le pont est connecté au réseau cytosquelette. Cette association est importante pour la facilitation du regroupement des chromosomes et la recherche de chromosomes homologues. À la retrouvaille des chromosomes homologues, le processus de division continue jusqu'à ce que quatre cellules haploïdes soient produites. Même si le succès de la coordination de chaque étape de la méiose est critique pour la survie des espèces, certain détails du processus restent inconnus.Durant la prophase I, le mouvement des chromosomes qui résulte dans le propre couplement des chromosomes homologues est contrôlé et régulé d'une manière encore inconnue. L'objectif de mes recherches est donc d'identifier des facteurs associés dans ledit mouvement des chromosomes. Pour accomplir ce but un écran de ARNi avec 482 gènes comme candidates a été mené et 156 gènes ont été positivement identifiés pour une manque de mouvement des chromosomes. Comme tout problème de formation des couples de chromosomes ainsi que dans la stabilisation des chromosomes homologues qui suit peut causer de la non-disjonction et possible mort embryonnaire (emb) suite à la perte d'un autosome ou une haute incidence de males (him) causé par la perte du chromosome X, les candidats out aussi été examinés pour emb et him. Des 156 candidats positifs, 24 ont aussi été positifs pour emb et un candidat a été additionnellement positif pour him. Ces candidats se présentent comme une source de futures recherches de validation ainsi que de caractérisation.

Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) is a highly prevalent, clinically heterogeneous neurodevelopmental disorder with a complex etiology implicating both genetic and environmental factors. Although it is well accepted that multiple genes are involved in the pathophysiology of ADHD, no genetic risk variants have been identified beyond doubt. In addition, environmental factors, including, maternal smoking and maternal exposure to stress during pregnancy have been consistently associated with this disorder.This thesis will describe multiple genetic strategies that may help reduce the "clinical heterogeneity" and "etiological complexity" of ADHD phenotype facilitating the identification of genetic variants, which may help, in dissecting pathways to the disorder.1. By using the "endophenotypes" approach and selecting COMT gene, which is firmly implicated in the modulation of brain catecholamines, we found a tentative association between Catechol-O-Methyltransferase alleles/haplotypes and the modulation of Executive Functions in ADHD children.2. We used "gene/environment interplay" i.e. stratifying ADHD children based on exposure to maternal smoking during pregnancy and maternal stress during pregnancy and investigated the implication of latrophilin3 gene LPHN3, a candidate gene consistently shown to be involved in ADHD (based on linkage studies, and candidate association studies) in increasing the risk for ADHD. This approach allowed the uncovering of differential associations between single nucleotide polymorphisms (SNPs) within the LPHN3 and a number of endophenotypes in patients according to their exposure to maternal stress during pregnancy.3. "Comorbidity" with obesity was employed as a tool to index a more homogenous subgroup of ADHD children and facilitate the identification of genetic variants implicate in ADHD. Using this scheme, we comprehensively (behaviorally and clinically) characterized children with ADHD in relation to their BMI/weight categories. We showed that, self-regulation deficits, usually hypothesized to mediate obesity in children with ADHD, are not more present in children with ADHD and obesity compared to the non-obese ADHD children. Furthermore, in a group of children not exposed to maternal smoking during pregnancy, we observed a novel association between ADHD pertinent phenotypes and a Fat Mass and Obesity (FTO) gene polymorphism that has been strongly associated to obesity by genome-wide association studies (GWAS). In summary, this research work demonstrates the usefulness of multiple strategies to reduce the clinical heterogeneity and etiological complexity of ADHD which may facilitate identification of genetic risk variants and the interaction of these with environmental factors. This in turn may help in elucidating the pathophysiology of ADHD. / Le trouble déficit de l'attention avec hyperactivité (TDAH) est un trouble neurodéveloppemental très répandu, ayant une présentation clinique hétérogène et une étiologie complexe impliquant des facteurs génétiques et environnementaux. Bien qu'il soit généralement admis que plusieurs gènes sont impliqués dans la physiopathologie du TDAH, aucune variante génétique augmentant le risque n'a été identifiée avec certitude. En outre, les facteurs environnementaux, y compris, le tabagisme maternel et l'exposition maternelle au stress pendant la grossesse ont été systématiquement associés à ce trouble. Cette thèse décrira comment l'utilisation de stratégies multiples mettant à profit les données épidémiologiques peut aider à réduire "l'hétérogénéité clinique" et la "complexité étiologique" du TDAH. Ces stratégies facilitent l'identification des variantes génétiques, qui à leur tour peuvent aider à disséquer les différentes trajectoires physiopathologiques conduisant au TDAH.1. En utilisant l'approche des "endophénotypes" cognitifs, et en sélectionnant le gèneCOMT (Catéchol-O-Méthyltransferase) qui est impliqué dans le métabolisme des neuroamines, nous avons identifié une association entre les allèles/haplotypes de ce gène et la modulation des certaines fonctions exécutive (EF) chez les enfants ayant le TDAH.2. Nous avons utilisé "la stratification" des enfants ayant le TDAH en fonction de l'exposition au tabagisme et au stress maternel pendant la grossesse pour investiguer l'implication du gène LPHN3, un gène candidat impliqués dans le TDAH (sur la base d'études de liaison et d'association). Cette stratégie a permis la découverte d'associations différentielles entre des polymorphismes (SNP) du gène LPHN3 et un certain nombre d'endophénotypes chez les patients en fonction de leur exposition au stress maternel pendant la grossesse.3. Enfin, nous avons utilisé la "comorbidité" fréquemment rapporté entre obésité etTDAH comme un outil pour indexer un sous-groupe plus homogène d'enfants TDAH et faciliter l'identification des variantes génétiques communes au TDAH et à l'obésité. Nous avons comparé des enfants atteints de TDAH catégorisés selon leur Indice de masse corporelle (IMC)/catégories de poids par rapport à leurs caractéristiques comportementales et cliniques. Nous avons montré que les déficits d'autorégulation, une hypothèse souvent avancée pour expliquer la grand prévalence de l'obésité chez les enfants TDAH, ne sont pas associés avec l'obésité observées chez les enfants TDAH. Dans un deuxième temps, nous avons exploré l'association entre des phénotypes pertinents au TDAH et un gène hautement impliqué dans la régulation de la masse adipeuse appelé FTO. Nous avons identifié une association hautement significative entre ce gène et un grands nombre de traits pertinent pour le TDAH, particulièrement chez les enfants qui n'out pas été exposés au tabagisme au cours de la grossesse.En conclusion, ce travail suggère que l'utilisation de plusieurs stratégies visant à réduire "l'hétérogénéité clinique" et "La complexité étiologique" du TDAH peuvent faciliter l'identification des variantes de risques génétiques et l'interaction de celles-ci avec les facteurs environnementaux, ce qui à son tour peut aider à élucider les mécanismes neurobiologiques qui mènent au TDAH.

Nearly 1% of the population is affected by vesico-ureteric reflux (VUR), a congenital defect of the urinary tract that results in the retrograde flow of urine from the bladder to the kidneys. VUR arises due to a defect in the formation of the uretero- vesical junction (UVJ). Some patients with VUR possess hypoplastic/dysplastic kidneys, duplex ureters and/or urinary tract obstruction; however, the majority of affected children exhibit VUR and normally formed kidneys. Affected children are predisposed to recurrent urinary tract infections, the majority of which are due to uropathogenic E.coli. Additionally, a subset of children with VUR develop reflux nephropathy (RN), renal scarring that can lead to end stage renal disease. While urinary tract infections are a known risk factor for RN, the specific factors that determine the onset and severity of RN are not well understood. Currently, it is impossible to predict which children with VUR will develop RN and/or end stage renal disease; therefore most children with VUR receive antibiotic prophylaxis to prevent urinary tract infections and/or surgical correction of the UVJ defect. However, despite medical intervention, the incidence of end-stage renal disease due to RN has remained unchanged over the last 50 years.VUR is highly heritable and genetically heterogeneous with a number of genes and loci identified in both humans and mice. Previously, our laboratory identified that two sub-strains of inbred C3H mice, HeJ and HeN, have VUR and normally formed kidneys. Through a set of informative crosses we identified the Vurm1 locus, a 22Mb region on the proximal end of chromosome 12, as a VUR susceptibility locus in the C3H/HeJ mouse. Here, we demonstrate that Vurm1 also confers susceptibility to VUR in 3 other inbred mouse strains: CBA/J, DBA/2J and AKR/J. To further characterize the Vurm1 locus, we performed candidate gene and in silico analyses and this prioritized 8 genes for further study. We have demonstrated that one of these genes, Odd-skipped related 1 (Osr1) is a novel gene associated with VUR susceptibility. Mice with Osr1 haploinsufficiency have a 28% incidence of VUR as well as duplex systems and megaureters.To examine the critical factors that determine the progression of VUR to RN, mice were inoculated with either Gram-negative uropathogenic E.coli (UPEC) or saline. We have shown that when bacterial cystitis is induced in refluxing C3H/HeN mice, pyelonephritis rapidly develops, while this is not observed in non-refluxing C57BL/6N mice with similar infection. RN is only observed in mice with VUR and kidney infection.When a transient pyelonephritis is induced in C3H/HeN and C57BL/6N mice, renal inflammation and RN is significantly increased in C3H/HeN mice with VUR. This allows us to conclude that VUR and persistent infection are necessary to confer RN. The reflux of sterile urine as well as transient pyelonephritis, are not sufficient for the development of RN.To determine the role of host innate immunity in the pathogenesis of RN, bacterial cystitis was induced in C3H/HeN and C3H/HeJ mice. C3H/HeN mice have a wild-type Toll-like receptor 4 (Tlr4) and normal innate immunity, whereas C3H/HeJ have a point mutation in Tlr4 and are hyporesponsive to Gram-negative bacteria. Consistent with previous findings, C3H/HeJ mice maintain higher bacterial counts in the kidneys than C3H/HeN and are unable to clear Gram-negative infection. C3H/HeN and C3H/HeJ mice demonstrate similar levels of inflammation and RN at 2 and 6 days post infection, however the degree of inflammation and RN is worse in the C3H/HeJ mice at 14 and 28 days. This identifies the host innate immune response to infection as a critical factor in RN susceptibility. Furthermore, the data demonstrates that persistent pyelonephritis leads to a more severe RN lesion. This work has provided a new understanding of the genetics of VUR and the critical factors that determine the progression of VUR to RN in mouse models. / Environ 1% de la population est affectée par le reflux vésico-urétéral (RVU), une anomalie congénitale du tractus urinaire causant le passage à contre-courant de l'urine de la vessie vers les reins. Le RVU origine d'un défaut de la jonction vésico-urétérale (JVU). L'hypoplasie/dysplasie rénale, la duplicité urétérale et/ou l'obstruction du tractus urinaire y sont associées. La majorité des patients ont des reins normalement formés. Ils sont prédisposés à desinfections urinaires récurrentes, la majorité due à E. coli uropathogénique. Certains développent une néphropathie de reflux (NR) i.e. des lésions rénales pouvant entraîner une insuffisance rénale. Les infections du tractus urinaires sont un facteur de risque connu de NR. Toutefois, les facteurs spécifiques déterminant le début et la sévérité de la NR ne sont pas bien compris. Il est impossible de prédire quels enfants ayant le RVU vont développer une NR ou une insuffisance rénale. La plupart reçoit des antibiotiques en prophylaxie pour prévenir les infections urinaires et certains ont recours à une chirurgie correctrice. Malgré tout, l'incidence d'insuffisance rénale due à la NR n'a pas changé durant les 50 dernières années.Le RVU est héréditaire et génétiquement hétérogène. En effet, de nombreux gènes et loci ont été identifiés chez l'humain et la souris. Par le passé, notre laboratoire a identifié deux sous-lignées issues de la lignée consanguine de souris C3H, HeJ et HeN ayant le RVU et des reins normalement formés. Par des croisements informatifs, nous avons identifié une région de 22Mb dans la région proximale du chromosome 12 comme un locus de susceptibilité chez les HeJ : le locus Vurm1. Nous montrons que Vurm1 confère une susceptibilité au RVU dans trois autres lignées consanguines: CBA/J, DBA/2J et AKR/J. Afin de caractériser davantage le locus Vurm1, nous avons fait une analyse de genes candidats et une analyse in silico priorisant 8 gènes. Un de ces gènesOdd-skipped related 1 (Osr1) est un nouveau gène associé à la susceptibilité au VRU. Les souris Osr1 haploinsuffisantes ont une incidence de RVU de 28%. La présence de duplicité utérérale et de méga-uretère a aussi été notée.Afin de d'identifier les facteurs critiques déterminant la progression du RVU à la NR, les souris ont été inoculées avec E.coli uropathogénique (UPEC) ou de la saline. Lorsqu'une cystite bactérienne est induite, les C3H/HeN ayant du RVU développent une pyélonéphrite rapidement alors que les C57BL/6N ne développent pas de pyélonéphrite. Lorsqu'une pyélonéphrite transitoire est induite, l'inflammation rénale et la NR sont significativement augmentées chez les C3H/HeN ayant le RVU. Ceci suggère que le RVU conjointement avec une infection urinaire persistante est nécessaire au développement d'une NR; ni lereflux d'urine stérile, ni une pyélonéphrite transitoire ne sont à eux seuls suffisant. Afin de déterminer le rôle de l'immunité inné de l'hôte dans la pathogénèse de la NR, une cystite bactérienne est induite chez les C3H/HeN et HeJ. Les HeN n'ont pas de mutation dans la séquence du récepteur Toll-like 4 (Tlr4) et ont une immunité innée normale contrairement aux C3H/HeJ qui ont une mutation ponctuelle et sont hyporéactive aux bactéries Gram-négative. Les C3H/HeJ maintiennent un compte bactérien rénal plus élevé que les C3H/HeN et sont incapables d'éradiquer une infection à Gram-négative. Les C3H/HeN et HeJ montrent des niveaux d'inflammation et de NR similaires à 2 et 6 jours post-infection. Le degré d'inflammation et de RN est pire chez les C3H/HeJ à 14 et 28 jours post-infection. Ces résultats identifient la réponse immunitaire innée de l'hôte comme un facteur crucial dans la susceptibilité à la NR. Nos résultats montrent qu'une pyélonéphrite persistante mène à des lésions rénales encore plus sévères. En résumé, ces résultats apportent une nouvelle compréhension de la génétique du RVU et des facteurs critiques qui déterminent la progression du RVU à la NR dans le modèle murin de RVU.

Cis-regulatory variants are predicted to mediate the majority of the known common genetic associations to complex disease, yet the specific causal variants and the corresponding cis-regulatory mechanisms have thus far been poorly characterized. We attempted to address this by using allele-specific analyses of gene expression and chromatin marks assessed in diverse populations of human cells. The first chapter of this thesis is a review of the literature. The second chapter describes an allele-specific (AS) expression study we performed using 4 large population cohorts of human cells. We mapped SNPs associated to differential allelic-expression (AE) of protein coding and non-coding (nc) genes in 3 distinct cell-types (lymphoblasts, monocytes, and fibroblasts) revealing that ~60-70% of cis-rSNPs originally mapped in each cell-type show strong evidence of tissue-independence. We observed cell-type specificity of cis-regulatory SNPs to be reflective of chromatin activity from the same cell-type using ChIP-seq for active histone marks. We find the same proportion of cis-regulated transcripts between lincRNAs and classical genes, indicating shared regulatory mechanisms. Lastly, cis-regulatory variants were enriched for SNPs in high LD with genome-wide association study (GWAS) hits. The third chapter builds on the allelic-expression work described in the second chapter through the allele-specific assessment of chromatin state via ChIP –genotyping in 20 human cell lines, providing the first genome-wide maps of allelic imbalance for five histone marks. We performed parallel analyses of input DNA and histone modification chromatin immunoprecipitates (ChIP) on high-density Illumina genotyping arrays. AS-ChIP SNPs were combined into allelic chromatin domains with validation performed using high-confidence AS sites generated using ChIP-seq. We observed a characteristic pattern of allelic-imbalance for each histone-modification we tested (H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3, and H3K36me3) around allele-specifically expressed transcripts. Notably, we found H3K4me1 to be significantly anti-correlated with H3K4me3 and allelic expression (AE) at transcription start sites, indicating H3K4me1/H3K4me3 anti-correlation at the TSS as a marker of AE. Finally, we identified regions of allelic-chromatin strongly suggestive of allelic transcription in previously unannotated regions. Altogether, our work reinforces the power of allelic analyses for investigating cis-regulatory mechanisms of disease-associated regulatory variants. / La majorité des variant communs associés aux maladies complexes sont prédis pour être régulateurs en cis (cis-rSNPs), cependant le variant causal ainsi que les mécanismes impliqués sont rarement connus. Nous avons essayé de résoudre ce problème par l'analyse de données d'expression allélique (AS) de gènes et de marques chromatiniennes dans différentes populations cellulaires humaines. Le premier chapitre de cette thèse est une revue de la littérature. Le seconde chapitre décrit la cartographie de SNPs associés à des différences d'expression allélique de gène codant et non-codant dans 3 types cellulaires (lymphoblastes, monocytes et fibroblastes). Cette étude révèle que jusqu'a 60/70% des cis-rSNPs cartographiés ont une action tissus-indépendante. Nous avons observé une corrélation entre l'activité spécifique d'un cis-rSNP et la structure chromatinienne d'un même type cellulaire. Nous avons également retrouvé la même proportion de lincRNA et de gène classiques dont l'expression était régulée en cis suggérant des mécanismes régulateurs commun. Enfin, nous avons mis en évidence un enrichissement des cis-rSNPs en fort linkage desequilibrium avec des variant associés à des maladies complexes. Le troisième chapitre présente une étude des états chromatiniens réalisée à partir d'expériences d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivie de génotypage dans 20 lignées cellulaires humaines et basée sur les précédents résultats d'expression allélique. Nous avons ainsi généré la première carte à l'échelle du génome des déséquilibres allélique de 5 marques d'histones. Nous avons analysés en parallèle l'input et l'ADN associé aux différentes modifications d'histone immunoprécipités sur puces de génotypage Illumina à haute densité permettant ainsi l'évaluation d'un possible biais allélique pour les SNPs hétérozygotes (=AS-ChIP SNPs). Les données des variants AS-ChIPs pour chaque marque d'histone ont été combinées pour former des domaines chromatiniens avec biais allélique et validés par des expériences complémentaires de ChIP-seq. Nous avons observés des profils de déséquilibre allélique spécifique à chaque marque d'histone testé (H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3, and H3K36me3) dans le voisinage des transcrits régulés de façon allèle-spécifique. Notamment, nous avons mis en évidence que le signal de H3K4me1 était négativement et significativement corrélé avec H3K4me3 et le niveau d'expression des gènes aux sites d'initiation de la transcription (TSS). Ces résultats suggèrent que la corrélation négative entre H3K4me1 et H3K4me3 aux TSS pourrait être un marqueur de déséquilibre d'expression allélique. Enfin, nous avons identifiés des régions intergéniques dont les modifications d'histones présentent des déséquilibres allélique suggérant l'existence d'une transcription allèle-spécifique non-cartographié. Pour résumer, notre étude valide la puissance des techniques utilisant les différences allélique dans l'étude des mécanismes régulateur en cis des variant associés aux maladies complexes.

TMED2 is a member of the p24 family of proteins involved in vesicle transport between the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi. TMED2 localizes predominantly in the ER Golgi Intermediate Compartment, where it is proposed to function as a receptor for specific protein cargoes and coat proteins. We have shown that TMED2 is expressed and required in the mouse placenta. In fact, mouse embryos with mutations in Tmed2 fail to form syncytiotrophoblast cells, a cell type, which is critical for labyrinth placenta function. Expression of TMED2 is conserved in human placentas, and we reported expression of TMED2 between 5.5 and 40 weeks of gestation in all trophoblast cell types, including the syncytiotrophoblast. Moreover, early in gestation TMED2 was more highly expressed in cytotrophoblast cells versus syncytiotrophoblast. In addition, we found that TMED2 was more highly expressed in the BeWo choriocarcinoma cell line, which differentiates to form syncytiotrophoblast, when compared to JEG-3 cells, which do not form syncytiotrophoblast. The Aim of this study is to determine if TMED2 is sufficient or required during syncytiotrophoblast differentiation. Methods: in this study we generated JEG-3 cell lines with stable expression of EGFP, N-terminal tagged EGFP and tagged EGFP-TMED2. We employed different approaches such as: Immunofluorescence, PCR and Western blot analysis to examine differentiation of the stably transfected cell lines. We found that ectopic expression of TMED2 in JEG-3 resulted in a significant increase of syncytiotrophoblast formation when compared to normal or EGFP transfected JEG-3 cells. Our preliminary results suggest that TMED2 is sufficient to induce fusion in JEG-3 cells. In the future we will generate BeWo cell lines with knockdown of TMED2 in order to determine if this gene is required for syncytiotrophoblast formation in these cells. / TMED2 est un membre de la famille de protéines p24, impliquées dans le transport vésiculaire entre le réticulum endoplasmique (RE) et l'appareil de Golgi. La protéine TMED2 se localise principalement dans le compartiment intermédiaire RE/Golgi, dans lequel il est proposé qu'elle fonctionne comme un récepteur pour des cargos de protéines spécifiques et des protéines d'enveloppe. Nous avons démontré que TMED2 est exprimée et requise dans le placenta de souris. Les embryons de souris avec des mutations dans Tmed2 ne parviennent pas à former de syncytiotrophoblaste, un type de cellules qui est essentiel pour la fonction du labyrinthe du placenta. L'expression de TMED2 est conservée dans les placentas humains, et nous avons rapporté son expression entre 5,5 et 40 semaines de gestation dans tous les types de cellules du trophoblaste, y compris le syncytiotrophoblaste. Au début de la gestation, TMED2 est plus fortement exprimée dans les cellules du cytotrophoblaste que le syncytiotrophoblaste. Finalement, nous avons constaté que TMED2 est plus fortement exprimée dans la lignée de cellules de choriocarcinome BeWo, qui se différencie pour former le syncytiotrophoblaste, comparativement aux cellules JEG-3, qui ne le forment pas. Le but de cette étude est de déterminer si TMED2 est suffisante ou nécessaire au cours de la différenciation des syncytiotrophoblastes. Méthodes : Dans cette étude, nous avons généré des lignées de cellules JEG-3 qui expriment de façon stable la protéine EGFP, EGFP fusionnée avec une étiquette en N-terminal, ainsi que la protéine de fusion EGFP-TMED2. Nous avons utilisé des approches telles que l'immunofluorescence, le PCR et l'immunobuvardage de type Western pour étudier la différenciation des lignées de cellules transfectées de façon stable. Nous avons constaté que l'expression ectopique de TMED2 dans les cellules JEG-3 conduit à une augmentation significative de la formation du syncytiotrophoblaste par rapport à la normale ou de cellules transfectées avec les protéines de fusion EGFP-TMED2. Nos résultats préliminaires suggèrent que TMED2 est suffisante pour induire la fusion dans les cellules JEG-3. Dans l'avenir, nous allons générer des lignées cellulaires BeWo avec une invalidation génique transitoire (knockdown) de TMED2 afin de déterminer si ce gène est également nécessaire pour la formation de syncytiotrophoblastes.

The mouse Flk-1 gene encodes for vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2), the receptor for vascular endothelial growth factor A (VEGF-A). This gene is essential for the development of the vascular system. In the early embryo, Flk-1 expression marks angioblasts and subsequent endothelial cells. Flk-1-/- embryos die at E8.5-9.5 and fail to develop the blood island, endocardium, dorsal aortae, intersomitic vessels, and capillaries. This gene product is required for endothelial cell development as well as for primitive and definitive erythrocyte differentiation. Flk-1-/- cells locate to the amnion, where it is not normally expressed. It is accepted that FLK-1 positive cells contribute to the formation of the endocardium as well as the embryonic vasculature and the extraembryonic yolk sac vasculature; however, the origins of these individual populations remain unknown. We hypothesize FLK-1 positive cells contributing to different lineages originate from different areas and behave differently; therefore, the aim of this project is to identify the origins of endothelial progenitors and study their behavior during their contribution to the cardiovascular system.Live-imaging microscopy analysis allows temporal and spatial observation of natural processes. Using the Flk-1-GFP mouse reporter line, heterozygous and homozygous embryos were used to live-image embryos from E7.5 to E8.5. The origins of endothelial cells forming the cardiovascular system were retrospectively identified with the use of software programs. The process of formation was then compared to that of Flk-1GFP/GFP mutant embryos.Live-imaging analysis of embryos during the streak stages showed the appearance of Flk-1- GFP+ cells laterally to the primitive streak. These cells then expanded embryonically and extraembryonically. During the head-fold stages, embryos showed a small population of Flk-1-GFP positive cells actively migrating from the embryonic-extraembryonic boundary into the embryonic region to form the dorsal aortae. During the migration, the cells aggregated and luminal structures were formed. The embryonic dorsal aortae form as these small luminal structures aggregated, lined laterally to the embryo midline. We also identified that endocardium progenitors originate from a region more anterior than dorsal aortae angioblasts. The majority of Flk-1-GFP+ cells in the extraembryonic region become part of the yolk sac vasculature. Flk-1GFP/GFP embryos appeared normal during the streak stages; however, during the head-fold stages, Flk-1-GFP+ cells showed lack of migration and failed to form vascular structures. The cells were located within the amnion, the base of the allantois, the cardiac mesoderm, and the extraembryonic region. The heart tube formed although the endocardium was absent. These data show the origins and contribution of Flk-1-GFP cells during gastrulation. Moreover, Flk-1 was found to be dispensable for the migration of mesodermal cell from the primitive streak and essential for angioblast migration / Le gène murin Flk-1 code pour le récepteur 2 du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGFR-2), récepteur au facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGF-A). Ce gène est essentiel au développement du syolk sactème cardiovasculaire. Au stade initial du développement de l'embryon, Flk-1 est exprimé sur les angioblastes, et sur les cellules endothéliales qui en sont issues. Chez les embryons Flk1-/- on constate la mort à E8.5-9.5, et l'absence de développement des îlots vasculaires, de l'endocarde, de l'aorte dorsale, des vaisseaux intersomitiques et des capillaires. Le produit de ce gène est nécessaire au développement des cellules endothéliales, ainsi qu'à la différenciation primitive et définitive des érythrocytes. Les cellules Flk1-/- sont localisées, de manière normale, dans l'amnios. Il est admis que les cellules exprimant Flk-1 contribuent à la formation de l'endocarde, ainsi qu'à la vascularisation de l'embryon et de la vésicule vitelline; cependent, les origines de ces populations cellulaires individuelles restent inconnues. L'hypothèse émise est que les cellules exprimant Flk-1, à l'origine de différentes lignées cellulaires, proviennent de différentes régions et ont un comportement différent; le but de ce projet est donc d'identifier l'origine des progéniteurs endothéliaux et d'étudier leur comportement contributif au développement du système cardiovasculaire. L'analyse en videomicroscopie permet une observation temporelle et spatiale de processus naturels. Des embryons issus de la lignée murine Flk-1-GFP, hétérozygotes ou homozygotes, ont été observés en videomicroscopie de E7.5 à E8.5 pour visualiser la formation du système cardiovasculaire. Les origines des cellules endothéliales formant le système cardiovasculaire ont été rétrospectivement identifiées à l'aide de logiciels. Le processus de formation a été comparé à celui d'embryons mutés Flk-1GFP/GFP. L'analyse en videomicroscopie des embryons durant les étapes séquentielles du développement a montré que les cellules Flk-1-GFP+ apparaissent latéralement sur la ligne primitive. Ces cellules se répartissent ensuite dans les régions embryonnaires et extra-embryonnaires. Au cours de "head-fold stage" on a observé l'apparition d'une petite population de cellules Flk-1-GFP+, migrant de la frontière entre les régions embryonnaire et extra-embryonnaire dans la région embryonnaire pour former l'aorte dorsale. Durant cette migration, les cellules s'agrègent et initient la formation luminale. L'aorte dorsale embryonnaire se forme à mesure que ces petites structures luminales s'agrègent et s'alignent dans la région embryonnaire, formant une structure tubulaire distincte. Nous avons également pu identifier que les progéniteurs endocardiaux sont localisés dans une zone plus antérieure que les angioblastes de l'aorte dorsale. La majorité des cellules Flk-1-GFP+ de la région extra-embryonnaire forme la vascularisation de la vésicule vitelline. Les embryons Flk-1GFP/GFP sont apparus normaux au cours des étapes séquentielles, cependant, durant les étapes "head-fold", ni la migration ni les structures vasculaires n'ont été observées. Les cellules ont été localisées à l'intérieur de l'amnios, de l'allantoïde, du mésoderme cardiaque et de la région extra-embryonnaire. Le tube cardiaque s'est formé malgré l'absence de l'endocarde. Ces données montrent les origines des cellules exprimant Flk-1-GFP et leur contribution dans la gastrulation; de plus, il a été montré que Flk-1 est indispensable à la migration des cellules du mésoderme de la ligne primitive ainsi qu'à la migration des angioblastes.