Several mechanisms can lead to the reorganization of genomes during speciation, including centromere repositioning, new centromere emergence or other chromosomal rearrangements. Using a comparative karyotype approach, I determined that the vervet genome contains at least 12 evolutionary young centromere locations. / To study the evolutionary dynamics of centromere formation, I identified and validated the alpha-satellite repeat as a centromere-specific marker in the vervet using comparative genomics, sequence analysis and hybridization screening. I developed criteria to infer the position of vervet bacterial artificial chromosome (BAC) inserts based on alpha-satellite monomer content. In a complementary approach, I demarcated the pericentromeric boundaries in human and identified vervet BAC clones that mapped orthologously to these regions. / In addition to centromeric analyses, I developed methodologies to detect other genome rearrangements, in particular vervet deletion/human insertion and vervet translocation events. The tools and approaches developed in this thesis will prove useful in cataloguing additional vervet genome rearrangements.

Bril is a 134 amino acid-long protein compartmentalized exclusively on the osteoblast cell surface, with two transmembrane domains. Its osteoblast-specific expression coincides with the onset of bone matrix formation and mineralization and has been shown to have an essential role in bone mineralization in vitro, although the mechanism involved is still unknown. The purpose of this study was to characterize the regulation pattern of the Bril gene by identifying the cis-elements on the promoter and the transcription factors that modulate its activation. The promoter for the mouse, rat, and human Bril gene were independently cloned into a luciferase (Luc) reporter plasmid. Transient transfection studies were then performed to compare the activity of the Luc reporter in permissive (UMR106, MC3T3-E1) and non-expressing cell lines (HEK293). Deletion mutant analyses revealed that the proximal 300bp promoter was sufficient to confer highest activation in the three species studied. In silico analysis, EMSA and DNAseI footprinting studies revealed that this region is rich in GC-boxes and contains many potential regulatory elements known to be involved in osteoblastic differentiation (e.g. Runx2, TCF1/LEF, Osx/Sp7/Sp1) that are fully functional. Co-transfection experiments in HEK293 and MC3T3-E1 cells showed that the Bril promoter is most strongly trans-activated by forced expression of Sp1 and the long variant of Sp3, moderately by members of the Wnt pathway (i.e. β-catenin and TCF/LEF), yet is not considerably affected by bone-specific factors. Additionally, shRNA-mediated knockdown of Sp1 (but not Sp3) in UMR106 cells resulted in complete abrogation of Bril protein. In vitro interference of the GC-rich boxes via GC-bisintercalating agents and CpG methylation resulted in a dramatic drop in Bril promoter activity; which highlights the importance of these GC-sequences in promoting Bril regulation. In a search for molecules that might regulate Bril expression, the parathyroid hormone (PTH) was found to be a potent negative regulator. Endogenous Bril expression in UMR106 was dramatically downregulated by PTH in a time- and dose-dependent manner, which coincided with suppressed osteoblast mineralization. These results provide the first mechanistic evidence for regulation of the Bril gene, which could help situate its function in the bone mineralization process in vitro. / Bril est une protéine de 134 acides aminés, localisée exclusivement sur la membrane des ostéoblastes avec deux domaines transmembranaires. Son expression exclusive dans les ostéoblastes coïncide avec le début de la formation osseuse et la minéralisation de la matrice. Ainsi, un rôle essentiel a été démontré dans la minéralisation osseuse in vitro, bien que le mécanisme en cause n'est pas encore connu. L'objectif de cette étude était de caractériser le mode de régulation du gène Bril en identifiant les éléments cis sur le promoteur et les facteurs de transcription qui modulent son activation. Le promoteur du gène Bril de la souris, du rat et de l'homme ont été indépendamment clonés dans un plasmide rapporteur de la luciférase (Luc). Des transfections transitoires ont ensuite été effectuées pour comparer l'activité Luc dans des cellules qui expriment (UMR106, MC3T3-E1) ou non (HEK293) le gène Bril de manière constitutive. L'analyse des mutants de délétion a révélé que le promoteur proximal 300 pb est suffisant pour conférer la majorité d'activation dans les trois espèces étudiées. Ainsi, les analyses in silico ont révélé que cette région est riche en séquences de GC et contient des éléments de régulation putatifs connus pour être impliqués dans la différenciation ostéoblastique (par exemple Runx2, TCF1/LEF, Osterix ou Sp1). Des analyses de retard sur gel (EMSA) et de cartographie à la DNAseI ont indiqué que beaucoup d'entre eux sont des sites fonctionnels. Les co-transféctions dans des cellules HEK293 et MC3T3-E1 ont montré que le promoteur Bril est le plus fortement trans-activé par l'expression forcée de Sp1 et la variante longue du Sp3, modérément par des membres de la voie Wnt (β-caténine et TCF /LEF), mais ne sont pas encore fortement influencés par des facteurs spécifiques à l'os. En plus, l'invalidation dans les cellules UMR106 de Sp1 (et non Sp3) par les shRNAs mène à l'abrogation complète de la protéine Bril. In vitro, l'interférence des séquences GC (via les drogues MMA et WP631 et la méthylation) a entraîné une forte baisse de l'activité promoteur de Bril; ce qui souligne l'importance de ces GC-séquences dans la promotion et la réglementation du Bril et propose la méthylation de l'ADN comme un mécanisme à considérer dans la spécificité d'expression cellulaire de Bril. La recherche de molécules qui pourraient réguler l'expression de Bril a identifié l'hormone parathyroïde (PTH) comme un puissant régulateur négatif. L'expression endogène de Bril dans les UMR106 a été considérablement diminuée par la PTH dans une manière dose-dépendante, qui coïncide avec une reduction de la minéralisation des ostéoblastes. Ces résultats fournissent les premières preuves d'un mécanisme pour la régulation du gène Bril, qui pourrait aider à démontrer sa fonction dans le processus de minéralisation osseuse in vitro.

During kidney development, there is a switch from predominantly canonical to non-canonical WNT signalling. This switch transitions the developing kidney from a state of active proliferation to that of terminal differentiation. The current belief is that a defect in this switch is an underlying mechanism in the pathogenesis of autosomal dominant polycystic kidney disease. We first hypothesized that a failure to suppress canonical WNT signalling would lead to cyst formation and following this line of reasoning, crossed a β-catenin transcriptional activity reporter mouse to mice with mutations in Pkd1 or Pkd2. We found no aberrant canonical WNT signalling in the epithelial cells lining the cysts and concluded that a failure to restrict β-catenin transcriptional activity does not occur in autosomal dominant polycystic kidney disease. We next examined if an inability to activate a non-canonical WNT signalling pathway, specifically the WNT-calcium pathway, contributes to cystogenesis. WNT-calcium signalling was not previously characterized in the developing kidney, so we first established cell culture, organ culture, and in vivo systems to study the pathway in a normal developmental context. We showed that pathway activity peaks from embryonic day (E)13 to E16 and is located in the nephrogenic zone of E16 kidneys. We further demonstrated that activation of the WNT-calcium pathway in vitro restricts cell motility, an important process during mesenchymal cell condensation to form the renal vesicle. To assess the role of WNT-calcium signalling in autosomal dominant polycystic kidney disease, we crossed an NFAT transcriptional activity reporter mouse to mice with mutations in Pkd2 and found that pathway activity is significantly reduced in cystic kidneys. Taken together, this study supports the hypothesis of a developmental switch between canonical and non-canonical WNT signalling during normal kidney development and suggests that a failure to fully activate the WNT-calcium pathway may be a contributing factor in the pathogenesis of autosomal dominant polycystic kidney disease. / Lors du développement rénal, il y a une permutation entre les voies canonique et non-canonique de signalisation WNT. Ce changement permet au rein en développement de passer d'un état de prolifération active à une différentiation terminale. La pensée actuelle est qu'une erreur lors de cette transition est un mécanisme sous-jacent dans la pathologie de la maladie polykystique autosomale dominante des reins. Nous avons tout d'abord émis l'hypothèse que manquer de réprimer la voie canonique de signalisation WNT conduirait à la formation de kyste. En suivant ce raisonnement, nous avons croisé des animaux disposant d'un gène rapporteur de l'activité transcriptionnelle de -caténine à ceux présentant des mutations dans Pkd1 ou Pkd2. Nous n'avons trouvé aucune signalisation aberrante de la voie canonique de WNT dans les cellules épithéliale tapissant les kystes et en avons conclu qu'un échec de restriction de l'activité transcriptionnelle de -caténine n'est pas la cause de la maladie polykystique autosomale dominante des reins. Nous avons ensuite examiné si une incapacité d'activer une voie non-canonique de signalisation WNT, plus précisément la voie WNT-calcium, contribue à la formation de kyste. La voie WNT-calcium n'a pas été caractérisée au préalable dans le rein en développement. Nous avons donc établi des cultures cellulaires, d'organe et des systèmes in vitro afin d'étudier la voie de signalisation dans un contexte développemental normal. Nous avons alors montré que l'activité de la voie de signalisation culmine au jour embryonnaire (E)13 à E16 et se localise dans la zone néphrogénique des reins E16. De plus, nous avons démontré que l'activation de la voie WNT-calcium in vitro réduit la motilité des cellules, un processus important lors de la condensation des cellules mésenchymateuses pour former la vésicule rénale. Afin d'évaluer le rôle de la voie de signalisation WNT-calcium dans la maladie polykystique autosomale dominante des reins, nous avons croisé des souris disposant d'un gène rapporteur de l'activité transcriptionnelle de NFAT à celles présentant une mutation dans Pkd2. Nous avons constaté que l'activité de la voie de signalisation est considérablement réduite dans les reins kystiques. Ensemble, cette étude confirme l'hypothèse selon laquelle il y aurait une permutation développementale entre les voies canonique et non-canonique de signalisation WNT durant le développement normal du rein, et suggère que l'absence de toute activité de la voie WNT-calcium pourrait être un facteur contribuant à la pathogenèse de la maladie polykystique autosomale dominante des reins.

Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)/Ras/Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) signaling is involved in regulation of cell proliferation, migration and apoptosis. Activating mutations in EGFR or downstream components of the signaling pathway as well as a loss of a negative regulator of EGFR/Ras/MAPK signaling have been implicated in cancer. EGFR endocytosis and trafficking to the lysosome is an important mechanism of signal downregulation. A small GTPase Rab7 regulates EGFR trafficking and degradation, however its effects on signaling are not known. In C. elegans a highly conserved EGFR/Ras/MAPK signaling pathway is required for vulval cell fate specification. We found that RAB-7 antagonizes LET-23 EGFR signaling during vulval induction suggesting a possible role as a tumor suppressor in mammals. Here I show that a rab-7(ok511) deletion mutant regulates LET-23 localization in the Vulval Precursor Cells (VPCs). Additionally, my data suggest that LET-23 EGFR, similar to mammalian EGFR, traffics through multivesicular bodies (MVBs) en route to lysosome as RNAi knock-down of ESCRT-0 and –I components, HGRS-1 and VPS-28, can suppress the severity of the Vulvaless (Vul) phenotype of a LET-23 mislocalization mutant lin-2(e1309). To identify additional genes that might regulate LET-23 EGFR trafficking and signaling, I conducted a pilot forward genetic screen for suppressors of the lin-2(e1309) Vul phenotype. I identified two suppressor mutants, vh4 and vh22, that are partial embryonic lethal and display phenotypes suggestive of vesicular trafficking defects. I mapped vh4 and vh22 to distinct regions of chromosome I, devoid of previously identified regulators of LET-23 EGFR signaling, suggesting that they are mutations in novel regulators. Additionally, vh4 can enhance the Multivulva (Muv) phenotype of a Ras gain-of-function mutant let-60(n1046) further implicating vh4 as a negative regulator of EGFR/Ras/MAPK signaling. RNAi and genetic complementation data identified AGEF-1, an Arf-GEF, as a potential candidate for vh4. Although I have been unable to identify a corresponding mutation in agef-1, I find that vh4 mutants have phenotypes consistent of a defect in a secretory pathway and affecting AGEF-1 activity. Thus, vh4 and vh22 might represent mutations in novel negative regulators of LET-23 EGFR signaling and possibly regulate trafficking of the receptor. / La voie de signalisation EGFR/Ras/MAPK est impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire, la migration et l'apoptose. Les mutations qui activent l'EGFR ou les composants qui sont en aval dans la voie de signalisation ainsi que la perte d'un régulateur négatif de l'EGFR / Ras / MAPK ont été impliquées dans le cancer. L'endocytose et le trafic de l'EGFR vers le lysosome est un important mécanisme de régulation négative du signal. La GTPase Rab7 régule le trafic vésiculaire et la dégradation de l'EGFR qui est un mécanisme important d'atténuation du signal. Toutefois, les effets de Rab7 sur la voie de signalisation EGFR/Ras/MAPK ne sont pas encore connus. La voie de signalisation EGFR/Ras/MAPK qui est très conservée chez C. elegans, est responsable pour la spécification de l'identité cellulaire de la vulve. Nous avons constaté que RAB-7 antagonise la signalisation de LET-23 EGFR pendant l'induction vulvaire, ce qui suggère un rôle possible de Rab7 comme un suppresseur de tumeur chez les mammifères. Ici, je montre que la perte de fonction du mutant de rab-7, rab-7(ok511), régule la localisation du récepteur LET-23 dans les cellules précurseurs vulvaires (CPV). En outre, mes données suggèrent que le récepteur LET-23 (comparable au EGFR chez les mammifères) transitent des corps multivésiculaires (CMVs) vers les lysosomes puisque la réduction d'expression des components du complexe ESCRT-0 et ESCRT-I, HGRS-1 et VPS-28, par ARN interférence supprime la sévérité du phénotype Vul de lin-2(e1309), la mutation qui provoque une mauvaise localisation du LET-23. J'ai mené un projet pilote génétique pour trouver les suppresseurs du phénotype Vul de lin-2(1309) afin d'identifier d'autres gènes qui pourraient aussi réguler le trafic vésiculaire du récepteur LET-23 EGFR. Deux suppresseurs, vh4 et vh22, ont été identifiés. Ils montrent un phénotype de létalité embryonnaire partiel et d'autres phénotypes suggérant un défaut du trafic vésiculaire. J'ai cartographié vh4 et vh22 à des régions distinctes du chromosome I dépourvues de régulateurs du récepteur LET-23 EGFR identifiés précédemment, ce qui suggère que ses mutations sont des nouveaux régulateurs de la voie de signalisation de l'EGFR. En outre, vh4 peut améliorer le phénotype Muv du let-60(n1046), la mutation qui active Ras en permanence, ce qui implique vh4 comme un régulateur négatif de l'EGFR/Ras/MAPK. Des expériences d'ARN interférence ainsi que de la complémentation génétique ont identifié AGEF-1, une Arf1-GEF, comme un candidat potentiel pour vh4. Bien que je n'ai pas pu trouver une mutation correspondante au gène agef-1, je trouve que les mutants vh4 ont des phénotypes cohérente d'un défaut dans une voie de sécrétion et affectant AGEF-1. En conclusion, vh4 et vh22 sont éventuellement des mutations de nouveaux régulateurs négatifs de la voie de signalisation de EGFR/Ras/MAPK qui moduleraient aussi le trafic vésiculaire du récepteur LET-23 EGFR.

The gene product of MMAA is required for the intracellular metabolism of cobalamin (Cbl). Mutations in this gene lead to the cblA class of disorders, characterized by isolated methylmalonic aciduria. We have been concerned that somatic cell methods of diagnosis may miss patients with mild cellular phenotypes. A high resolution melting (HRM) analysis assay was developed to rapidly scan the coding exons and flanking intronic regions of the MMAA genes for variants. DNA from 96 unaffected reference individuals, 72 patients with complementation confirmed cblA, and 181 patients with elevated isolated methylmalonic acid, who could not be diagnosed using complementation analysis, were scanned by HRM. Suspected variants were confirmed using Sanger sequencing. In the cblA cohort, HRM correctly identified all previously known mutations as well as an additional 22 variants, 10 of which had not been previously reported. Novel variants included one duplication (C.551dupG, p.C187LfsX3), one deletion (c.387delC, p.Y129YfsX13), one splice site mutation (c.440-2A>G, splice site), 4 missense mutations (c.748G>A, p.E520K; c.820G>A, p.G274S; c.627G>T, p.R209S; c.826A>G, p.K276E), and 3 nonsense mutations (c.960G>A, p.W320X; c.1075C>T, p.E359X; c.1084C>T, p.Q362X). All novel missense variants, listed above, affect highly conserved residues and are predicted to be damaging. Scanning of MMAA in the 181 undiagnosed samples revealed a single novel heterozygous missense change (c.821G>A, p.G274D). / Le produit génique du MMAA est nécessaire pour le métabolisme de la cobalamine intracellulaire (Cbl). Des mutations dans ce gène conduisent à la classe de maladies cblA, caractérisé par l'acidurie méthylmalonique isolée. Nous avons été concernés que les méthodes de diagnostic de cellules somatiques peuvent manquer les patients atteints phénotypes cellulaires moins sévère. Une teste de fusion à haute résolution a été développé pour balayer rapidement les exons codantes et les régions introniques adjacentes du gène MMAA pour des variantes. Nous avons testé l'ADN à partir de 96 personnes de référence qui ne sont pas touchés, 72 patients atteints de cblA confirmé par complémentation et 181 patients présentant une élévation de l'acide méthylmalonique isolée, qui ne pouvaient pas être diagnostiquée à l'aide d'analyse de complémentation. Les variantes suspectes ont été confirmées à l'aide de séquençage Sanger. Dans la cohorte cblA, l'analyse de fusion à haute résolution a correctement identifié toutes les mutations connues antérieurement, ainsi que 22 autres variantes, dont 10 n'avaient pas été signalés précédemment. Nouveaux variantes inclus une duplication (C.551dupG, p.C187LfsX3), une délétion (c.387delC, p.Y129YfsX13), une mutation du site d'épissage (c.440-2A> G, site d'épissage), 4 mutations faux-sens (c. 748G> A, p.E520K; c.820G> A, p.G274S; c.627G> T, p.R209S; c.826A> G, p.K276E), et 3 mutations non-sens (c.960G> A, p.W320X; c.1075C> T, p.E359X; c.1084C> T, p.Q362X). Toutes les variantes faux-sens nouveaux, énumérés ci-dessus, affectent des résidus hautement conservés et sont prévus pour être endommageant. L'analyse de MMAA dans les 181 échantillons non diagnostiqués a révélé un seul changement faux-sens hétérozygote (c.821G> A, p.G274D).

Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis cause a food-borne disease resulting in gastroenteritis. To study the persistence of Salmonella during the late phase of infection, a mouse model was developed using C57BL/6J mice that clear the bacteria completely from the spleen and lymph nodes within 42 days post-infection and 129S6 mice that become chronic carriers. Linkage analyses using a cross between C57BL/6J and 129S6 mice led to the mapping of ten quantitative trait loci, Ses1 to Ses10, affecting Salmonella persistence in mice. In the females, Ses3 showed significant effects on bacterial clearance and two significant interactions between Ses1.2 and Ses4 and between Ses1.2 and Ses5. To functionally validate in vivo the interaction between Ses1.2 and Ses4 or Ses5, we created double congenic mice. Bacterial counts in the spleen and the liver demonstrated that both the 129S6.B6-Ses1.2/Ses4 and the 129S6.B6-Ses1.2/Ses5 mice clear Salmonella Enteritidis more efficiently than 129S6 or single congenic mice at day 42 post-infection validating the interaction terms identified by statistical analyses. We also tested the candidacy of Hamp as the gene underlying Ses5 by quantitative complementation test in which we did not detect a significant interaction between Hamp and Ses5. In addition, the effect of Nramp1 on the Salmonella expression of virulence factors, notably mgtB and phoP was investigated ex vivo and in vivo. To validate our hypothesis in vivo, we present the creation of ΔmgtB and ΔphoPQ Salmonella Enteritidis mutants. / Salmonella Typhimurium et Salmonella Enteritidis sont des agents microbiens qui causent une gastroentérite d'origine alimentaire. Pour étudier le portage asymptomatique des salmonelles, nous avons développé un modèle chez la souris en utilisant les souris C57BL/6J qui arrivent à éliminer complètement la bactérie de la rate et des ganglions lymphatiques en l'espace de 42 jours après infection et les souris 129S6 qui deviennent des porteurs chroniques. En utilisant une approche de criblage génomique par locus, nous avons identifié dix loci (Ses1-Ses10) affectant la persistance de Salmonella chez la souris. Chez les femelles, le locus Ses3 et les interactions épistatiques entre les loci Ses1.2 et Ses4 et Ses1.2 et Ses5 participent à l'élimination de la bactérie. Pour valider les deux interactions in vivo, nous avons créé des nouvelles lignées congéniques combinatoires. L'énumération des bactéries dans la rate et le foie démontre que les souris 129S6.B6-Ses1.2/Ses4 et 129S6.B6-Ses1.2/Ses5 arrivent à éliminer Salmonella Enteritidis plus efficacement que les souris 129S6 ou les souris congéniques qui comprennent seulement un des locus au jour 42 après infection, validant les interactions identifiées par analyses statistiques. Nous avons testé la candidature du gène Hamp pour l'intervalle Ses5 en exécutant un test de complémentation pour lequel nous n'avons pas détecté d'interaction significative entre Ses5 et Hamp. De plus, l'influence de Nramp1 sur l'expression de facteurs virulents de Salmonella, notamment mgtB et phoP, a été investigué ex vivo et in vivo. Pour valider notre hypothèse in vivo, nous présentons la création de mutants bactériens pour les deux gènes.

Echinoid (Ed) is a homophilic cell adhesion molecule previously implicated in the regulation of the actin cytoskeleton during the development of Drosophila melanogaster. In the ovary, borders between populations of follicle cells that express Ed and those that lack Ed are associated with localized contractile actomyosin structures that function in the normal morphogenesis of this epithelium. Such contractile actomyosin structures also assemble at the borders of ed mutant follicle cell clones, which develop smooth interfaces with surrounding Ed-expressing cells. In the embryo, a differential Ed-expression border between the embryonic epidermis and the amnioserosa is likewise associated with a contractile actomyosin cable.Since Ed protein becomes asymmetrically localized in Ed-expressing cells that are adjacent to cells without Ed, a model for Ed function has been proposed in which the planar polarized distribution of Ed induces actomyosin cable assembly at interfaces of differential Ed expression. However, such localized actomyosin cable formation could also be explained by an alternative model in which Ed acts as a negative regulator of actomyosin assembly at interfaces where it is localized. Here, I investigate these two alternative models for Ed function in the regulation of the actin cytoskeleton by analyzing ed mutant clones in the ovary. By analyzing the effect of ed mutant clone size on apical area of ed mutant cells I provide evidence that apical area of ed mutant cells is affected by actomyosin contractility generated at clone borders, consistent with the hypothesis that actomyosin assembly is induced by the asymmetric distribution of Ed in cells surrounding ed clones. I also present data that suggest that the actomyosin component F-actin is enriched at the borders of ed mutant clones relative to interfaces between ed mutant cells or between Ed-expressing cells, consistent with the hypothesis that asymmetric distribution of Ed induces actomyosin cable assembly at this site. However, my analysis also reveals that F-actin accumulates at interfaces between ed mutant cells at higher than levels at interfaces between Ed-expressing cells. Therefore, this finding suggests a potential role for Ed in the negative regulation of actomyosin.Since the upstream factors that establish the differential expression of Ed between the embryonic epidermis and amnioserosa during dorsal closure are unknown, I also investigated the transcription factor Grainyhead (Grh) as a candidate regulator of Ed expression in the embryo. I found that although ectopic expression of Grh is sufficient to induce the ectopic expression of Ed in the amnioserosa, grh function is not required for the normal expression of Ed in the embryonic epidermis or in the ovary. These findings suggest that other factors are responsible for the regulation of Ed in the ovary and the embryo, and for the establishment of differential Ed expression interfaces in these tissues. / Echinoid (Ed), une molécule d'adhésion homophilique, a précédemment été impliquée dans la régulation du cytosquelette d'actine durant le développement chez la drosophile (Drosophila melanogaster). Dans l'ovaire, des structures contractiles d'actomyosine sont associées à la frontière entre les cellules folliculaires exprimant Ed et celles n'exprimant pas Ed. Ces structures ont une fonction au cours de la morphogénèse de l'épithélium folliculaire ovarien normal. Une telle structure contractile d'actomyosine est aussi visible à la limite entre les clones de cellules folliculaires mutantes pour ed et les cellules folliculaires normales de l'épithélium, créant ainsi une délimitation lisse entre les deux populations de cellules. Dans l'embryon, une expression différentielle endogène d'Echinoid est aussi retrouvée entre les cellules épidermiques et les cellules de l'amniosérose, menant à l'assemblage d'un câble contractile d'actomyosine. Dans les cellules exprimant Ed adjacentes à celles n'exprimant pas Ed, la protéine Ed sera asymétriquement localisée, d'où le modèle proposé pour la fonction d'Echinoid où la distribution polarisée plane d'Ed induit l'assemblage d'un câble d'actomyosine à l'interface d'une expression différentielle d'Ed. Toutefois, le modèle alternatif propose que la protéine Echinoid agisse comme un régulateur négatif sur l'assemblage d'un câble d'actomyosine aux interfaces où elle est localisée. Le projet présenté ici étudie ces deux modèles alternatifs par l'analyse des clones de cellules mutantes pour ed dans l'ovaire. L'analyse de l'effet de la taille des clones de cellules mutantes pour ed sur l'aire apicale de ces cellules mutantes démontre que cette aire apicale est affectée par la contraction du câble d'actomyosine généré à la frontière du clone de cellules mutantes. Ceci est cohérent avec l'hypothèse voulant que l'assemblage du câble d'actomyosine soit induit par une distribution asymétrique d'Ed dans les cellules entourant un clone de cellules mutantes pour ed. De plus, les données révèlent que l'actine F, un composant du câble d'actomyosine, est enrichi à la frontière entre les cellules mutantes pour ed et les cellules de type normal exprimant Ed par rapport aux différents interfaces entre ces cellules elles-mêmes. Ceci appuie l'hypothèse que la distribution asymétrique d'Ed induit l'assemblage d'un câble d'actomyosine à cet endroit. Toutefois, l'analyse révèle également que l'actine F s'accumule aux interfaces entre les cellules mutantes pour ed à des niveaux plus élevés qu'aux interfaces entre les cellules exprimant Ed. Ce résultat suggère un rôle probable pour Ed dans la régulation négative du câble d'actomyosine.Les facteurs impliqués en amont pour établir une expression différentielle d'Ed entre les cellules épidermiques et les cellules de l'amniosérose durant l'étape de fermeture dorsale de l'embryon sont encore inconnus. Le facteur de transcription Grainyhead (Grh) a ainsi été évalué comme candidat à la régulation de l'expression d'Ed dans l'embryon. Bien qu'une expression ectopique de Grh est suffisante pour induire l'expression d'Ed dans les cellules de l'amniosérose, la fonction de Grh n'est pas requise pour l'expression normale d'Ed dans les cellules épidermiques embryonnaires ou dans l'ovaire. Ces résultats suggèrent que d'autres facteurs soient responsables de la régulation d'Echinoid dans l'ovaire et dans l'embryon ainsi que pour l'établissement d'une expression différentielle d'Ed dans ces tissus.

Diseases affecting motor neurons, such as amyotrophic lateral sclerosis (Lou Gerhig's disease), hereditary spastic paraplegia and spinal bulbar muscular atrophy (Kennedy's disease) form a heterogeneous group of chronic progressive diseases and are among the most puzzling yet untreatable illnesses. Over the last decade identification of mutations in genes predisposing to these disorders has provided the means to better understand their pathogenesis. The discovery 13 years ago of SOD1 mutations linked to ALS, which account for less than 2% of all cases, had a major impact in the field. However, despite intensive research effort, the pathways leading to the specific motor neurons degeneration in the presence of SOD1 mutations have not been fully identified. The research projects presented here aim to investigate the role of different cell types and tissues in the pathology of SOD1-linked ALS, and to identify new genetic factors involved in sporadic ALS cases. LoxP transgenic mice expressing mutated G85R SOD1, allowing transgene expression in cell and tissue specific manner, have been successfully generated. However, mice, up to 2.5 years of age, did not develop any motor neuron deficits or any developmental abnormalities. We concluded that this might be due to insufficient level of the transgene expression in our transgenic animals. Also, a number of candidate genes for ALS have been identified, such as ALS2, VEGF, PRPH, CHGA and CHGB, based on their pattern of expression and biological function. These genes have been screened for mutations in a cohort of ALS patients and, we have identified one basepair deletion in the ALS2 and in the PRPH genes, and we have also found a strong genetic association between the CHGA and CHGB genes with ALS. An in-vitro cell transfection approach has been used to investigate the biological effects of mutations within the PRPH genes and, of particular interest, this technique has revealed the first functional variants in a neurofilament associated gene ever describe in ALS.

In mammals, mitochondria and mitochondrial DNA (mtDNA) are transmitted through the female germline. Mature oocytes contain nearly 200,000 copies of mtDNA, organized at 1-2 copies per organelle. Despite the high genome copy number, mtDNA sequence variants are observed to segregate rapidly between generations, and this has led to the concept of a genetic bottleneck for the transmission of mtDNA. In this thesis, I demonstrate that a subgroup of replicating genomes in the early post-natal ovary is responsible for the rapid segregation of mtDNA. I show that the rate of segregation of mtDNA can be accelerated when mtDNA copy number is further reduced in heteroplasmic germline-specific knockout mouse models, yet very extreme reductions in germ cell mtDNA content seem to cause female-specific infertility. Low copy number embryos can be fertilized and proceed through preimplantation development yet fail to develop normally after implantation. Tracking the developmental outcome of embryos containing a range of mtDNAs points to a developmental threshold of about 50,000 copies of mtDNA in the oocyte In this thesis I advance the hypothesis that the large number of mitochondria and mtDNAs present in the oocyte represent a genetic mechanism to ensure their distribution to the gametes and somatic cells of the next generation. If true, mtDNA copy number may be the most important determinant of oocyte quality not because of the effects on oocyte metabolism, but because too few would result in a maldistribution in the embryo. / Les mitochondries et l’ADN mitochondrial (ADNmt) sont des organites cellulaires qui ne sont transmis que par l'ovule de la mère. Chez les mammifères, l’ovocyte contient presque 200 000 copies d’ADNmt, avec 1-2 copies au sein de chaque mitochondrie. Malgré la grande quantité d’ADNmt, nous observons une ségrégation rapide des variants de séquences entre les générations qui nous amène à l’hypothèse d’un goulot d’étranglement génétique pour l’ADNmt. Par cette thèse, je démontre que ce phénomène est dû à un sous-groupe de génomes mitochondriaux qui se multiplient dans l’ovocyte postnatal de la souris. En outre, je démontre qu’une réduction d’ADNmt dans les cellules de souche germinale peut augmenter la vitesse à laquelle ces génotypes se séparent. Une très importante réduction d’ADNmt dans les ovocytes de ces souris mutantes les rend stériles. Or la fertilisation de ces ovocytes ainsi que le développement pré-implantatoire se déroulent normalement, par contre l’embryon qui provient d’un ovocyte avec une très faible quantité d’ADNmt ne peut compléter son développement post-implantatoire. Par cette thèse, je propose l’hypothèse suivante : que la grande quantité de mitochondries et génomes mitochondriaux sert à distribuer un nombre suffisant de ces organites aux cellules somatiques et germinales de la prochaine génération. Si cela est vrai, la quantité d’ADNmt pourrait être le plus important déterminant quant à la qualité de l’ovocyte, pas à cause de ses effets sur le métabolisme de l’ovocyte, mais par le fait qu’une quantité insuffisante empêcherait sa distribution dans les cellules de l’embryon.

Epithelial ovarian cancer (EOC) is frequently diagnosed at advanced stage, which is associated with poor outcome. The etiology of this disease is largely unknown, hindering the development of effective disease detection strategies and treatment options. Cytogenetic and molecular genetic analyses have frequently reported chromosome 17 anomalies in EOC. Loss of heterozygosity (LOH) analyses have found loss of chromosome 17 often involving an entire chromosome 17 homologue, as well as recurrent patterns of LOH of specific regions of chromosome 17, such as 17q25. Based on Alfred G. Knudson's "two-hit model" and the paradigm of the classical tumour suppressor gene (TSG), LOH may be indicative of a TSG-containing genomic region. The hypothesis of this thesis research states that there exist as yet unidentified TSGs mapping to chromosome 17 that contribute to EOC tumourigenesis. LOH analysis was performed to refine a previously identified minimal region of deletion (MRD) at 17q25 and identify TSG candidates. Refinement of the MRD to a 65 Kb interval found three candidate genes that mapped to this region. Gene expression analysis of the candidate genes found RHBDF2 and CYGB to be underexpressed in EOC samples, relative to primary cultures of normal ovarian surface epithelial cells (NOSE) samples. These two candidate genes were investigated for DNA sequence mutations and evidence of promoter methylation, which are classical mechanisms of TSG inactivation. No mutations were identified in either gene, however evidence of promoter methylation was found for CYGB. Thus based on their expression profiles, and in the case of CYGB, evidence of promoter methylation, both RHBDF2 and CYGB have emerged as TSG candidates in EOC warranting further investigation to test their TSG candidacy. An alternate approach for identifying regions of LOH, whole-genome genotyping analysis using single nucleotide polymorphism (SNP) arrays, was performed on high-grade ovarian serous carcinoma (HGOSC) samples to characterize the genomic content of these samples. In that analysis LOH of the entirety of chromosome 17 was observed in nearly 100% of samples analysed, suggesting that LOH of this chromosome is a near-ubiquitous feature of these cancers. Gene expression microarray analysis was performed to identify chromosome 17 genes that are differentially expressed in HGOSC samples relative to the primary cultures of NOSE samples. This analysis found 253 differentially expressed genes, where five genes, ADORA2B, CCL2, ACLY, WIPI1, and SLC16A3, were found underexpressed at least three-fold in all HGOSC samples analysed, relative to the primary cultures of NOSE samples. Underexpression may be indicative of an inactivated TSG, thus a "functional" complementation approach was used to test whether "re-expressing" one of these five genes would suppress tumourigenicity. An expression vector containing the coding region of CCL2 was transfected into the tumourigenic EOC cell line OV-90, which does not express CCL2, to generate stable CCL2-expressing clones. Injection of the CCL2¬-expressing clones into SCID mouse xenograft tumour models resulted in increased tumour latency and increased survival, relative to mice injected with the parental cell line. Thus expression of CCL2 appears to contribute to increased tumour latency, suggesting that this gene contributes to inhibiting tumourigenesis. This thesis research found that chromosome 17 loss and underexpression of chromosome 17 genes is common in HGOSC, suggesting that several chromosome 17 genes may be involved in TSG pathways, and that the genes RHBDF2, CYGB and CCL2 are candidate TSGs warranting further investigation in EOC. / Le cancer épithélial de l'ovaire (CEO) est fréquemment diagnostiqué à un stade avancé de la maladie ce qui l'associe à une issue défavorable. L'étiologie de la maladie reste en grande partie inconnue, ce qui nuit au développement de stratégies de dépistage efficaces ainsi qu'au développement de nouveaux traitements. Le chromosome 17 présente de fréquentes anomalies dans les CEO. Des analyses de pertes d'hétérozygotie (LOH) ont mis en évidence la perte allélique de régions spécifiques du chromosome 17 et même la perte du chromosome 17 dans son intégralité. Selon la théorie des deux évènements de Alfred G. Knudson et le paradigme des gènes suppresseurs de tumeurs (TSG) classiques, ces LOH présentes sur le chromosome 17 suggèrent la présence de régions abritant des TSG. Ce travail de thèse se base sur l'hypothèse qu'il existe au moins un TSG, encore non identifié, localisé sur le chromosome 17 qui contribuerait à l'initiation ou au développement du CEO. Une analyse LOH a été effectuée pour affiner la cartographie d'une région minimale de délétion (RMD), déjà déterminée dans la région 17q25, et identifier de nouveaux TSG. L'affinement des frontières de la RMD a réduit à 65 Kb l'intervalle et a identifié trois gènes candidats. L'analyse de l'expression de ces gènes a montré une répression transcriptionnelle de RHBDF2 et de CYGB dans des échantillons de CEO, comparativement à des cultures primaires ce cellules épithéliales de l'ovaire normal (EON). Ces deux gènes candidats ont fait l'objet d'analyses génétiques pour la détection des mécanismes classiques d'inactivation des TSG. Aucune mutation ne fut trouvée dans ces deux gènes, en revanche, le promoteur de CYGB est apparu méthylé. En s'appuyant sur leurs profils d'expression génique, et dans le cas de CYGB, sur la méthylation du promoteur, RHBDF2 and CYGB apparaissent comme de sérieux candidats. Une approche alternative pour identifier les régions présentant des LOH, le génotypage à l'échelle du génome entier par puces à marqueurs SNP (Polymorphismes à Simple Nucléotide), a été utilisée sur des d'échantillons de carcinomes ovariens séreux de haut grade (COSHG) pour caractériser leur contenu génomique. Les résultats montrent qu'une LOH du chromosome 17 dans son intégralité est observée dans 100% des cas analysés, suggérant que le LOH pour ce chromosome est ubiquitaire dans ce type de cancer. L'analyse de l'expression génique par puce à ADN a été effectuée pour identifier les gènes du chromosome 17 qui sont différentiellement exprimés dans les COSHG, comparativement aux EON. Cette analyse a révélé 253 gènes différentiellement exprimés, et parmi eux, ADORA2B, CCL2, ACLY, WIPI1, et SLC16A3, ont été trouvés transcriptionnellement réprimés dans tous les COSHG. Cette répression transcriptionnelle pouvant indiquer l'inactivation d'un TSG. Une approche fonctionnelle de complémentation a été utilisée pour tester si la réexpression d'un des ces gènes pourrait supprimer la tumorigénicité dans les COSHG. Un vecteur d'expression contenant la région codante du CCL2 a été transfecté dans OV-90, une lignée cellulaire de CEO qui n'exprime pas CCL2, afin de générer des clones stables exprimant CCL2. L'injection de ces clones dans des souris SCID a montré une latence dans la formation de tumeurs et une prolongation de la survie des souris, comparativement à celles injectées avec OV-90. L'expression de CCL2 semble donc induire une latence dans la formation tumorale, ce qui suggère que ce gène participe à l'inhibition de la tumorigénèse. Ce travail de thèse a montré que la perte allélique du chromosome 17 ainsi que la répression transcriptionnelle des gènes du chromosome 17 sont des évènements fréquents dans les COSHG. Les résultats obtenus suggèrent que plusieurs gènes sur ce chromosome pourraient être impliqués dans la tumorigénèse ovarienne, et que RHBDF2, CYGB et CCL2 sont de candidats pour être des TSG, méritant de faire l'objet d'analyses plus approfondies sur leurs fonctions dans les CEO.