The study of the transcriptome, which consists of all RNA molecules in a cell, has been important for elucidating the underlying mechanisms involved in the regulation and expression of genes. Here we describe two studies that apply current high-throughput techniques to investigate two genetic phenomena at the transcriptome level in humans: alternative splicing using whole-transcript gene expression microarrays, and gene fusions using massively parallel transcriptome sequencing (RNA-Seq). Alternative splicing is a post-transcriptional mechanism that allows for the production of multiple transcript isoforms of the same gene, resulting in increased transcriptome diversity. Recently, the global analysis of AS has been facilitated by the Exon Array, which feature oligonucleotide probes that target individual exons across the length of the gene. A similarly designed array, the Gene Array, was later released for measuring whole gene expression. In our first study, we questioned whether it could be used to study AS. We analyzed previously published data to show that expression profiling at both the gene and exon level was highly concordant between both platforms. This suggests that the Gene Array is capable of making AS observations like the Exon Array. Another profiling tool that has emerged is RNA-Seq, which enables the profiling of the entire transcriptome at single-base resolution. In the second study, we describe an RNA-Seq approach to detect gene fusions, which have been frequently implicated in cancer. The role of gene fusions in BRCA1-mutated breast cancers has not been well explored. BRCA1 is involved in tumour suppression by regulating DNA repair pathways and thus mutations in this gene can lead to increased chromosomal instability. While we hypothesized that this may lead to the creation of gene fusions, we did not find them to be significantly enriched. We identified, however, one novel gene fusion that was non-recurrent. With these two studies, we demonstrate how the continued advancement of investigative tools can aid in making biological discoveries. / L'étude du transcriptome, composé de toutes les molécules d'ARN dans la cellule, a été très importante pour élucider les mécanismes impliqués dans la régulation et l'expression des gènes. Dans les travaux présentés ici, nous décrivons deux stratégies appliquant des technologies à haut débit afin d'étudier deux phénomènes à l'échelle du transcriptome humain : l'épissage alternatif en utilisant des puces à ADN, et les fusions de gènes en utilisant le séquençage d'ARN de nouvelle génération (RNA-Seq). L'épissage alternatif est un mécanisme post-transcriptionnel qui permet la production de plusieurs transcrits à partir d'un seul gène, permettant ainsi d'augmenter la diversité du transcriptome. Récemment, l'analyse globale de l'épissage alternatif a été grandement facilitée par une micropuce à ADN « Exon Array », qui possède des sondes ciblant des exons individuels tout au long des gènes. Un autre type de micropuce à ADN, la « Gene Array », a ensuite été développée pour quantifier l'expression génique seulement, au niveau du génome complet. Dans la première étude présentée dans cette thèse, nous vérifions la possibilité d'utiliser ce dernier type de micropuces afin d'étudier l'épissage alternatif. Nous avons analysé des données publiées dans le passé afin de montrer que le profil d'expression obtenu tant au niveau de gènes complets qu'au niveau des exons est très concordant entre les deux plateformes. Ceci suggère que la micropuce de gènes permette d'étudier l'épissage alternatif tout comme la micropuce à exons. Ultérieurement, une nouvelle technologie a émergé : le RNA-Seq. Cette technologie permet d'obtenir le profil du transcriptome au complet avec une résolution d'une seule base. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous présentons une approche basée sur le RNA-Seq pour détecter des fusions de gènes, fréquemment impliquées dans le cancer. Le rôle des fusions de gènes dans les cancers qui possèdent des mutations dans le gène BRCA1, n'a pas été exploré en détail jusqu'à présent. BRCA1 est impliquée dans la suppression de tumeurs par l'entremise de la régulation des voies de réparation d'ADN. Des mutations dans ce gène pourraient donc produire une augmentation de l'instabilité des chromosomes, ce qui entraînerait des fusions de gènes. Cependant, nous n'avons trouvé aucune augmentation significative de fusions en présence de mutations de BRCA1. Nous avons néanmoins identifié une nouvelle fusion de gènes qui a été non récurrente. Grâce à ces deux études, nous démontrons comment l'avancement continu des technologies de recherche peut contribuer aux découvertes biologiques.

By controlling many steps of organelle biogenesis and cargo transport, Rab GTPases are central regulators of vesicular trafficking in endocytic and exocytic pathways. During endosomal maturation, coordinated activity of the early endosomal Rab5 and late endosomal Rab7 GTPases is required for a proper cargo delivery to the lysosome. It has been proposed that Rab5 induces Rab7 recruitment on vesicles, which in turn, induces Rab5 inactivation and removal. However, this Rab5 and Rab7 coupling model is incomplete without regulatory elements such as Rab GAPs to restrict their spatio-temporal overlap. In the present thesis, we have identified TBC-2, a conserved putative Rab GAP, as a regulator of endosome to lysosome trafficking in C .elegans. Our data show that TBC-2 localizes on late endosomes in a RAB-7 dependent manner. Consistent with the Rab conversion model, TBC-2 functions as a GAP to inactivate RAB-5 to facilitate early to late endosome transition. Furthermore, works from this thesis demonstrate that loss of tbc-2 perturbs the normal degradation of the yolk, a cholesterol binding/transport protein that has been suggested to serve as an energy source during development. Consistent with that, we observed that tbc-2 mutant L1 larvae die prematurely when hatched in absence of food. The exact function of yolk in C. elegans is not fully understood but our data suggest that yolk might be important for survival of starvation-induced L1 diapause in C. elegans. These studies highlight that a tight coordination between Rab GTPases and their regulators is essential for intracellular trafficking and alteration of this process causes detrimental effect on physiological function. They also underline that better understanding of mechanisms of vesicular transport is important for unravelling the etiology of trafficking diseases. / En contrôlant plusieurs étapes de l'organitogénèse et le transport des protéines cargo, les Rab GTPases sont des éléments-clés du trafic vésiculaire dans les voies de l'endocytose et l'exocytose. Pendant la maturation endosomale, les GTPases Rab5 et Rab7 qui marquent respectivement les endosomes précoces et tardifs, coordonnent leurs activités pour réguler le transport du cargo vers les lysosomes. Durant ce processus, Rab5 et Rab7 se régulent mutuellement: Rab5 induit le recrutement de Rab7 à la membrane de l'endosome qui lui-même induit en retour, l'inactivation et le relargage de Rab5 dans le cytoplasme. Néanmoins, ce modèle reste incomplet sans des éléments de régulation comme les Rab GAPs qui inactivent et restreignent la localisation spatio-temporale des Rab GTPases. Dans cette thèse, nous avons identifié TBC-2, une putative Rab GAP conservée, comme l'un des éléments importants pour le contrôle du transport vésiculaire des endosomes aux lysosomes chez le nématode C. elegans. Nos résultats démontrent que la localisation de TBC-2 aux les endosomes tardifs est dépendante de Rab7. De plus, en corrélation avec le modèle de maturation endosomale, nous avons démontré que TBC-2 stimule l'activité GTPasique de Rab5, facilitant ainsi la transition entre endosomes précoces et tardifs. Mon travail de thèse a démontré que la perte de fonction de tbc-2 perturbe la dégradation normale de la vitellogénine, un transporteur du cholestérol qui est utilisée comme source d'énergie au cours du développement. Nos résultats ont montré que les larves mutantes tbc-2 au stade L1 meurent prématurément lorsqu'elles restent dans un milieu sans nourriture. La fonction exacte de la vitellogénine chez C. elegans n'est pas encore bien connue mais nos résultats suggèrent qu'elle est importante pour la survie des larves L1 qui rentrent en diapause. En conclusion, ces études soulignent qu'une coordination étroite entre les protéines Rab GTPases et leurs régulateurs est essentielle pour l'intégrité du trafic vésiculaire et une altération de ce processus peut avoir une répercussion néfaste sur une fonction physiologique. Elles soulignent aussi qu'une meilleure compréhension des mécanismes du transport intracellulaire est nécessaire au décryptage des maladies liées au trafic vésiculaire.

The cblC form of combined methylmalonic aciduria and homocystinuria (OMIM 277400) is the most frequent inborn error of vitamin B12 (cobalamin, Cbl) metabolism, with over 500 patients identified worldwide. Due to mutations in the MMACHC gene, patients with this disease are unable to convert cobalamin into the two active forms, methylcobalamin and adenosylcobalamin, which are cofactors required by mammalian methionine synthase and methylmalonyl-CoA mutase, respectively. Clinical features of patients can include hematological, neurological, and ophthalmological findings, along with developmental delay. In this study, the requirement of Mmachc during mouse embryonic development is examined. The Mmachc gene was found to be expressed in head mesenchyme, dorsal root ganglia, heart, trachea, lung, esophagus, gut, mesonephric mesenchyme, and notochord during organogenesis in the mouse embryo. Mice containing a genetrap in intron 1 of the Mmachc gene were characterized. Mmachc heterozygous mice for the genetrap were shown to be fertile and viable, although a small number of heterozygous and wild type embryos were found to be phenotypically abnormal. Mice and embryos heterozygous for the MmachcGT1 allele were found in higher numbers than expected by Mendelian ratios. Embryos homozygous for the MmachcGT1 were only observed at embryonic day 3.5. These findings show that Mmachc is required during mouse embryonic development. / La forme cblC de l'acidurie méthylmalonique et l'homocystinurie combinée (OMIM 277400) est la maladie génétique la plus fréquente affectant le métabolisme de la vitamine B12 (cobalamine, Cbl), avec plus de 500 patients identifiés à travers le monde. En raison de mutations dans le gène MMACHC, les patients atteints de cette maladie sont incapables de convertir la cobalamine en les deux formes actives, soit la méthylcobalamine et l'adénosylcobalamine, qui sont des cofacteurs requis par les enzymes mammifères méthionine synthase et methylmalonyl-CoA mutase, respectivement. Les symptômes cliniques des patients peuvent être de l'ordre hématologique, neurologique, ophtalmologique ou d'un retard de développement. Dans cette étude, l'importance de MMACHC durant le développement embryonnaire de la souris est examinée. Le gène Mmachc est démontré comme étant exprimé dans le mésenchyme de la tête, les ganglions de la racine dorsale, le cœur, la trachée, les poumons, l'œsophage, l'intestin, mésenchyme mésonéphrique et la notochorde au cours de l'organogenèse chez l'embryon de souris. Une mutation de type « genetrap » a été insérée dans l'intron 1 du gène Mmachc, noté MmachcGT1, afin de bloquer la production d'une protéine fonctionnelle MMACHC. Les souris adultes hétérozygotes pour le « genetrap » Mmachc se sont avérées être fertiles et viables, même si un pourcentage d'embryons hétérozygotes possédait un phénotype anormal. Les souris et embryons hétérozygotes pour l'allèle MmachcGT1 ont été trouvés dans un nombre plus élevé que prévu par les ratios mendéliens. Les embryons homozygotes pour MmachcGT1 n'ont été observés qu'au jour embryonnaire 3.5. Ces résultats démontrent que le gène Mmachc est essentiel au cours du développement embryonnaire de la souris.

The nematode roundworm Caenorhabditis elegans has been extensively used to study the genetics of aging. The functions of many genes have been found to be able to affect this animal's lifespan. A large proportion of these genes are expressed in mitochondria, an organelle that plays important roles in energy metabolism and generates reactive oxygen species (ROS). These two characteristics of mitochondria have both been suggested to be crucial for lifespan determination. One hypothesis, called the oxidative stress theory of aging, proposes that high oxidative damage caused by ROS generated in mitochondria is the cause of aging. We found that the lifespan-increasing effect of electron transport chain (ETC) mutants (i.e. isp-1 and clk-1) as well as of several other long-lived mutants is not due to low oxidative damage, and that increasing oxidative damage fails to shorten their lifespan. I also identified a new long-lived mutant in a previously uncharacterized gene --nuo-6(qm200)--, which encodes the C. elegans orthologue of the B15 subunit of mammalian mitochondrial complex I. I found that this new mutation increases lifespan through the same pathway as isp-1(qm150) the previously characterized mutation in the iron sulphur subunit of complex III. Using RNA interference to knock down the level of expression of many mitochondrial genes has been found to increase the lifespan of C. elegans and of Drosophila by a mechanism that was assumed to be identical to that at work in mutations that altered the function of mitochondrial proteins. However, using the isp-1 and nuo-6 mutations I have shown that the mechanism that allows these mutants to be long-lived is, unexpectedly, completely distinct from the mechanism triggered by RNAi. Finally, I found that the generation of superoxide (a reactive oxygen species) is actually increased in these mutants, and that this elevation is necessary and sufficient for longevity. These studies challenge the traditional view about the role / Le nématode Caenorhabditis elegans est un organisme modèle qui a été extensivement étudié afin de mieux comprendre les bases de la génétique du vieillissement. Ces études ont mené à l'identification de plusieurs gènes jouant des rôles essentiels dans la détermination de la durée de vie de ce ver rond. La majorité de ces gènes sont exprimés au niveau des mitochondries, des organelles reconnues pour jouer un rôle primordial dans la régulation du métabolisme énergétique et pour être les principales sources des dérivés actifs de l'oxygène (reactive oxygen species, ROS). Ces deux caractéristiques propres aux mitochondries sont reconnues pour être cruciales dans la détermination de la durée de vie. Elles sont d'ailleurs à l'origine d'une hypothèse sur la cause du vieillissement, la théorie du stress oxydatif, qui propose que la génération de ROS par les mitochondries cause le vieillissement en induisant de façon graduelle des dommages oxydatifs aux divers constituants cellulaires. Dans cette étude, nous avons démontré que l'augmentation de la durée de vie observée chez des nématodes mutants pour des gènes mitochondriaux impliqués dans le transport des électrons (i.e. isp-1 and clk-1) ainsi que chez d'autres mutants reconnus pour leur longévité accrue n'est pas reliée à une diminution des dommages oxydatifs. D'autre part, nous avons montré que leur durée de vie n'est pas réduite suite à l'induction d'un stress oxydatif causant divers dommages. Cette étude nous a aussi amené à identifier un nouveau gène, nuo-6 (qm200), codant pour l'orthologue chez le ver de la sous-unité B15 du complexe I de la chaîne de respiration mitochondrial précédemment caractérisée chez les mammifères. La mutation de ce gène résulte en une augmentation de la durée de vie d'une manière similaire à ce qui est observé chez les vers mutants pour le gène isp-1(qm150), qui code pour une sous-unité du complexe III. L'utilisation d

Coronary heart disease (CHD) is the leading cause of morbidity and mortality in the western world. CHD is common throughout the world and is multifactorial, caused by the accumulation or interaction of quantitative changes in various intermediate traits (risk factors or metabolic phenotypes). Intermediate traits that are commonly studied include plasma levels of cholesterol (ie. low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and total cholesterol), body mass index (BMI) and blood pressure, which are all believed to be influenced by a combination of genetic and environmental factors (such as diet, alcohol, and exercise). In this thesis, the identification of novel genetic variants in candidate genes (a non-synonymous variant in farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1 (FDFT1) and a non-coding variant in insulin-induced gene 2 protein (INSIG2)) that are associated with total cholesterol and low density lipoprotein cholesterol is described. In addition, detailed investigation of common genetic variants in known genes identified from genome-wide association studies in the context of other genetic, phenotypic and environmental factors are reported. In particular, INSIG2 variants were observed to act in concert with a trans-acting variant in the sorbin and SH3 domain containing 1 gene (SORBS1) to influence LDL-C and apoB levels in Quebec, European and South Asian population samples. In addtition, fat mass and obesity associated gene (FTO) variants were observed to influence adiposity-related traits, resting metabolic rate and plasma leptin levels. I also report the role of dietary intake in modifying the effect of 9p21 variants on myocardial infarction and cardiovascular disease in the multi-ethnic INTERHEART study and in a Finnish sample, “FINRISK”. Finally, the utility of exome sequencing in identifying the genetic cause of a mendelian lipid disorder is demonstrated in a study that identifies compound heterozygo / La maladie coronarienne athéroscléreuse est l'une des causes principales de morbidité et de mortalité dans le monde occidental. Elle est commune à travers le monde et est multifactorielle, causée par une accumulation ou une interaction de changements quantitatifs de divers traits intermédiaires (facteurs de risque ou phénotypes métaboliques). Les traits intermédiaires souvent étudiés comprennent les taux plasmatiques de cholestérol (e.g. le cholestérol des lipoprotéines de faible densité (C-LDL), le cholestérol lié aux lipoprotéines de haute densité (C-HDL) et le cholestérol total), l'indice de masse corporelle (IMC) et la pression artérielle, qui sont tous présumés être influencés par une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux (tels que l'alimentation, l'alcool, et l'exercice). Dans cette thèse, l'identification de nouveaux variants génétiques (un variant non-synonyme du gène farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1 (FDFT1) et un variant non-codant du gène insulin-induced gene 2 protein (INSIG2)) de gènes candidats associés au cholestérol total et au C-LDL est décrite. De plus, une investigation détaillée des variants génétiques communs dans des gènes connus identifiés à partir d'études d'associations pangénomiques dans le contexte d'autres facteurs génétiques, phénotypiques et environnementaux sont aussi présentés dans cette thèse. En particulier, il a été démontré que les variants du gène INSIG2 agissent de concert avec un variant 'trans-acting' du gène sorbin and SH3 domain containing 1 (SORBS1) pour influencer les niveaux de C-LDL et les niveaux d'apoB dans des populations du Québec, d'Europe et d'Asie du Sud. De même, les variants du gène de fat mass and obesity associated (FTO) ont été observés à influencer des traits liées à l'adiposité, au taux métabolique au repos et au niveaux de leptine plasmatique. Dans ma thèse, je décris également le rôle de l'apport aliment

Bronchopulmonary dysplasia (BPD), a leading cause of morbidity in very low birth weight infants, is characterized by an arrest in alveolar development. An improved insight into the genes and mechanisms that regulate alveolarization is essential to enhance our understanding of the lung pathophysiology of BPD. LGL1, is a developmentally regulated, glucocorticoid induced, secreted glycoprotein in the lung. In order to establish the role of Lgl1 in alveolarization, I studied Lgl1 expression in two rat models of oxygen toxicity (BPD) that reproduce many of the characteristic features of BPD. I showed that in hyperoxia, Lgl1 levels are reduced and that these levels normalize during recovery in air. The 5' promoter region of Lgl1 has binding sites for the glucocorticoid (GC), retinoic acid (RA) and vitamin D (Vit D) receptors and for Smad3 (mediates transforming growth factor-beta (TGF-β) signalling), all of which modulate alveolarization and are considered to have a role in neonatal lung injury. Exposure of primary rat lung fibroblasts to GC, RA, Vit D and TGF-β1, alone or in combination, confirmed that all these agents regulate Lgl1 expression. Interestingly, the individual inhibitory effects of Vit D and RA on GC induction of Lgl1 were abrogated when both agents were present. Results of Luciferase assays were consistent with a role for all of these agents in transcriptional regulation. Interestingly, an analysis of the proximity (<50 base pairs) of binding sites for overlapping Vit D and RA receptors to that of the GC receptor identified 81% of promoters in 65 genes (including Lgl1) important in human lung development compared to 48% in a random set of 1000 genes. This suggests that steric hindrance may influence promoter accessibility when more than one of these agents is present simultaneously. In order to further explore the functional role of Lgl1, an Lgl1 knockout mouse model was generated. Absence of Lgl1 is embryonic lethal. Haploinsufficiency for Lgl1 deficiency was associated with a complex phenotype including: goblet cell hyperplasia, mucus production, increased expression of interleukins 4 and 13, elastin fragmentation and disruption of adult lung function. This phenotype was exacerbated by oxygen exposure. The combined results of my studies suggest that Lgl1 deficiency may contribute to neonatal lung injury in BPD. / La dysplasie bronchopulmonaire (DBP), une maladie caractérisée par l'arrêt du développement alvéolaire, demeure une des causes principales de morbidité chez les nouveau-nés de faible poids. Plus d'informations sur les mécanismes et les gènes impliqués dans l'alvéolarisation sont nécessaires afin de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie et aider au développement de nouvelles interventions thérapeutiques. LGL1 est une glycoprotéine sécrétée dans le poumon qui est induite par les glucocorticoïdes et est finement régulée lors du développement. Afin d'éclaircir le rôle de Lgl1 dans l'alvéolarisation, j'ai étudié l'expression de Lgl1 dans deux modèles de toxicité d'oxygène chez le rat. Sous hyperoxie, les niveaux de Lgl1 sont réduits puis redeviennent normaux lors de la récupération dans l'air. Le promoteur (région 5') de Lgl1 contient des sites de liaisons pour les récepteurs de glucocorticoïdes (GC), d'acide rétinoïque (AR), de la vitamine D (Vit D), ainsi que pour le facteur de transcription Smad3 (transmet le signal de « transforming growth factor-beta », TGF-β). L'exposition de cellules fibroblastes pulmonaires primaires de rat à ces agents, ensemble ou en combinaison, confirme qu'ils régulent tous l'expression de Lgl1. Fait intéressant, la Vit D ou l'AR seules peuvent inhiber l'expression de Lgl1 induite par GC. Par contre, quand la Vit D et l'AR sont présentes ensemble, aucune inhibition n'est observée sur l'expression de Lgl1 induite par GC. Des analyses de luciférase ont démontrées que ces agents agissent au niveau de la transcription de Lgl1. Une analyse de la localisation des sites de liaisons des récepteurs de GC, AR et Vit D indique que l'emplacement particulier de ces sites sur le promoteur de Lgl1 est aussi trouvé sur 81% des promoteurs de 65 gènes ayant un rôle connu dans le développement des poumons (comparé à seulement 48% d'un groupe de 1000 gènes aléatoires). Ceci suggère que l'encombrement stérique peut influencer l'accessibilité au promoteur quand plus d'un de ces agents est présent à la fois. Afin de déterminer si une déficience de Lgl1 est associée à une arrestation de l'alvéolarisation et contribue à la physiopathologie de la DBP, une souris mutante pour le gène Lgl1 a été générée. Un déficit de Lgl1 a révélé un phénotype complexe, incluant notamment : l'hyperplasie des cellules caliciformes, la production de mucus, l'augmentation de l'expression des interleukines 4 et 13, la perturbation du développement pulmonaire, la fragmentation de l'élastine et la perturbation de la fonction mécanique du poumon. Ce phénotype est aggravé par l'hyperoxie, suggérant que la carence de Lgl1 pourrait contribuer à la DBP dans la période néonatale.

The differentiated cell types of the mature pituitary gland are defined on the basis of the hormone that they synthesize and secrete. The temporal appearance and spatial localization of terminally differentiated cell types in the developing chick anterior pituitary gland were characterized using in situ hybridization and immunohistochemistry to identify the presence of pituitary hormone transcripts and protein, respectively. Corticotropes expressing ACTH were detected at embryonic day 7 (E7), melanotropes expressing MSH and gonadotropes expressing FSHbeta/LHbeta were detected at E8, thryotropes expressing TSH were detected at E10, somatotropes expressing GH were detected at E12 and lactotropes expressing prolactin were detected at E14. Hormones were localized to distinct but overlapping regions of the pituitary gland, with the exception of growth hormone which was only present in the caudal lobe of the anterior pituitary gland. / The expression patterns of several transcription factors and signaling molecules that have been shown to participate in pituitary cell type differentiation in mice and zebrafish were also analyzed. The ventral diencephalon expresses Shh, Bmp4 and Fgf-10, suggesting that these signals may be critical for chick pituitary gland development, as demonstrated in other species. Similarly, the transcription factors Lim3, Pitx1, Pitx2 and Pit1 are likely to regulate gene expression patterns in the developing pituitary that are essential for the initial differentiation of Rathke's pouch and terminal differentiation of cell types.

Past studies suggest that the primary cause of death in patients with the peroxisome disease, rhizomelic chondrodysplasia punctata (RCDP), may be due to lung dysfunction. In our laboratory, we have evaluated the RCDP equivalent mouse model, the Pex7 hypomorphic mouse, and found that it shows abnormal lung morphology, which coincides with the cause of death. However, the pathophysiology of this pulmonary dysfunction still remains unknown. RCDP is an autosomal recessive disease that involves PEX7 gene mutations. The PEX7 gene encodes a transporter protein that is essential for plasmalogen synthesis, and plasmalogens in turn, may play an integral role in secretion of surfactant proteins and lipids in specialized pulmonary cells e.g. alveolar type II (ATII) cells. We hypothesize that the hypomorphic Pex7 mouse model will secrete distinctively different quantities of surfactant proteins compared to wild type. To test this hypothesis, we stimulated ATII cell secretion under three-hour treatments using three drugs: terbutaline, ionomycin and TPA (tetra-12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate). These stimulate the PKA-dependent, CaMK-dependent and PKC-dependent pathways, respectively, of surfactant protein secretion. Surfactant protein B secretion was quantified by an immunoblotting assay.Our results show that the response of ATII cells to these drugs may be strain-dependent and age-dependent. ATII cells from wild type adult C57Bl6 (pure background) responded to terbutaline stimulation with increased surfactant protein B secretion; whereas ATII cells from wild type adult C57Bl6/129 (mixed background) did not. Furthermore, ATII cells from wild type neonatal C57Bl6/129 can only respond to terbutaline stimulation at ten times the concentration used on adult ATII cells.Finally, ATII cells from the Pex7 deficient mice (C57Bl6/129) did not respond to terbutaline stimulation from both neonatal and adult mice. We conclude that plasmalogen deficiency in the Pex7 hypomorphic model (C57Bl6/129) may be associated with inefficient PKA signaling in the neonatal mice since it fails to respond to terbutaline stimulations compared to control. / Des études antérieures suggèrent que la principale cause de décès chez les patients atteints de la maladie des peroxysomes, chondrodysplasie ponctuée rhizomélique (RCDP), peut être due à un dysfonctionnement pulmonaire. Dans notre laboratoire, nous avons évalué le modèle de souris RCDP équivalent, la souris PEX7 hypomorphic, et j'ai trouvé qu'il montre la morphologie anormale des poumons, qui coïncide avec la cause du décès. Cependant, la physiopathologie de ce dysfonctionnement pulmonaire reste encore inconnue.RCDP est une maladie autosomique récessive qui implique PEX7 mutations du gène. Le gène code pour une protéine PEX7 transporteur qui est essentiel pour la synthèse plasmalogène, et plasmalogènes à son tour, peut jouer un rôle essentiel dans la sécrétion de protéines du surfactant et des lipides dans les cellules pulmonaires spécialisés ex. alvéolaires de type II (ATII) cellules. Nous émettons l'hypothèse que le modèle de souris hypomorphic Pex7 va sécréter des quantités nettement différents de protéines du surfactant par rapport au type sauvage. Pour tester cette hypothèse, nous avons stimulé la sécrétion cellulaire ATII sous trois heures de traitements en utilisant trois médicaments: la terbutaline, ionomycine et TPA (tétra-12-O-tétradécanoylphorbol 13-acétate). Ces stimuler les PKA-dépendantes, des voies CaMK-charge et de la PKC-dépendante, respectivement, de la sécrétion de protéine tensioactif. La sécrétion de la protéine B du surfactant a été quantifiée par un dosage immuno-empreinte.Nos résultats montrent que la réponse des cellules Atii à ces médicaments peut être souche-dépendante et âge-dépendante. Cellules adultes ATII de type sauvage C57BL6 (fond pur) a répondu à la terbutaline stimulation avec la sécrétion de surfactant B accru en protéines, tandis que les cellules de Atii sauvage adulte de type C57Bl6/129 (origine mixte) n'a pas fait. En outre, les cellules de type sauvage Atii néonatale C57Bl6/129 ne peut répondre à la terbutaline stimulation à dix fois la concentration utilisée sur des cellules adultes ATII.Enfin, les cellules ATII des Pex7 souris déficientes (C57Bl6/129) n'ont pas répondu à la terbutaline la stimulation des deux souriceaux nouveau-nés et les adultes. Nous concluons que carence en plasmalogène dans le modèle Pex7 hypomorphic (C57Bl6/129) peut être associé à inefficaces PKA de signalisation dans les souriceaux nouveau-nés, car il ne parvient pas à répondre à des stimulations terbutaline par rapport à contrôler.

The orphan nuclear receptor NR5A2 is implicated in a multitude of biological processes including cholesterol homeostasis and development. Its role in cholesterol metabolism and cell proliferation is now well established in vitro and in vivo. Both in vitro and gene expression studies have suggested a role for NR5A2 in ovarian function. In this study, we provide in vivo evidence for its involvement in reproductive function by demonstrating that heterozygosity for a null mutation of NR5A2 leads to a reduction in female fertility. Furthermore, we showed that NR5A2+/- females display a severe reduction in ovarian progesterone production and that progesterone supplementation can rescue the NR5A2+/- subfertility phenotype. We also provide evidence that one of the mechanisms by which NR5A2 regulates ovarian progesterone production is through modulating the expression of SCAR, which controls one of the rate-limiting steps of progesterone synthesis. / A targeted disruption of the NR5A2 gene in the mouse leads to early lethality in utero between embryonic days 6.0 and 7.5, showing that NR5A2 plays a crucial role during early embryogenesis. The molecular mechanisms underlying this early lethality, however, are poorly understood. In this study, we used a morphological and marker gene analysis to characterize the NR5A2-/- embryonic phenotype and showed that although initial axis specification occurs in NR5A2-/- embryos, primitive streak and mesoderm fail to form. Using a chimeric approach, we demonstrated a requirement for NR5A2 function in the visceral endoderm (VE), an extra-embryonic tissue, for proper primitive streak morphogenesis and gastrulation. Our results also indicate a reduction in the expression of VE marker genes involved in the nutritive function of this tissue, suggesting that NR5A2 play a dual role in the VE, being implicated in the mediation of both its patterning and nutritive activity. / Taking advantage of the LacZ knock-in approach used to inactivate the NR5A2 gene, we also demonstrated that NR5A2 is expressed during craniofacial and nervous system development, suggesting a novel role for NR5A2 in head formation and neural development.

The development of the nematode C. elegans is invariant allowing investigators to use genetic analysis in this model system to identify components of many critical developmental pathways. The Roy laboratory uses this strategy to identify genes that control cell division throughout the course of development. My work focusses on the intestinal lineage due to their typical cell division pattern. Using genetic analysis, I have characterized the role of genes that affect the transition from mitosis to karyokinesis and finally endoreplication that occurs in the intestinal cells post-embryonically during the first larval stage. Five mutants that were isolated are grouped into classes that have more (rr33 and rr45) or less (rr42, rr43 and rr44) intestinal nuclei than wild-type. I cloned both mutants with more intestinal nuclei (rr33 and rr45) to show that they encode lin-35, the homologue of the Retinoblastoma gene and a highly conserved gene referred to as nol-10 respectively. I showed that lin-35 interacts with RNAi pathway components to properly repress genes required for this transition. I also found that met-2, the homologue of the Suv39h methyl transferase as well as the heterochromatin protein-like hpl-1 and hpl-2 are required to maintain the repression of these loci. Moreover, during my characterization of the typical cell cycle arrest observed during the dauer stage, I found that the Notch ligand lag-2 is specifically expressed in 6 Inter Labial neurons 2 (IL2) at the onset and throughout the dauer stage. I demonstrated that this expression pattern reflects the requirement of the canonical Notch pathway to properly maintain the dauer stage and specific expression of the Notch receptor glp-1 in a subset of neurons is able to rescue the defect in dauer maintenance in glp-1 mutants. Therefore, the Notch pathway is not required for neuronal cell fate specification since there is no cell division at this stage but rather serves a novel function that may in / Puisque son développement ne varie pas, le nématode C. elegans est un organisme pouvant servir de modèle génétique pour identifier des gènes requis dans bon nombre de processus. De ce fait, le laboratoire du Dr Roy utilise cet organisme pour identifier des gènes qui régulent la division cellulaire durant son développement. L'isolement de 5 mutants, qui influencent la division cellulaire de l'intestin, m'a permis de caractériser le rôle de ces gènes dans la transition de la mitose vers la karyokinèse, puis vers l'endoréplication. Cette transition est spécifique aux cellules intestinales à la fin du premier stade larvaire du développement post-embryonnaire. Ces cinq mutants ont été groupés soit dans la classe de mutants avec plus de noyaux intestinaux que la souche sauvage (rr33 et rr45), soit dans celle en contenant moins (rr42, rr43 et rr44). Le clonage des mutants contenant plus de noyaux intestinaux m'a permis d'observer l'influence de la mutation rr33 sur le gène lin-35, l'homologue du gène du rétinoblastome chez l'humain, et de rr45 sur le gène nol-10. Je démontre que lin-35 interagit avec les composantes de la voie RNAi afin de permettre la répression des gènes requis pour la transition du cycle cellulaire des cellules intestinales. Mes résultats permettent également d'observer le rôle de met-2, un homologue de la méthyltransférase Suv39h et de deux protéines hétérochromatiques hpl-1 et hpl-2, dans le maintien de cette répression. De plus, j'ai pu constater que, durant ma caractérisation de l'arrêt du cycle cellulaire propre au stade dauer, le ligand Notch lag-2 est spécifiquement exprimé au début et durant tout ce stade dans 6 neurones Inter Labial 2 (IL2). J'ai pu démontrer que l'expression de ce ligand correspond au besoin de la voie de signalement canonique Notch pour maintenir ce stade de développement et aussi que l'expression du récepteur Notch glp-1 dans les neurones empêche le défaut de maintien$