Claudins are integral components of the tight junction, and contribute to cellular roles in paracellular permeability, maintenance of cell polarity, and adhesion in epithelial and endothelial cell layers. As such, they are critically positioned to influence many behaviours that occur during morphogenesis of the developing embryo. However, little is known about claudin expression and function during development. The primary objective of this thesis was to determine the expression pattern of claudins during chick development and evaluate their roles during patterning and morphogenesis of the embryo.Over 24 distinct claudin family members have been identified in vertebrates. In the chick, 17 claudins have been annotated to date. To evaluate their expression patterns, claudins cDNAs were cloned and a comprehensive analysis of their phylogenetic relationship, and temporal and spatial mRNA expression patterns were performed. Expression analysis revealed that claudin family members exhibit both overlapping and unique expression patterns throughout development Two claudins showed unique expression patterns during development: Claudin-5 and Claudin-10. Claudin-5 was the only claudin observed in endothelial cells. Claudin-5 expression was observed in the forming blood islands in the extraembryonic area opaca, and in the embryonic vasculature between HH8 and HH35. Expression of Claudin-5 was found during both organ vasculogenesis and during angiogenic processes that vascularize tissues such as the brain and limb. During gastrulation, Claudin-10 expression was observed only on the right side of Hensen's node, a major organizing centre important in left-right axis patterning. Asymmetric organ morphogenesis is critical for normal physiology and positioning of organs within the limited space of the body cavity. The patterning events that direct asymmetric morphogenesis are initiated at Hensen's node during gastrulation, and activate a cascade of asymmetric gene expression that lateralizes the left and right sides of the body. Asymmetric expression of Claudin-10 on the right side of Hensen's node is required for normal left-right patterning. Misexpression of Claudin-10 on the left side of Hensen's node, or knockdown of endogenous Claudin-10, disrupts the expression of asymmetrically expressed genes in the left-right patterning cascade and randomizes the direction of heart tube looping, the first morphological asymmetry that arises during development. Several Claudin-10 mutant variants were evaluated for their ability to randomize the direction of heart tube looping using site-directed mutagenesis. These data suggest that Claudin-10 may function in left-right patterning by acting as a paracellular barrier to a laterality cue, or through interactions via the cytoplasmic tail with proteins localized at the cytoplasmic plaque. This thesis describes the expression patterns of claudins during development in the chick and identifies a novel role for Claudin-10 in patterning the left-right axis. These observations suggest that overlapping zones of claudin expression may confer distinct domains of ion permeability within the early epiblast and in epithelial, mesodermal, and endothelial derivatives that may ultimately influence embryonic patterning and morphogenesis. Claudin-10 is required for the transmission of a laterality signal during early phases of the left-right cascade, indicating that the role of Claudin-10 is important during early events that take place upstream of asymmetric morphogenesis. Furthermore, the function of Claudin-10 in left-right patterning provides additional evidence that claudins have roles in morphogenesis. / Les claudins sont des composantes intégrales des jonctions serrées et elles contribuent à la perméabilité paracellulaire, à la maintenance de la polarité cellulaire ainsi qu'à l'adhésion des couches de cellules épithéliales et endothéliales. Elles ont des comportements qui sont influencés par leur localisation cellulaire lors de la morphogénèse de l'embryon. Cependant, nous avons très peu de connaissances au sujet de l'expression et de la fonction des claudins durant le développement. L'objectif de cette thèse est de déterminer le patron d'expression des claudins lors du développement chez le poulet ainsi que d'évaluer leur rôle durant la modélisation et la morphogénèse de l'embryon.Chez le poulet, 17 claudins ont été annotées au génome jusqu'à ce jour. Afin d'évaluer leur patron d'expression, les claudins ont été clonées et une analyse complète de leurs relations phylogénétiques ainsi que de l'expression spatiotemporelle de leurs ARN messager ont été effectuées. L'analyse de leurs patrons d'expression nous révèle que les membres de la famille des claudins présentent des patrons d'expressions qui se chevauchent ainsi que des patrons d'expression qui sont uniques durant le développement.Deux claudins ont présentées un patron d'expression unique durant le développement : Claudin-5 et Claudin-10. Claudin-5 a été la seule claudin observée dans les cellules endothéliales. L'expression de Claudin-5 a été observée dans le système vasculaire de l'embryon entre HH8 et HH35. Lors de la gastrulation, Claudin-10 est exprimée seulement sur le côté droit du nœud de Hensen, un centre d'organisation majeur important pour la formation de l'axe gauche-droit.La morphogénèse asymétrique des organes est un évènement critique nécessaire à la physiologie et au positionnement normal des organes dans l'espace restreint de la cavité de l'abdomen. Les évènements qui dirigent la modélisation de la morphologie asymétrique qui sont initiés au nœud de Hensen lors de la gastrulation activent une cascade d'expression asymétrique d'expression de gènes qui latéralisent le côté gauche et droit du corps. L'expression asymétrique de Claudin-10 du côté droit du nœud de Hensen est essentielle pour la modélisation de l'axe gauche-droit. L'expression erronée de Claudin-10 du côté gauche du nœud de Hensen ou l'inactivation endogène de Claudin-10 perturbe l'expression des gènes exprimés asymétriquement dans la cascade de modélisation gauche-droite ainsi que perturbe aléatoirement la direction de la boucle du cœur. Afin de comprendre quels aspects de la jonction serrée de Claudin-10, plusieurs mutants de Claudin-10 ont été évalués afin de savoir s'ils avaient l'habileté de diriger la boucle du cœur aléatoirement. Ces résultats suggèrent que le rôle de Claudin-10 lors de la modélisation de la cascade gauche-droite pourrait d'être une barrière paracellulaire suite à un signal de latéralité ou à travers les interactions de la queue cytoplasmique avec des protéines localisées dans la plaque cytoplasmique. Cette thèse décrit les patrons d'expression des claudins durant le développement chez le poulet ainsi qu'un nouveau rôle pour Claudin-10 dans l'axe de modélisation gauche-droite. Ces observations suggèrent que les zones d'expression des claudins qui se chevauchent peuvent conférer des domaines de perméabilisation distincts aux ions dans l'épiblaste, et dans les dérivés épithéliaux, mésodermaux, et endothéliaux qui peuvent ultimement influencer la modélisation embryonique et la morphogenèse. Claudin-10 est essentielle afin de transmettre un signal de latéralité dès le début de la cascade gauche-droite indiquant que le rôle de Claudin-10 est important durant les premiers évènements qui tiennent place avant la morphogenèse asymétrique. De plus, le rôle de Claudin-10 lors de la modélisation gauche-droite nous fourni des informations additionnelles qui impliquent un rôle pour les claudins durant la morphogenèse.

The retinoblastoma tumour suppressor, Rb, is a cell cycle regulator that acts to prevent the progression from G1 to S-phase. Rb regulates this transition by inhibiting E2F family transcription factors which control the expression of genes required for the G1 –S phase progression. Consequently, mutations in rbf1, the Drosophila homologue of the Rb tumour suppressor gene, generate defects in cell cycle control. In an effort to identify genes regulated by the EGFR/ras pathway that co-operate with mutations of rbf1 we singled out a gene called Capicua, an HMG box transcription factor that regulates growth in Drosophila. In Drosophila eye imaginal discs cic mutations co-operate with rbf1 to reduce levels of cell death and increase ectopic S-phase entry. The goal of this thesis was to characterize the co-operative effect of rbf1 and cic, and to determine whether this synergy proves to be conserved in the mammalian system. In clones of cells mutant for cic in either an rbf1 hypomorphic background or a wild-type background we observed decreased levels of reactive oxygen species (ROS), which suggests that cic is required for ROS homeostasis. Furthermore, by modulating levels of ROS scavenger enzymes, such as superoxide dismutase 2 (SOD2), we found that we could modulate the characteristic cell death phenotype observed in rbf1 mutant eye discs. Thus, we propose that changes in ROS levels through cic mutations might contribute to their pro-survival effect. Through further analysis of rbf1 eye discs carrying cic mutations we discovered that levels of cyclin E are increased. This result suggests that the ability of rbf1 and cic to promote G1 arrest may be mediated by limiting cyclin E expression. To address whether CIC mutation affects proliferation and survival in the mammalian system, an shRNA construct was used to knockdown CIC protein levels in triple knockout mouse embryonic fibroblasts (TKO MEFS), which are knockout for all three Rb family proteins. Comparison of CIC knockdown cell lines to controls via western blotting for PARP and C3, as well as flow cytometric analysis, revealed that CIC knockdown suppresses the cell death phenotype of TKO MEFs. Moreover, 2D cell cycle analysis by co-staining with BrdU and PI revealed that CIC knockdown cell lines have an elevated percentage of cells in S phase of the cell cycle. The results from these knockdown cell lines suggest that the ability of CIC to affect cell death and cell cycle control of RB-deficient cells is conserved in mammals. / Le suppresseur de tumeurs Rétinoblastome, Rb, est un régulateur du cycle cellulaire qui empêche la transition par G1 à la phase-S. Rb régule ce passage par inhiber les facteurs de transcription E2F qui contrôlent l'expression des gènes requis pour le passage de la phase G1 à la phase S. Par conséquent, les mutations en rbf1, l'homologue du suppresseur de tumeur Rb dans les Drosophiles, créent des défauts dans le cycle cellulaire. En un effort d'identifier les gènes réguler par la cascade EGFR/ras qui coopèrent avec les mutations en rbf1, nous avons distingué un gène nommé Capicua, un facteur de transcription que régule la croissance en Drosophile. Dans les disques imaginaux des yeux des Drosophiles les mutations cic coopèrent avec rbf1 pour réduire les niveaux de mort cellulaire et pour augmenter l'entrée en phase ectopique S. Le but de ma thèse était de caractériser l'éffet coopératif de rbf1 et cic et aussi de déterminer si la relation de synergie est conservée au système mammalien. Dans les clones de cellules mutants pour cic au profil où rbf1 est déficient et dans le profil de type sauvage nous avons observé une réduction des dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) qui suggère que cic est requis pour la homéostasie de DRO. De plus, en modulant les niveaux des enzymes de fixateur de DRO comme superoxide dismutase 2 (SOD2), nous avons trouvé que nous avons été capable de moduler le phénotype de mort cellulaire observé aux disques des yeux où rbf1 est muté. Par conséquent nous proposons que les changements aux niveaux de DRO provoqué par les mutations de cic peuvent contribuer à l'effet contre la mort cellulaire. Par plus loin analyser des disques imaginaux des yeux rbf1 avec les mutations de cic nous avons découvert que les niveaux de cyclin E sont augmentés. Ce résultat suggère que la capacité de rbf1 et cic d'encourager l'arrêt du cycle cellulaire G1 est peut-être parce que ces facteurs contrôlent l'expression de cyclin E. Pour nous nous intéressons si la mutation de cic a un effet sur la survie où la prolifération des cellules au système mammalien j'ai utilisé un shRDA pour baisser les niveaux de la protèine dans les fibroblastes de souris embryonnaires triple knockout (TKO MEFs), qui sont knockout pour les trois protèines de la famille Rb. Nous avons comparé les lignées cellulaires CIC knockdown aux contrôles par immunotransfert pour PARP et C3 ainsi que la cytométrie de flux ont révélé que le knockdown de CIC régule negativement la phenotype de TKO MEFs. De plus, l'analyse bidimensionelle du cycle cellulaire par co-tache avec BrdU et PI a révélé que les lignées cellulaires avec knockdown de CIC a un pourcentage élevé de cellules en phase-S de la cycle cellulaire. Les résultats de ces lignées cellulaires knockdown suggèrent que l'effet de CIC sur la mort cellulaire et la contrôle du cycle cellulaire des cellules deficientes en RB est conservé aux mammifières.

Ovarian cancer (OC) constitutes the most lethal gynaecological cancer in Canada. In the French Canadian (FC) population of Quebec, common founders have contributed to the emergence of recurrent mutations in the breast and OC susceptibility gene, BRCA2, with mutations conferring a significantly increased risk for OC. In 1999, our group reported that four recurrent BRCA2 mutations accounted for 3% of FC OC patients not selected for family history of disease. However, due to subsequent expansion of the known FC founder mutation spectrum and increased insight into OC histopathology, the present study hypothesized that the 3% carrier frequency was an underestimate. This thesis had two objectives: i) to assess whether mutations recurring among FC hereditary breast and OC families also recurred among unselected FC OC cases, by assaying for the three most common FC BRCA2 mutations in a cohort of 568 OC cases of specific histotype (Group 1); and ii) to gain an updated estimate of the BRCA2 mutation carrier frequency, by assaying for an expanded panel of eight FC BRCA2 mutations in a clinically defined cohort of 121 OC cases of specific histotype (Group 2). PCR-based assays were used to detect the 8765delAG, G6085T, and 3398delAGAAA BRCA2 founder mutations in Group 1, while a tailored multiplex microscopic bead-array based technology, known as the Luminex platform, allowed for detection of eight FC BRCA2 variants (8765delAG, G6085T, 3398del5, 2816insA, 3034del4, 3773delTT, 6503delTT, and E3002K) in Group 2. Resulting mutation carrier frequencies were statistically compared with those reported by two previous studies on Montreal-based FC OC cases. Results suggest that common and less common FC BRCA2 founder mutations recur in unselected FC OC cases, and that the original carrier frequency estimate was an underestimate, as the eight assayed FC BRCA2 mutations accounted for 5.2% of unselected FC OC cases. Importantly, the three most common founder mutations accounted for just 50% of Group 2 mutation carriers, suggesting that there is greater genetic heterogeneity among FC OC patients than originally perceived. These results advocate for BRCA2 genetic testing of all FC OC patients, to allow them and their family members to benefit from tailored management and prevention strategies informed by their genetic information. / Le cancer de l'ovaire (CO) est le cancer gynécologique le plus mortel au Canada. Dans la population Canadienne-Française (CF) du Québec, les fondateurs ont contribué à l'émergence de mutations récurrentes dans le gène de susceptibilité des cancers du sein et de l'ovaire, BRCA2, dont parmi elles, des mutations qui confèrent une augmentation significative du risque de développer un CO. En 1999, notre groupe a montré que quatre mutations récurrentes dans BRCA2 comptaient pour 3% des CO chez les patients CF non-sélectionnés sur une base historique de cancer familial. Néanmoins, due à l'expansion subséquente du spectre des mutations CF fondatrices connues et à la meilleure compréhension de l'histopathologie du CO, l'hypothèse de la présente étude est que la fréquence des mutations, initialement évaluée à 3%, est une sous-estimation. Cette thèse a donc deux objectifs : 1) évaluer si les mutations récurrentes chez les familles CF, ayant une base historique de cancer du sein et de l'ovaire familial, le sont aussi dans les cas de CO des patients CF non-sélectionnés, en testant une cohorte de 568 cas d'un histotype spécifique (groupe 1) pour les trois mutations BRCA2 les plus fréquentes dans la population CF; et 2) générer une nouvelle estimation de la fréquence des mutations dans BRCA2 chez les patients CF avec CO, en testant un panel élargi de huit mutations CF de BRCA2 dans une cohorte cliniquement bien définie de 121 cas de CO d'un histotype spécifique (groupe 2). Des tests PCR ont étaient utilisés pour détecter dans le groupe 1 les mutations fondatrices 8765delAG, G6085T, and 3398delAGAAA de BRCA2, alors que la technologie des puces à billes microscopiques d'analyse multiplexe, connue comme la plateforme Luminex, a permis la détection de huit variants de séquences CF de BRCA2 dans le groupe 2 (8765delAG, G6085T, 3398del5, 2816insA, 3034del4, 3773delTT, 6503delTT, and E3002K). Les fréquences des mutations résultantes ont été statistiquement comparées avec celles générées par deux études précédentes sur des cas de CO dans la population CF de Montréal. Les résultats suggèrent que les mutations BRCA2 fondatrices se retrouvent dans les cas de CO non-sélectionnés, et que la fréquence des mutations fut sous-estimée à l'origine, puisque les huit mutations BRCA2 testées comptent pour 5.2% des cas de CO dans la population CF non-sélectionnée. De manière intéressante, les trois plus fréquentes mutations fondatrices comptent uniquement pour 50% des mutations du groupe 2, ce qui suggère une plus grande hétérogénéité génétique qu'initialement perçue. Ces résultats encouragent le test génétique de BRCA2 pour tous les patients CF diagnostiqués avec un CO, ainsi qu'aux membres de leur famille, pour leur permettre de bénéficier de stratégies sur mesure de gestion et de prévention fondées sur leurs informations génétiques.

Abstract:The 90-kb androgen receptor (AR) gene is located at locus Xq11-12 and has eight exons that encode a protein of about 919 amino acids. Exon 1 encodes the transactivational domain, exons 2 and 3 encode the DNA-binding domain, and exons 4 through 8 encode the ligand-binding domain. The AR protein, a nuclear receptor that belongs to the steroid/thyroid hormone receptor family, functions primarily as a DNA-binding transcription factor to regulate gene expression. The AR also has a role in the development of the male phenotype: in fact, cytoplasmic AR is activated by binding testosterone or dihydrotestosterone hormone before translocating to the nucleus. Spinal and Bulbar Muscular Atrophy (SBMA), also known as Kennedy's disease, is an X-linked recessive neurodegenerative disease. The cause of SBMA is expansion of the CAG trinucleotide repeat, which codes for glutamine (Gln, Q), in Exon 1 of the AR gene. Therefore SBMA is considered to be a polyglutamine (polyGln) expansion disorder. In unaffected men, 9-33 CAG repeats coding for Gln are found, while males who inherit more than 37 CAG repeats will develop SBMA. The toxic gain of AR function that is characteristic of SBMA results in a slow progressive muscle weakness, atrophy of the tongue, fasciculations of bulbar, facial and limb muscles, and muscle cramping. A loss of AR function is related to breast enlargement and reduced fertility.The ubiquitin-proteasome system (UPS), which functions in protein degradation, plays an important role in neural cells from SBMA patients. UPS components are found in polyGln-expanded protein aggregates seen in these cells. Therefore previous studies have suggested that the UPS is impaired in SBMA. Previous work suggests that 0QAR and 20QAR can be degraded via the UPS, however, the 50QAR appeared to inhibit the degradation of specific proteins by the UPS. It is also hypothesized that these SBMA-inducing mutant ARs can accumulate in the cell and cause disease by evading UPS degradation. The primary goal of this research was to develop a system for ubiquitinating AR by using an expressed protein ligation (EPL) system. To prove this hypothesis, several intermediate goals have been achieved. PCR-amplified fragments of AR (0Q, 20Q, and 50Q) were cloned into the pTWIN2 vector and contructs were analyzed using restriction enzyme digests and gel electrophoresis. Furthermore, 0QAR, 20QAR, 50QAR and human ubiquitin (HUB) fusion proteins were purified using chitin beads and cleaved using 2-mercapto-ethanesulfonic acid (MESNA). Finally, the 0QAR, 20QAR, 50QAR peptides were ligated with an HA-tagged H2B peptide using EPL. Thus, we successfully developed tools which can be used to explore ubiquitinatination of the AR using EPL systems in vitro. Future work aims to ligate the HUB protein to a peptide to using the EPL method, and then ligating the ubiquitinated peptide to the three different AR peptides. These will be added to active proteasomes to explore the involvement of the UPS in the pathogenesis of SBMA. / Abrégé:Le gène de 90-kb du récepteur androgène (AR) est localisé au locus Xq11-12 et possède huit exons codant pour une protéine d'environ 919 acides aminés. L'exon 1 code pour le domaine transactivationnel, les exons 2 et 3 codent pour le domaine de liaison à l'ADN, et les exons 4 à 8 codent pour le domaine de liaison au ligand. La protéine du AR, un récepteur nucléaire appartenant à la famille des récepteurs hormonaux stéroïdiens/thyroïdiens, agit primordialement en tant que facteur transcriptionnel se liant à l'ADN pour réguler l'expression génique. Le AR possède également un rôle dans le développement du phénotype masculin: en effet, le AR cytoplasmique est activé en se liant aux hormones testostérone ou dihydrotestostérone avant de se translocaliser au noyau.L'amyotrophie bulbo-spinale (SBMA-Spinal and Bulbar Muscular Atrophy), aussi connue sous le nom de maladie de Kennedy, est une maladie neurodégénérative liée au chromosome X récessif. La cause de la SBMA est une expansion du triplet CAG répété, lequel code pour une glutamine (Gln,Q), dans l'exon 1 du gène AR. Ainsi, la SBMA est considérée comme étant un désordre d'expansion polyglutaminique (poly-Gln). Chez l'homme non-affecté, on retrouve 9-33 répétitions CAG codant pour la Gln, alors que l'homme qui hérite plus de 37 répétitions CAG développera la SBMA. Le gain de fonction toxique du AR caractérisant la SBMA se traduit par: une faiblesse musculaire à progression lente, une atrophie de la langue, des fasciculations des muscles bulbaires, faciaux et limbiques et enfin par des crampes musculaires. Une perte de fonction du AR est liée à l'élargissement de la poitrine et à la fertilité réduite.Le système ubiquitine-protéasome (UPS), responsable dans la dégradation protéique, joue un rôle important dans les cellules neurales chez les patients atteints de la SBMA. Les composantes de l'UPS se trouvent dans les aggrégats protéiques de l'expansion poly-Gln dans ces cellules. C'est la raison pour laquelle des études précédentes ont suggéré que l'UPS est affaibli dans la SBMA. D'autres études antérieures suggèrent que les peptides 0QAR et 20QAR peuvent être dégradés par l'UPS, cependant le peptide 50QAR semble inhiber la dégradation par lUPS de certaines protéines spécifiques. L'hypothèse veut que ces mutants AR responsables de la SBMA peuvent s'accumuler dans la cellule et causer la maladie en s'évadant de la dégradation UPS. Le but premier de ce projet était de développer un système d'ubiquitination du AR en appliquant le système de ligation des protéines exprimées (expressed protein ligation-EPL). Afin de prouver cette hypothèse, quelques buts intermédiaires ont été atteints. Les fragments du AR (0Q, 20Q, et 50Q), amplifiés par PCR, ont été clonés dans le vecteur pTWIN2 et les clones ont été analysés sur gels d'électrophorèse suite aux digestions par enzymes de restriction. De plus, les fragments 0QAR, 20QAR et 50QAR ainsi que les protéines de fusion de l'ubiquitine humaine (HUB) ont été purifiés à l'aide de billes de chitine et clivés par l'acide mercapto-2-éthanesulfonique (MESNA).Les peptides 0QAR, 20QAR et 50QAR ont été unis par ligation au peptide de fusion H2B doté d'un tag HA en se servant du système EPL. Ainsi, nous avons développé avec succès des outils permettant d'explorer l'ubiquitination du AR en utilisant les systèmes EPL in vitro. Des expériences à l'avenir viseront à lier par ligation la protéine HUB à un peptide, en utilisant la méthode EPL et ensuite faire la ligation du peptide ubiquitiné aux trois différents peptides AR. Ces derniers seront ajoutés aux protéasomes actifs pour explorer l'implication de l'UPS dans la pathogénèse de la SBMA.

Chronic rhinosinusitis (CRS) is a common inflammatory condition of the sinonasal mucosa from its interaction with bacteria and/or fungi. The toll-like receptor (TLR) family plays an important role in innate immunity by recognizing distinct pathogen-associated molecular patterns. We evaluated single nucleotide polymorphisms (SNPs) in candidate genes from the TLR signaling pathway in 206 individuals with severe CRS and 200 controls. We also investigated the association between these SNPs and total serum IgE level. A total of 96 out of 104 SNPs were successfully genotyped. Although we could not confirm an association with CRS, 3 SNPs in the IRAK4 gene – rs1461567, rs4251513, and rs4251559 – were found to be associated with total serum IgE levels (p < 0.004). The finding was replicated in a second independent population with asthma, from the Saguenay-Lac-Saint-Jean region (p < 0.031). These results demonstrate a clear association between SNPs in the IRAK4 gene and serum IgE levels in patients with CRS and asthma. / La rhinosinusite chronique (RSC) est une maladie fréquente qui cause l'inflammation des sinus. Les récepteurs Toll-like (TLR) sont importants dans l'immunité innée, répondant aux microorganismes. Nous avons évalué les polymorphismes ponctuels de séquence (SNPs) dans les gènes codant les voies de signalisation TLR chez 206 patients atteints de RSC sévère et 200 témoins. Nous avons aussi investigué l'association entre ces SNPs et le niveau d'IgE sanguin. En tout, 96 sur 104 SNPs ont été génotypés avec succès. Bien que nous ne pouvions pas confirmer l'association avec la RSC, 3 SNPs dans le gène IRAK4 – rs1461567, rs4251513, and rs4251559 – étaient associés a un niveau d'IgE sanguin élevé (p < 0.004). Le résultat a été répliqué dans une seconde population indépendante d'individus souffrant d'asthme provenant du Saguenay-Lac-Saint-Jean (p < 0.031). Ces résultats suggèrent qu'une modification génétique dans le gène IRAK4 prédispose à un niveau élevé d'IgE dans les maladies respiratoires.

Myelin is elaborated in the Central Nervous System (CNS) by oligodendrocytes and is essential for rapid action potential conduction. During embryogenesis and early postnatal stages of CNS development, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) proliferate and migrate in response to platelet derived growth factor-A (PDGF-A), the ligand for PDGFRa. This study describes the identification of regulatory elements and potential corresponding transcription factors controlling PDGFRa expression in OPCs, which will contribute to a better understanding of oligodendroglial lineage specification including OPC proliferation, migration and final maturation. Based on previous studies, the enhancer(s) driving expression in oligodendrocytes was only known to be located somewhere within a 380kb yeast artificial chromosome (YAC). To refine the search, a transgenic mouse line containing a bacterial artificial chromosome (BAC), containing a lacZ reporter gene, was generated. The lacZ reporter gene was inserted into the BAC, using a recombineering strategy. This line contains an 87kb BAC (CTD-2243G22) that starts –16kb upstream of the transcription start site, and ends +2kb downstream of the 3'UTR. It demonstrates robust lacZ expression in brain regions where OPCs originate. Based on interspecies sequence comparison and the presence of relevant transcription factor binding sites, such as for Sox and oligs, four candidate non-protein coding modules were identified within the 87kb defined by the BAC. These modules are being evaluated for in vivo function in the context of lacZ reporter genes docked at the hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) locus. One of these constructs, which contains 600bp of intron 21 of the PDGFRa gene, shows a similar pattern of expression to the BAC, suggesting that the sequence containing the OPC enhancer may have been captured out of a 380kb region. Deletions have been made in this 600bp, to discover which eleme / La myéline est élaborée dans le système nerveux central (CNS) par les oligodendrocytes et elle est essentielle pour la conduction rapide du potentiel d'action. Pendant l'embryogénèse et les premières étapes du développement postnatal du CNS, les progéniteurs d'oligodendrocytes (OPCs) prolifèrent et émigrent en réponse au Platelet derived growth factor-A (PDGF-A), le ligand pour PDGFRa. Cette étude décrit l'identification des éléments régulateurs et les facteurs de transcription qui contrôlent l'expression de PDGFRa dans les OPCs, ce qui contribuera à faciliter la compréhension de la spécification du lignage des oligodendrocytes, ainsi que de la prolifération, la migration et la maturation finale des OPCs. Basé sur des études précédentes, nous savons que l'élément enhancer responsable de l'expression dans les oligodendrocytes est situé quelque part à l'intérieur d'un chromosome de levure artificiel (YAC) de 380 kb. Afin de peaufiner la recherche, une lignée transgénique de souris contenant un chromosome bactérien artificiel (BAC) et un gène rapporteur lacZ a été générée. Le gène rapporteur lacZ a été inséré dans le BAC en utilisant une stratégie de recombineering. Cette lignée contient un BAC de 87 kb (CTD-2243G22) qui commence -16 kb en amont du site d'initiation de la transcription, et finit +2 kb en aval des séquences non-traduites en 3' (3'-UTR). Elle démontre une expression robuste de lacZ dans les régions du cerveau où les OPCs ont leur origine. Basé sur la comparaison génomique entre espèces et la présence de sites de liaison de facteurs de transcription pertinents, tel que Sox et olig, quatre modules non codants candidats ont été identifiés à l'intérieur des 87 kb définits par le BAC. Ceux-ci ont été ou seront évalués pour leur fonction in vivo dans le contexte du gène rapporteur lacZ arrimé au locus d'hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT).$

Leprosy, a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae, is the leading cause of non-traumatic neuropathies in the world. Although a genetic component for leprosy susceptibility has been demonstrated by several studies, the exact nature and extent of this component is still unknown. Here, we applied linkage and association analysis in a combined candidate region and genome-wide approach to further investigate the nature of host genetic factors controlling leprosy susceptibility. First, we used 20 Vietnamese multiplex leprosy families to perform linkage analysis on selected genomic candidate regions harbouring genes previously known to be either linked or associated with leprosy phenotypes. We found significant evidence for linkage between markers of the TNFA gene located on chromosomal region 6p21 and clinical subtype of the disease (P = 0.00021). Next, we performed a genome-wide scan in a sample of 86 Vietnamese multiplex leprosy families. We identified a new leprosy "per se" susceptibility locus on chromosome 6q25--q27 (LOD = 4.31, P = 5 x 10-6). Linkage results were reproduced by family-based association analysis in an independent sample of 208 Vietnamese simplex leprosy pedigrees (P = 5.9 x 10 -5). A linkage homogeneity test confirmed chromosomal region 10p13 as modifier for paucibacillary leprosy in the Vietnamese population. Finally, we applied SNP-based association analysis to construct a high density linkage disequilibrium (LD) map of chromosome 6q25--q27. We identified genetic polymorphisms clustered in a 80 Kb LD block overlapping the 5-prime regulatory region shared by two genes, Parkinson's disease susceptibility gene PARK2 and PACRG, as risk factors for leprosy "per se" in the Vietnamese population (OR = 3.15--5.72). All associated SNPs can be distributed in three frequency haplotypes, with two SNPs capturing all the association information between the PARK2/PACRG 5-prime regulatory region and leprosy in the Viet

The worldwide rates of asthma have been increasing in the past twenty years, coinciding with a decreasing prevalence of tuberculosis in the major asthma endemic regions. The hygiene hypothesis proposes that in countries with better hygiene, reduced exposure to pathogens is responsible for the rising prevalence of allergic diseases. Mycobacterium tuberculosis , the cause of tuberculosis (TB), is thought to be a critical effector of the hygiene hypothesis since it can skew the immune system away from developing into an atopy associated immune profile. Hence, absence of exposure to M. tuberculosis might remove suppression of asthma development. / Based on the hygiene hypothesis, we reasoned that genetic factors that predispose to TB should be protective for asthma/atopy and vice versa. Consequently, we tested genetic variants for (1) asthma risk based on known genetic effects in TB susceptibility, and (2) TB risk based on known genetic effects in asthma susceptibility. To identify genetic variants for asthma risk, we tested for nonrandom transmission of genetic variants of the Vitamin D Receptor (VDR) and the Natural Resistance Macrophage Protein 1 (NRAMP1) genes, two known TB susceptibility genes, in an asthma family-based cohort of French Canadian. To identify genetic variants for TB risk, we tested for distribution differences of genetic variants of several asthma associated genes: interleukin 4 (IL-4), IL-4 Receptor A (IL4RA), tumour necrosis factor A (TNFA ), lymphotoxin A (LTA) and VDR in TB cases and non-TB controls recruited in Mexico. Only VDR variants showed a risk modulating effect and where analyzed in more detail in the present thesis. / In a North-Eastern Quebec asthma family-based cohort, of the 12 VDR variants tested 6 genetic variants located between intron 2 and 3' UTR we found to be strongly associated with asthma (0.0005 < p < 0.01) under an additive model. Haplotype specific genetic effects were also observed for asthma (0.0004 < p < 0.01). By contrast, no variants of the NRAMP1 gene were observed to be associated with asthma in this French Canadian asthma cohort. In the final set of experiments, I tested asthma associated genes for their impact on risk of TB disease. In a Mexican case-control study, 14 VDR variants tested, we observed 2 genetic variants at the 5' end of the gene to be associated (p < 0.05) with either susceptibility to TB, M. tuberculosis infection or disease progression. No associations were observed between genetic variants of IL4RA, TNFA and LTA, and TB or TB related phenotypes. / These findings clearly identified VDR as asthma and TB susceptibility gene. However, since the genetic variants associated with asthma differ from those associated with TB it remains unclear how these variants influence the immune system to promote asthma but not TB, and vice versa. Although TB has been proposed as a suppressing force for asthma, other than VDR, we could not detect any genetic effect of TB susceptibility genes in the asthma study, nor effects of asthma susceptibility genes in the TB study. We interpret these findings as evidence against counter-selection of asthma and TB susceptibility gene variants.

Meiosis is a specialized cell division, producing unique daughter cells containing half the chromosome number of the parental cell. In the hermaphroditic nematode C. elegans, meiotic mutants can be recognized by embryonic lethality (Emb) and high incidence of males (Him) phenotypes due to chromosome missegregation. In search of new meiotic mutants, we isolated vv33 in an EMS-based "Green eggs and Him" screen (Kelly et al. 2000; Tom Nolis, unpublished data). DAPI stainings of vv33 mutant gonads reveal unusually large nuclei and micronuclei throughout the germline. Characterization suggests that defects in cell division and chromosome segregation in mitotic germ cells are transmitted through the meiotic cell cycle, resulting in 80% Emb and 7% Him. Cloning of vv33 identified it as a novel allele of gpa-16, a Gα protein with known functions in mitosis in the early embryo (Gonczy 2002). Based on our observations, we hypothesize that there is a germline-specific requirement for GPA-16. / La méiose est une division cellulaire spécialisée qui produit des cellules filles haploides à partir de cellules parentales diploides. Chez le nématode hermaphrodite C. elegans, des anomalies de ségrégation des chromosomes lors de la méiose donnent lieu à des phénotypes de létalité embryonnaire (Emb) et d'augmentation du nombre de males (Him). Lors d'un crible génétique basé sur la recherche de nouveaux mutants him (Tom Nolis, non publié), nous avons isolé l'allèle vv33. Une analyse cytologique par coloration DAPI des gonades du mutant vv33 à révélé la présence de noyaux de tailles irrégulières. De plus, des études ont mis en évidence des défauts de ségrégation des chromosomes dans les cellules mitotiques de la lignée germinale. Les anomalies chromosomiques sont ensuite héritées par les cellules méiotiques et génèrent 80% de létalité embryonnaire. Le clonage de vv33 à permit d'identifier une mutation dans le gene gpa-16, qui code une sous-unité alpha d'une protéine G précédemment décrite pour son rôle dans la mitose embryonnaire (Gonczy 2002). Nos résultats nous permettent donc d'envisager une nouvelle fonction spécifique pour GPA-16 dans la lignée germinale.

The host response to mycobacterial infection is highly variable. A role for hostand bacterial factors in this variability is well established, although it is not knownwhether these factors act independently of each other or whether infectionoutcome results from a joint effect of host and pathogen. To address thisquestion, the present thesis concurrently examined the effect of geneticallycontrolled host and bacterial factors using a mouse model of infection. A panel ofrecombinant congenic (RC) mouse strains and their A/J and C57BL/6J inbredprogenitors were infected with virulent Mycobacterium tuberculosis or theattenuated M. bovis Bacille Calmette Guérin (BCG) Russia and Pasteur strains. Ajoint effect of host and pathogen on the course of mycobacterial infection wasobserved at both the phenotypic and genetic level. In the A/J and C57BL/6Jmouse strains, pathogen-associated factors had a major impact on biologicalphenotypes (pulmonary replication, lung histopathology) as well as mechanisticphenotypes (pulmonary transcription of Ifng, Il12b, Il4 and chemokine genes)with the host genetic background modulating the magnitude of these responses.At the genetic level, a comparative analysis of the pulmonary and splenic countsof BCG Russia and BCG Pasteur in the RC strains revealed that mycobacterialinfection is under the control of both generic and strain-specific genetic effects. Alocus on chromosome 1 indistinguishable from Nramp1 controlled early BCGPasteur and early and late BCG Russia infection in a spleen-specific manner.Loci impacting on the counts of BCG Russia but not BCG Pasteur were identifiedon chromosome 13 for the spleen and on chromosome 11 for the lung and spleenat the late phase of infection. M. tuberculosis infection was also under distinctgenetic control in the RC strains, further demonstrating that genetic control ofmycobacterial infection is adapted to the infecting mycobacterial strain. A stronggenetic effect detected on chromosome 10 was linked with early death followingM. tuberculosis infection. Analysis conditional on this locus identified a set ofgenetic control elements on chromosomes 2, 4, and 13. Together, these studiesprovide compelling evidence for strong specificity of the host response to theinfecting pathogen. / La réponse de l'hôte aux infections par des mycobactéries est hautement variable.Des facteurs de l'hôte et de la bactérie ont un rôle à jouer dans cette variabilitébien qu'on ne sache pas si ces facteurs agissent indépendamment ou si le résultatde l'infection découle d'un effet combiné de l'hôte et du pathogène. Pour répondreà cette question, la présente thèse a évalué l'impact de facteurs de l'hôte et dupathogène sous contrôle génétique à l'aide d'un modèle murin d'infection. Unpanel de souches de souris congéniques recombinantes (CR) et leurs progéniteursconsanguins A/J et C57BL/6J furent infectés avec du Mycobacterium tuberculosisvirulent ou les souches atténuées M. bovis Bacille Calmette Guérin (BCG) Russieet Pasteur. Un effet combiné de l'hôte et du pathogène sur le déroulement del'infection mycobactérienne fut observé autant aux niveaux phénotypiques quegénétiques. Chez les souches A/J et C57BL/6J, des facteurs associés aupathogène ont eu un impact majeur sur les phénotypes biologiques (réplication auniveau du poumon, histopathologie pulmonaire) de même que sur les phénotypesmécanistes (transcription de Ifng, Il12b, Il4 et de gènes de chimiokines dans lepoumon), alors que le fond génétique modulait la magnitude de ces réponses. Auniveau génétique, une analyse comparative des comptes pulmonaires et spléniquesde BCG Russie et BCG Pasteur chez les souches CR a révélé que l'infection pardes mycobactéries est sous le contrôle d'effets génétiques génériques de mêmeque spécifiques à la souche. Dans la rate, un locus sur le chromosome 1 qui nepouvait être discriminé de Nramp1 a contrôlé l'infection précoce par BCG Pasteuret l'infection précoce et tardive par BCG Russie. Dans la phase tardived'infection, des locus influençant les comptes de BCG Russie mais non de BCGPasteur ont été identifiés sur le chromosome 13 pour la rate et sur le chromosome11 pour la rate et le poumon. L'infection par M. tuberculosis était également souscontrôle génétique distinct chez les souches CR, ce qui démontre à nouveau que lecontrôle génétique d'infections mycobactériennes est adapté à la souche demycobactérie qui infecte. Un important effet génétique détecté sur lechromosome 10 fut lié à une mortalité précoce suite à une infection par M.tuberculosis. Une analyse conditionnelle à ce locus a identifié un ensemble d'éléments de contrôle génétique sur les chromosomes 2, 4 et 13. Globalement,ces études relèvent la forte spécificité de la réponse de l'hôte au pathogène quiinfecte.