Breast cancer is the most commonly diagnosed cancer and the second leading cause of cancer related deaths among Canadian women. Development of distant metastases is the leading cause of morbidity and mortality from this disease. Breast cancer is a highly heterogeneous disease that is amenable to intervention with targeted therapeutics; however, therapies that are currently available have limited efficacy in the metastatic setting. To identify novel molecular mediators of breast cancer bone metastasis that might also serve as therapeutic targets, we subjected 4T1 mammary carcinoma cells to in vivo selection in Balb/c mice and isolated sub-populations with an aggressively bone-metastatic phenotype. Gene expression profiling of these cells revealed Glycoprotein NMB (GPNMB), also known as Osteoactivin, as a gene that was highly expressed in bone metastatic breast cancer cells. GPNMB is a type I transmembrane, cell surface expressed protein with an extracellular RGD and PKD domains and a cytoplasmic hemITAM signaling motif that had not previously been implicated in breast cancer. We demonstrate that ectopic GPNMB expression was sufficient to promote migration and invasion of breast cancer cells in vitro and the formation of bone metastases in vivo.Subsequently, we analyzed GPNMB mRNA and protein expression levels in hundreds of breast tumors and found that GPNMB expression positively correlates with increased risk of metastasis and shorter overall survival times. We have also demonstrated that GPNMB is most commonly expressed in breast tumors belonging to the triple negative subtype, for which there are no targeted therapies currently available. We showed for the first time that CDX-011, a GPNMB-targeted monoclonal antibody-drug conjugate, was capable of killing GPNMB-expressing breast cancer cells in vitro and inducing tumor regression in vivo. Finally, we investigated the effects of GPNMB on primary tumor progression and found that it inhibits tumor cell apoptosis while enhancing angiogenesis and tumor growth in vivo. We demonstrate that the extracellular domain (ECD) of GPNMB can be proteolytically cleaved and shed from the surface of breast cancer cells, which is mediated by ADAM10. We postulated that the shed extracellular domain (ECD) of GPNMB might be responsible for some of its pro-angiogenic effects and showed that this ECD was indeed capable of inducing endothelial cell migration in vitro.The body of work described in this thesis is the first to identify GPNMB as a functional mediator of breast cancer growth and metastasis and to validate it as an important clinical target in human breast cancer. / Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et la seconde cause de mortalité associée au cancer chez les femmes canadiennes. Le développement de métastases est la cause majeure de la morbidité et de la mortalité dûes à cette maladie. Le cancer du sein est une maladie très hétérogène qui peut toutefois être traité par l'utilisation de thérapie ciblée ; toutefois, les thérapies actuellement disponibles ont un effet limité sur la formation des métastases. Dans le but d'identifier de nouveaux médiateurs moléculaires associés à la formation de métastases osseuses dérivées du cancer du sein et qui pourraient être utilisés comme cibles thérapeutiques, nous avons soumis les cellules de carcinome mammaire 4T1 à un processus de sélection in vivo dans des souris Balb/c. Nous avons ainsi isolé des sous-populations de cellules caractérisées par leur agressivité à former des métastases osseuses. L'étude de l'expression génique de ces cellules a mis en évidence que le gène codant pour la Glycoprotéine NMB (GPNMB), aussi connu sous le nom de Ostéoactivine, est très fortement exprimé dans les lignées de cancer du sein métastatiques pour l'os.GPNMB est une protéine de surface transmembranaire de type I qui possède des domaines RGD et PKD extracellulaires ainsi qu'un motif hemITAM de signalisation cytoplasmique et n'avait encore jamais été rapportée comme impliquée dans le cancer du sein.Nous avons démontré que l'expression ectopique de GPNMB était suffisante pour promouvoir la migration et l'invasion de cellules de cancer du sein in vitro ainsi que la formation de métastases in vivo.Par la suite, nous avons analysé les niveaux d'expression des ARNm et de la protéine GPNMB dans des centaines de tumeur du sein humain et avons observé que l'expression de GPNMB corrèle positivement avec un risque accru de présence de métastases ainsi qu'une réduction du temps moyen de survie. Nous avons également démontré que GPNMB est le plus fréquemment exprimé dans des tumeurs mammaires appartenant au sous-type triple négatif pour lequel il n'y a actuellement aucune thérapie ciblée disponible.Par ailleurs, nous montrons pour la première fois que CDX-011, une drogue conjuguée à un anticorps monoclonal reconnaissant GPNMB, était capable, in vitro, d'éradiquer spécifiquement les cellules de cancer du sein exprimant GPNMB ainsi que d'induire une régression tumorale in vivo.Finalement, nous avons déterminé les effets de GPNMB sur la progression des tumeurs primaires et avons observé que GPNMB inhibait l'apoptose des cellules tumorales tout en augmentant l'angiogenèse et la croissance tumorale in vivo. Nous avons démontré que le domaine extracellulaire de GPNMB (ECD) pouvait être clivé de façon protéolytique par ADAM10 et ainsi être libéré de la surface cellulaire des cellules de cancer du sein. Nous avons postulé que la forme extracellulaire clivée (ECD) de GPNMB pourrait être impliquée dans certains des effets pro-angiogénique et avons montré que cet ECD était capable d'induire la migration de cellules endothéliales in vitro.L'ensemble des travaux décrits dans cette thèse implique pour la premier fois est le premier à identifier GPNMB comme médiateur fonctionnel de la croissance du cancer du sein et de ses métastases. Ce travail identifie GPNMB comme une importante cible thérapeutique pour le traitement des patients atteints du cancer du sein.

As a cause of malignancy-induced hypercalcemia, PTHrP (parathyroid hormone-related protein) plays an important role in cell growth and differentiation. This peptide is unique in that it not only acts through membrane receptors but also translocates directly to the nucleus. Studies have shown that the repression of target gene expression is achieved through chromatin modifications induced by the PcG complex. As a core protein of the PcG complex, Bmi1 functions as a transcriptional repressor for various genes involved in development and cell proliferation. Recent studies have indicated that the skeletal phenotypes of PTHrP(1-84) knock-in mice are consistent with ones observed in Bmi1-/- mice in vivo. In addition, the down-regulation of Bmi1 expression was detected in PTHrP(1-84) knock-in mice. Both phenotypes indicate that there is correlation between Bmi1 and PTHrP. However, the molecular mechanism involved in correlation of PTHrP and Bmi1 regulation is poorly understood. The aim of this study was to gain insight into the underlying molecular mechanism of the way of PTHrP regulating Bmi1. We focused on the interaction between PTHrP and Bmi1 in vitro and in vivo system and the consequences exerted by this interaction. At first, co-localization of PTHrP and Bmi1 was demonstrated and the N-terminus of PTHrP was found to be responsible for the interaction both in vivo and in vitro. Second, we set up the repression assays in vivo to identify the promoters' activities and cell survival influenced by this direct interaction. As a result, overexpression of PTHrP and Bmi1 in HEK293 cells was shown to have an effect on p19Arf and Gal4 promoter activities in vivo. Thirdly, increased cell proliferation was detected in HEK293 cells and NIH 3T3 cells with overexpressed PTHrP and Bmi1 together. At the same time, I also discovered the elevation of cell survival rate in HEK293 and NIH 3T3 cells when PTHrP and Mel18 were expressed together. This study provides evidence that the hormone PTHrP physically and functionally interacts with Bmi1 and Mel18 to affect the activities of promoters in the nucleus and regulate cell proliferation. / La protéine Parathyroid hormone related-protein (PTHrP) joue un rôle très important dans la croissance et la différentiation cellulaire en plus d'être responsable de l'hypercalcémie induite par la malignité. Ce peptide est unique non seulement parce qu'il agit par l'intermediate de récepteurs transmembranaires, mais aussi parce qu'il est transloqué directement au noyau. Bmi-1, un peptide essentiel du PcG complexe, fonctionne comme un répresseur de transcription pour plusieurs gènes importants dans le développement et de l'organisme de la prolifération cellulaire. Cette fonction répressive régule l'expression des gènes cibles en induisant des modifications sur la chromatine (73). Des études publiées récemment démontrent que PTHrP influence l'expression moléculaire de Bmi-1 (95). Cependant, le mécanisme par lequel Bmi-1 contrôle PTHrP n'est pas encore bien documenté. Mon but premier est d'élucider les mécanismes moléculaires de cette interaction ensuite de trouver quelles conséquences fonctionnelles peuvent résulter de cette interaction. Au départ, la colocalisation de PTHrP et Bmi-1 a été démontrée dans le noyau de cellules HEK293. Ensuite, l'interaction entre Bmi-1 et PTHrP a été illustrée in vivo et in vitro. On a trouvé que c'est le N-Terminal qui est responsable des interactions in vivo et in vitro. De plus, la surexpression de PTHrP et Bmi-1 dans les cellules HEK293 provoque des effets minimes sur l'activité transcriptionelle des gènes et de l'expression du gène P19arf. En outre, la surexpression de PTHrP et Bmi-1 cause une augmentation du niveau de prolifération cellulaire dans les cellules HEK293 et NIH 3T3. En parallèle, j'ai découvert une augmentation du taux de survie des cellules HEK 293 et NIH 3T3 suite à surexpression des peptides PTHrP et Mel18. A été noteé ces études démontrent que l'hormone PTHrP interagit physiquement et est attaché fonctionnellement avec Bmi-1.

Rheumatoid arthritis (RA) is characterized by chronic inflammation, synovial hyperplasia and joint destruction. The pathogenic mechanisms responsible for RA remain poorly understood both systemically and in the microenvironment of diarthrodial joint. Here we hypothesized, based on previous observations, that there is a positive interaction between resident mast cells and synovial fibroblasts (SF) within the rheumatoid synovial compartment. Our principal objectives were to define the cellular and molecular interactions between infiltrating mast cells and resident human synovial fibroblasts (HSF), and we focused our efforts on two genes, cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LO), both implicated in the inflammatory response associated with RA. Furthermore, our research led to the discovery of novel epigenetic mechanisms governing the regulation of 5-LO gene expression in RA-affected SF. Epigenetics refers to heritable changes in gene expression regulated by DNA methylation, histone modifications and RNA interference. Epigenetic regulation is critical for normal development and differentiation. But environmental factors can trigger epigenetic dysregulation, leading to the development of many diseases, including cancer and autoimmune diseases. Using Western and Northern blot analyses in addition to reporter assays, we demonstrated that mast cell-derived leukotriene B4 (LTB4) contributes to the modulation of inflammatory response in part through stabilization of COX-2 mRNA and protein expression in SF, the key enzyme in prostaglandin biosynthesis and the target of all non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Further transient and stable transfection experiments verified that LTB4 exerted this COX-2 stabilization effect at the post-transcriptional level through Ras/c-Raf/MEK1/2/ERK1/2/p42 AUF1 signaling pathway. Genomic bisulfite sequencing was used to detect DNA methylation profiles of 5-LO gene (rate limiting in LTB4 synthesis) in HSF, mast cells and other cell types. The 5-LO gene promoter (DNA CpG islands) was heavily methylated in U937 cells (5-LO negative), but unmethylated in HL-60 cells (5-LO positive). Compared to the 5-LO-positive HMC-1 cells, the 5-LO-negative HMC-1 cells had much higher methylation levels of CpG islands in the promoter region. We found a strong correlation between 5-LO gene expression and DNA methylation in HMC-1 cells. Dexamethasone (DEX) treatment of HMC-1 cells increased the expression of 5-LO, a process associated with reduced methylation of histone H3 on lysines 9 and 27. Interestingly, osteoarthritic (OA)/RA HSF are 5-LO negative; though the promoter region is CpG hypomethylated, histone H3 is hypermethylated at Lys-9 and -27 residues.The research in this thesis provided innovative insights into the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in inflammatory diseases like RA. The elucidation of the cellular and molecular mechanisms involved in these studies may help to establish new therapeutical targets in the treatment of RA patients. Moreover, the bisulfite sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) techniques used in this thesis provide reliable procedures for DNA methylation and histone modification studies in various inflammatory diseases and cancers. / L'arthrite rhumatoïde est caractérisée par une inflammation chronique, une hyperplasie de la membrane synoviale et la destruction des jointures. Notre hypothèse, basé sur des observations précédentes, qu'il y avait une interaction positive entre les cellules mastocytes résidentielles et les fibroblastes synoviaux dans le compartiment de la synovial rhumatoïde. Nos objectifs principaux étaient de définir les interactions cellulaires et moléculaires entre les cellules mastocytes infiltrantes et les fibroblastes synoviaux résidentielles, en particulier deux gènes, la cyclooxygénase-2 et la 5-lipoxygénase (5-LO), tous deux impliquées dans la réponse inflammatoire associée à l'arthrite rhumatoïde. De plus, notre recherche a abouti à la découverte de mécanismes épigénétiques gouvernant la régulation de l'expression du gène de la 5-LO chez les fibroblastes synoviales atteint d'arthrite rhumatoïde. L'épigénétique est l'ensemble des modifications de l'expression des gènes contrôlés par la méthylation de l'ADN, les modifications aux histones liées à l'ADN et par interférence ARN transmissibles d'une génération de cellule à l'autre. La régulation épigénétique est indispensable pour la différentiation et le développement normal. Cependant, des facteurs environnementaux peuvent entamer un désordre épigénétique causant ainsi plusieurs maladies, tels que le cancer et des maladies auto-immunes.Avec les méthodes d'analyse par buvardage Western et Northern, en plus des essais rapporteurs, nous avons démontré que le leukotriène B4 (LTB4) produit par les cellules mastocytes contribues à la modulation de la réponse inflammatoire en parti par la stabilisation de l'ARN messager de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et de l'expression de la protéine chez les fibroblastes synoviaux, l'enzyme clé de la biosynthèse des prostaglandines et la cible de tous les drogues anti-inflammatoires non stéroïdiens. De plus, les expériences de transfections transitoires et stables ont démontré que le LTB4 a exercé cet effet de stabilisation de la COX-2 au niveau post-transcriptionnelle par l'intermédiaire de la voie de signalisation de Ras/c-Raf/MEK1/2/ERK1/2/p42 AUF1. Le séquençage génomique avec traitement au bisulfite a été utilisé pour déterminer le profile de méthylation de l'ADN du gène de la 5-LO (enzyme clé dans la synthèse du LTB4) chez les fibroblastes synoviaux humains, les cellules mastocytes et d'autres types cellulaires. Le promoteur du gène 5-LO (îlots d'ADN CpG) était fortement méthylé chez les cellules U937 (5-LO négatif), cependant chez les cellules HL-60 le promoteur n'était pas méthylé (5-LO positif). En comparant les cellules HMC-1 qui expriment la 5-LO aux cellules HMC-1 qui n'expriment pas la 5-LO, ces derniers avaient de fort niveaux de méthylation des îlots CpG dans la région du promoteur. Nous avons trouvé une forte corrélation entre l'expression du gène 5-LO et la méthylation de l'ADN chez les cellules HMC-1. Le traitement des cellules HMC-1 avec la dexamethasone (DEX) augmente l'expression de la 5-LO, un processus associé à la réduction de la méthylation de l'histone H3 sur les lysines 9 et 27. Il est intéressant de voir que les fibroblastes synoviaux humains ostéoarthritique (OA)/RA sont 5-LO négatif; quoique la région du promoteur CpG est hypométhylé alors que l'histone H3 est hyperméthylé aux lysines 9 et 27.La recherche de cette thèse propose un cheminement innovateur à la compréhension des mécanismes physiopathologique impliqué dans les maladies inflammatoires telle que l'arthrite rhumatoïde. L'élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ses études peuvent aider à l'établissement de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l'arthrite rhumatoïde. De plus, la technique de séquençage de l'ADN avec le traitement au bisulfite utilisé dans cette thèse est fiable pour des études de méthylation de l'ADN et la modification des histones chez plusieurs maladies inflammatoires ainsi que les cancers.

Genotype, phenotype, and environment interact in complex non-linear ways during development and evolution. Wing polyphenism, which is the ability of a single genome to produce winged and wingless castes depending on environmental cues, is a good model for understanding these complex interactions. Although wing polyphenism evolved just once and is a homologous trait across all ant species, the gene network underlying wing polyphenism has evolved, i.e., the gene network is conserved in the winged castes of ants, but is interrupted at different points of this network in the wingless castes of different species. This represents an example of developmental system drift (DSD) in that a homologous trait is encoded by non-homologous genes or gene expression patterns. My PhD research is therefore focused on understanding DSD of the gene network underlying wing polyphenism in ants. In CHAPTER 2, I tested whether the gene brinker (brk) is a key node in the network underlying wing polyphenism, and predicted that when up-regulated, brk would reduce growth and induce apoptosis in the vestigial wing discs of wingless castes. I therefore examined the expression of brk and its upstream genes engrailed (en) and decapentaplegic (dpp) and its downstream gene spalt (sal) in the winged castes and wingless soldiers of the ant Pheidole morrisi during last larval and prepupal development. I found that the expression of these genes is conserved in the wing discs of winged castes relative to their expression in Drosophila wing disc. However, the expression of the above genes is interrupted in the vestigial forewing discs of soldiers relative to that in the wing discs of winged castes. Surprisingly, I discovered that brk expression is absent throughout vestigial wing disc development, and this absence is correlated with abnormal growth of the soldier forewing disc as revealed by En expression and morphometric analyses. Furthermore, the expression of dpp and sal changes dynamically during the transition from last larval to prepupal development, and is spatially and temporally correlated with the induction of apoptosis at the beginning of prepupal development. In CHAPTER 3, I tested whether brk expression has evolved across different ant species and whether or not it is correlated to the expression of its upstream gene regulators in the network. I therefore examined the expression of brk and its upstream gene en in the winged and wingless caste of three ant species: Tetramorium caespitum, Crematogaster lineolata, and Lasius niger. I found that the expression of both brk and En is conserved in the wing discs of winged castes. However, in the wingless workers, the expression of En is absent in the vestigial wing discs of T. caespitum and C. lineolata, but is present in L. niger. brk expression is absent in the vestigial wing discs of the three ant species regardless of the presence or absence of En expression. Taken together, these results suggest that the absence of brk expression may be a common interruption point in the wingless castes of derived ant species. / Le génotype, le phénotype et l'environnement interagissent de façon complexe et non-linéaire durant le développement et l'évolution. Le polyphénisme des ailes, qui est la capacité pour un simple génome de produire des castes avec ou sans ailes, selon les stimuli environnementaux, est un bon exemple pour faciliter la compréhension de ces types d'interactions complexes. Malgré que le polyphénisme des ailes ait évolué qu'une fois et qu'il soit également une caractéristique homologue pour toutes les espèces de fourmis, le réseau de gènes sous-jacent du polyphénisme des ailes a évolué. Par exemple, le réseau de gènes est maintenu dans la caste ailée des fourmis mais est interrompu à différents endroits dans ce réseau, dans la caste non ailée de différentes espèces. Ceci représente un exemple de la déviation du système de développement (DSD), en ce, qu'une caractéristique homologue soit encodée par des gènes ou des patrons d'expression non-homologues. Ma recherche doctorale est concentrée sur la compréhension DSD du réseau des gènes sous-jacent au polyphénisme des ailes chez les fourmis. Dans le CHAPITRE 2, j'ai effectué des tests sur le gène brinker (brk) afin de déterminer si celui-ci est un noeud clé dans le réseau sous-jacent du polyphénisme des ailes et en suis venue à la conclusion que, lorsque ce gène brk est sur-régulé, il ya diminution de la croissance et induction de l'apoptose des disques vestigiaux de l'aile chez les castes non ailées. Donc, j'ai examiné l'expression du brk et ses gènes en amont, engrailed (en) et decapentaplegic (dpp), ainsi que ses gènes en aval, appelés spalt (sal), chez les castes ailées et soldats non ailés de l'espèce Pheidole morrisi de la fourmi pendant le dernier stade du développement larvaire et le développement prépupal. J'ai trouvé que l'expression de ces gènes est conservée dans les disques de l'aile chez les castes ailées relativement à leur expression dans le disque de l'aile Drosophile. Par contre, l'expression des gènes ci-dessus est interrompue au niveau des disques antérieurs vestigiaux chez les soldats relativement à ceux des disques de l'aile chez les castes ailées. Étonnamment, j'ai trouvé que l'expression brk est inexistante pendant tout le développement du disque vestigial de l'aile et cette absence est en corrélation avec la croissance anormale du disque antérieur de l'aile du soldat, tel que révélé par les analyses morpho métriques et les expressions du gène en. De plus, les expressions dpp et sal sont modifiées dynamiquement pendant la dernière transition du stade larvaire au développement prépupal, et est spatialement et temporellement en corrélation avec l'induction de l'apoptose au début du développement prépupal. Dans le CHAPITRE 3, j'ai testé si l'expression du brk avait évolué chez différentes espèces de fourmis et s'il était en corrélation ou non avec l'expression du régulateur du gène en est situé en amont du réseau. J'ai donc examiné l'expression du brk ainsi que son gène en en amont, au niveau des castes ailées et non ailées chez trois espèces de fourmis: Tetramorium caespitum, Crematogaster lineolata, et Lasius niger. J'en ai conclu que l'expression des brk et en est conservée dans les disques des ailes chez les castes ailées. Par contre, chez les travailleurs non ailés, l'expression du en est inexistant dans les disques vestigiaux de l'aile chez le T.caespitum et le C. lineolata, mais est présent chez L. niger. L'expression brk est inexistante dans les disques vestigiaux de l'aile chez trois espèces de fourmis, sans tenir compte de l'absence ou la présence de l'expression en. Tous ces résultats confondus suggèrent que l'absence de l'expression brk pourrait être le point commun d'interruption chez les castes non ailées des espèces dérivées de fourmis.

Protein stability in solution is often a limiting factor in certain biochemical and structural biology studies. Proteins from the thermotolerant vertebrate Dipsosaurus dorsalis, the desert iguana, have been studied as a possible means to provide stable homologues of mammalian proteins of interest, notably the first nucleotide-binding domain (NBD1) of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cystic fibrosis (CF) is an often fatal human disease, which is caused by the malfunction of CFTR. The vast majority of CF patients have a common mutation: a deleted phenylalanine residue (F508) located in the NBD1 domain. The genes coding for the desert iguana NBD1 (iNBD1) and the C-terminal domain of poly-A binding protein (iPABC) were both cloned by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) of RNA purified from heart tissue. The human and iguana PABC amino acid sequence was found to be identical. Comparison of the iguana NBD1 amino acid sequence to human showed that four amino acid substitutions known to solubilize human NBD1 were naturally occurring in the desert iguana. These residues are localized on a solvent-exposed face of the domain. Sequence analysis of published genomes showed that these solubilizing residues are not unique to the desert iguana. The iNBD1 protein was purified as a GST fusion and an HSQC spectrum was recorded. This analysis offers preliminary data to drive and direct future structural biology studies using thermostable proteins from D. dorsalis. / La stabilité d'une protéine s'avère souvent le facteur limitant lors d'études structurales. Des protéines provenant du vertébré thermotolerant Dipsosaurus dorsalis, l'iguane du désert, ont été étudiés en tant qu'homologues plus stables de protéines d'origine mammifère, notamment le premier domaine de liaison aux nucléotides (NBD1) du canal transmembranaire CFTR. La fibrose kystique est une maladie souvent mortelle causée par le dysfonctionnement de la protéine CFTR. La majorité des patients atteint de la fibrose kystique ont une mutation commune dans leur gène CFTR: la suppression d'un acide aminé phenylalanine (F508) situé dans le domaine NBD1. deux gènes codants pour des protéines de l'iguane du désert correspondant aux domaines NBD1 (iNBD1) et PABC (terminal carboxylique de la protéine se liant aux poly-A) (iPABC) ont étés clonés par RT-PCR d'ARN purifié d'un échantillon de tissue cardiaque. La séquence d'acides aminés de PABC était identique entre l'humain et l'iguane. Celle de iNBD1 a été comparée a celle de mutants humain stables; quatre substitutions stabilisantes se retrouvaient naturellement dans iNBD1 et étaient localisées sur une face du domaine exposée au solvant. Un alignement multiple démontra que ces acides aminés ne sont pas uniques à D. dorsalis. La protéine iNBD1 fut purifiée en tant que fusion GST un spectre HSQC fut enregistré. Cette analyse offre des données préliminaires qui guideront de futures études structurales utilisant des protéines thermostables de D. dorsalis.

CD45, also known as Leukocyte-common antigen (LCA), is a type-1 receptor-like protein tyrosine phosphatase (PTPase), which contains two PTPase domains, the membrane proximal domain (DI) and the membrane distal domain (D2). It is uniquely expressed on the surface of all leukocytes and their hematopoietic precursors and plays an important role in immunoreceptor signaling. In this study, I identified a novel CD45-interacting protein, Fyb, through screening human leukocyte cDNA library with a modified yeast two-hybrid system. Fyb is an adaptor protein mainly involved in the regulation of T cell receptor-induced integrin clustering and adhesion. It contains several regions with potential to mediate protein-protein interactions and has been shown to bind to the Src family kinase Fyn, the adapter protein SLP-76, Ena/VASP proteins, the adapter protein SKAP55, and SKAP55-HOM in T cell receptor signaling. I also demonstrated that the interaction of Fyb with CD45 was through involves the C-terminal region of Fyb, where several tyrosine residues, such as Tyr 594 and Tyr624, are critical for its interaction with other proteins in signaling. The interaction of Fyb with CD45 is phosphotyrosine-dependent since Src kinase is required for the interaction. Mutation analysis revealed that the tyrosine residue 624 of Fyb is the pivotal tyrosine residue involved in its association with CD45, whereas tyrosin 594 was not found to be required for binding. By mutation of CD45, it was demonstrated that the phosphatase catalytic D1 domain of CD45 was involved in the interaction with Fyb. More significantly, I found that only the substrate-trapping mutant (Asp to Val), but not the wild type CD45 interacted with Fyb, suggesting that Fyb is a potential CD45 substrate. Furthermore, I demonstrated the association of the C-terminal fragment of Fyb with CD45 in mammalian cells. However, I was not able to determine the interaction of the wild type Fyb with CD45 in 293 cells.

The quaking gene encodes a family of alternatively spliced RNA binding protein isoforms that differ in their C-terminal regions. All of the QUAKING (QKI) proteins contain a single stranded RNA binding domain, KH domain, and are part of the larger STAR (Signal Transduction and Activator of RNA) family. These isoforms have expression patterns that differ spatially and temporally and coincide with development of both central and peripheral nervous systems. The QKI proteins have been implicated in several post-transcriptional mechanisms such as pre-mRNA splicing, mRNA export, mRNA stability and protein translation. Although the QKI protein is known to exist as homo- and heterodimeric forms, the size of its cellular complex and its components are largely uncharacterized. Herein, I have confirmed that QKI indeed forms a large protein complex and in addition defined the size of the complex and identified some of its components. Using a second approach, I also identified the microRNA-processing enzyme Argonaute 2 (Ago2) protein as one of QKI interacting proteins and biochemically validated and characterized its association with QKI in vivo. Furthermore, I generated a qkI-6 and qkI-7 conditional allele that will generate a new mouse model, in order to delineate the correlation between QKI and micro RNA processing.

The myocyte enhancer factor 2 (MEF2) family of transcription factors plays important roles during muscle differentiation as well as in different programs of non-muscle cells. Covalent modification has emerged as an important mechanism for regulating MEF2 function. The goal of my thesis project was to identify novel post-translational modifications that modulate MEF2 transcriptional activity and to determine whether histone deacetylases coordinate these modifications. I first demonstrated that MEF2D is modified by the ubiquitin-like protein SUMO. Sumoylation of MEF2D at a single residue, lysine 439, inhibits the myogenic activity of this transcription factor. Fascinatingly, histone deacetylase 4 (HDAC4) potentiates the sumoylation of MEF2D. In addition, HDAC4 stimulates this modification by promoting phosphorylation of serine 444 of MEF2D. In support of this, phosphorylation of serine 444 is required for sumoylation at lysine 439. Thus, I have identified a phospho-sumoylation switch that turns on and off MEF2-dependent transcription. Moreover, I found that MEF2D is subject to lysine acetylation catalyzed by the acetyltransferases PCAF and p300. Unexpectedly, HDAC3, but not HDAC4 and homologs, reverses this modification. Moreover, HDAC3 reverses autoacetylation of p300 and PCAF. Altogether, these results indicate that HDAC3 and HDAC4 are important regulators with distinct role in controlling MEF2 modifications, and further suggest that multiple HDACs cooperate to achieve efficient control of MEF2-dependent transcription and that disruption of MEF2-HDAC interaction may lead to pathological conditions like cardiac hypertrophy, coronary artery disease and lymphoblastic leukemia.

Proper chromosome segregation at meiosis I depends on the initial alignment of homologous chromosomes, the establishment of the synaptonemal complex (SC), and the formation of chiasma between homologs. Previous studies have demonstrated that HIM-3, a component of the meiotic chromosome axis, is required for these processes through the recruitment of the autosomal pairing center proteins (ZIMs) and of SC components like SYP-1. The him-3(vv6) mutation results in the substitution of a highly conserved residue in the HORMA domain, believed to mediate protein-protein interactions. him-3(vv6) mutant germlines display immature and discontinuous axes at early meiosis and the autosomal pairing center (PC) protein ZIM-3 fails to localize properly to the pairing centers, despite the fact that HIM-3vv6 is appropriately expressed and localized; mutants exhibit severe defects in homolog alignment, extensive nonhomologous synapsis and defects in chiasma formation, resulting in a high embryonic lethality (emb) and a high incidence of male (him) phenotype as consequences of chromosome missegregation. To identify proteins that interact with HIM-3 in early meiotic processes and other proteins that function in the HIM-3 pathway, an EMS-based suppressor screen was performed using the vv6 allele and a strong extragenic suppressor, vv39 was isolated. vv39 was identified as a novel allele of cct-4, which encodes the delta subunit of type II chaperonin complex. In wild-type germlines, CCT-4 is localized to the cytoplasm and to the nucleus, indicating that it has a nuclear role. In germlines depleted for cct-4 or other subunits of the CCT complex, axis assembly is delayed, ZIM-3 fails to be recruited to the PCs and SYP-1 fails to localize to the axes, suggesting that the CCT complex is required for morphogenesis of meiotic chromosome axes competent for meiotic processes. In him-3(vv6); cct-4(vv39) mutants, the timely morphogenesis of chromosome axes is appears to be restored and is accompanied by ZIM-3 recruitment to PCs, improved homologue alignment and reduced nonhomologous synapsis. These results collectively suggest that CCT-4 mediates timely axes morphogenesis through CCT-mediated folding of axis component HIM-3 or its interactors. This study is the first to provide insight on the function of molecular chaperonin in mediating meiotic processes and reveals an unprecedented nuclear function for the complex. It would be interesting in the future to further study the nuclear CCT chaperonin complex and its clients to learn more about their roles in meiotic processes. / La ségrégation des chromosomes lors de la méiose I dépend de l'alignement initial de chromosomes homologues, la mise en place du complexe synaptonémal (SC), et la formation de chiasmas entre les homologues. Des études antérieures ont démontré que HIM-3, une composante de l'axe du chromosome méiotique, est requis pour ces processus par le recrutement des protéines autosomique centre de liaison (ZIMS) et des composants SC comme SYP-1. Le him-3(vv6) mutation se traduit par la substitution d'un résidu hautement conservé dans le domaine HORMA, considérés comme des médiateurs des interactions protéine-protéine. him-3(vv6) germlines mutant affichage des axes immature et discontinue à la méiose précoce et le centre autosomique appariement (PC) protéine ZIM-3 ne parvient pas à localiser correctement vers les centres de liaison, malgré le fait que HIM-3vv6 est correctement exprimé et localisées; mutants présentent des défauts graves dans homologue alignement, non homologue vaste synapse et des défauts dans la formation des chiasmas, entraînant une mortalité élevée embryonnaires (emb) et une incidence élevée de sexe masculin (him) comme des conséquences de phénotype missegregation chromosome. Pour identifier les protéines qui interagissent avec HIM-3 au début du processus de la méiose et d'autres protéines qui fonctionnent dans la voie HIM-3, un crible EMS à base de suppresseur a été réalisée avec l'allèle vv6 et un suppresseur de forte extragénique, vv39 a été isolé. vv39 a été identifié comme un nouvel allèle de cct-4, qui code pour la sous-unité delta du complexe chaperonine type II. En germlines de type sauvage, cct-4 est localisée dans le cytoplasme et le noyau, ce qui indique qu'il a un rôle nucléaire. En germlines appauvri pour cct-4 ou d'autres sous-unités du complexe du CCT, le montage axe est retardée, ZIM-3 ne parvient pas à être recrutés pour les PC et SYP-1ne parvient pas à localiser les axes, ce qui suggère que le complexe CCT est nécessaire pour la morphogenèse des axes chromosome méiotique compétente pour les processus de la méiose. En him-3(vv6); cct-4 (vv39) mutants, la morphogenèse en temps opportun des axes chromosome est semble être restauré et il est accompagné par ZIM-3 de recrutement pour les PC, l'alignement homologue accrue et une réduction non homologue synapsis. Ces résultats suggèrent collectivement que CCT-4 est un médiateur de axes morphogenèse par pliage de l'axe composante HIM-3 ou des interacteurs du HIM-3. Cette étude est la première à donner un aperçu sur la fonction de chaperonine moléculaire dans la médiation des processus méiotique. Il serait intéressant à l'avenir d'approfondir l'étude du complexe nucléaire chaperonine CCT et de ses clients à en apprendre davantage sur leur rôle dans les processus de la méiose.

PKR has been shown to play an essential role against VSV infection by phosphorylating eIF2alpha leading to the inhibition of protein synthesis. Through this capacity PKR is thought to be a mediator of the anti-viral and anti-proliferative actions of IFNs. In addition to translational control, PKR has been shown to modulate the transcriptional activities of NF-kappaB, Stats and p53. However, experiments with two different PKR-/- mouse models have failed to verify many of the biological functions attributed to PKR. Here, we show that the two PKR-/- MEFs express different PKR truncated proteins suggesting that both PKR-/- models are incomplete knockouts. The expression of the PKR variants may account for the significant signaling differences between cells from the two PKR-/- mice. / We also demonstrate that another eIF2alpha kinase, PERK contributes to cellular resistance towards VSV infection. We demonstrate that PERK -/- MEFs are more susceptible to VSV-mediated apoptosis than PERK +/+ MEFs. The higher replication capacity of VSV in PERK-/- MEFs results from their inability to attenuate viral protein synthesis due to an impaired eIF2alpha phosphorylation. We also show that VSV-infected PERK-/- MEFs are unable to fully activate PKR suggesting a cross-talk between the two eIF2alpha kinases in virus infected cells. These findings further implicate PERK in virus infection, and provide evidence that the anti-viral and anti-apoptosic roles of PERK are mediated, at least in part, via the activation of PKR. / Despite the translational control function of eIF2alpha kinases, we demonstrate their implications in p53 inactivation. Specifically, we show that PERK activation is responsible for the proteasomal degradation of p53 in a manner that is independent of translational control. This role is not specific for PERK, since the PKR also promotes p53 degradation in response to dsRNA transfection. We established that activation of eIF2alpha kinases leads to the activation of GSK3beta thus promoting the Mdm2-dependent degradation of p53. That is, induction of eIF2alpha kinases leads to the nuclear localization of GSK3beta, and the nuclear export and proteasomal degradation of p53. Our findings establish a novel cross-talk between the eIF2alpha kinases and p53 with significant implications in stress responses that control cell proliferation and tumorigenesis.