Heat shock cognate 70 kDa protein (hsc70) is a well conserved molecular chaperone involved in many physiological functions such as the stress response, protein folding, and protein transport. Moreover, hsc70 plays roles in human disease, such as cancer, neurodegenerative disease, heart and brain ischemia, and it also takes part in the aging process. With the help of co-chaperones and ATP hydrolysis, hsc70 can restore proper protein folding by binding to normally inaccessible hydrophobic residues on its target. Following heat shock, hsc70 traffics from the cytoplasm to the nucleoplasm. Hsc70 further accumulates in nucleoli during heat stress recovery. Using GFP-tagged portions of hsc70, I identified the nucleolar localization sequence (NoLS) of hsc70. Following quantification of the fluorescence signal, I showed that the nucleolar accumulation of different constructs varied. This allowed me to identify a heat inducible segment on hsc70, residues 225 to 297, which is sufficient for nucleolar accumulation during recovery from stress. The analysis of deletion mutants generated for segment 225-297 revealed that some constructs accumulated in the nucleolus constitutively, while others did not target GFP to nucleoli. Using pharmacological inhibitors, I also showed that PI3-kinase, MEK (MAP kinase kinase) and tyrosine dephosphorylation are involved in the hsc70 nucleolar accumulation process. The nucleolus is a well defined compartment in the nucleus that is dynamic and characterized by multiple functions. Nucleoli are currently at the center of important discoveries as they play a role in diseases such as cancer. The nucleolus participates in the control of cell cycle progression and viral infections, but its fundamental function is the assembly of ribosomes. Several thousand proteins have been identified in the nucleolus; however, as the nucleolus is dynamic, this composition depends on physiological and environmental conditions. My work focused on reviewing our knowledge of the possible chaperone networks present in the nucleolus. A new set of proteins, the nucleolar multitasking proteins (NoMPs), has been identified as chaperones that are necessary for the specific function of the nucleolus. These multitasking proteins include B23 and nucleolin. This work provided the basis for us to predict interactions between chaperones in the nucleolus.Many proteins of the nucleolus are dynamic: they can traffic to other cellular compartments when environmental conditions change. To define the mechanisms of hsc70 nucleolar accumulation during stress recovery, my work aimed at identifying the nucleolar binding partners of hsc70. I provided evidence that RNA plays a role for hsc70 nucleolar accumulation by treating heat shocked cells with detergent and RNase. Furthermore, inhibition of RNA polymerase I increased the retention time of endogenous hsc70 in the nucleolus. In further studies I examined the GFP-tagged hsc70 NoLS in transfected cells. This reporter displayed increased nucleolar accumulation and delayed release from the nucleolus during the recovery from heat shock when cells were treated with actinomycin D. On the other hand, RNA polymerase I inhibition was not sufficient to accumulate hsc70 or the GFP-tagged NoLS in nucleoli under normal growth conditions. In addition to the links between nucleolar RNA and hsc70, my research demonstrated that hsc70 and its NoLS bind to polyA+ RNA under normal growth conditions.Taken together, my studies advance our current understanding of the nucleolar accumulation of hsc70 during heat stress recovery. I identified important sequence elements, pathways and possible nucleolar anchors that contribute to hsc70 nucleolar accumulation. My work congregates important concepts that will likely be beneficial to human health. / La protéine apparentée à la protéine de choc thermique 70 kDa (hsc70: heat shock cognate 70 kDa protein) est une chaperonne moléculaire impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques telles que la réponse au stress, le repliement des protéines, ainsi que dans le transport de celles-ci. Hsc70 joue des rôles dans les maladies humaines, comme le cancer, les maladies neurodégénératives, l'ischémie du cerveau et du cœur, et elle prend part au processus de vieillissement. Avec l'aide des co-chaperonnes et de l'hydrolyse de l'ATP, hsc70 peut replier correctement les protéines en se liant aux résidus hydrophobes normalement inaccessibles.Suivant un choc thermique, hsc70 se déplace du cytoplasme vers le nucléoplasme. Hsc70 s'accumule subséquemment dans les nucléoles, pendant la récupération du stress thermique. Utilisant des portions de hsc70 liées à GFP, j'ai identifié la séquence de ciblage au nucléole (NoLS: nucleolar localization sequence) de hsc70. En quantifiant le signal fluorescent, j'ai démontré que l'accumulation nucléolaire des constructions variait. J'ai ainsi identifié un fragment inductible par la chaleur sur hsc70, aux résidus 225 à 297, qui est suffisant pour l'accumulation au nucléole pendant la récupération du stress. Des délétions générées dans le segment 225-297 ont révélé que certaines constructions s'accumulaient constitutivement au nucléole, alors que d'autres ne ciblaient jamais GFP au nucléole. Utilisant des inhibiteurs pharmacologiques, j'ai également démontré que PI3-kinase, MEK (MAP kinase kinase) et la déphosphorylation des tyrosines, sont impliqués dans le processus de l'accumulation nucléolaire de hsc70.Le nucléole, compartiment bien défini du noyau, est dynamique et a de multiples fonctions. Les nucléoles sont importants car ils jouent un rôle dans les maladies telles les cancers, participent au contrôle de la progression du cycle cellulaire, et aux infections virales, mais leurs fonction fondamentale est l'assemblage des ribosomes. Plusieurs milliers de protéines ont été identifiées dans le nucléole, cependant, comme le nucléole est dynamique, cette composition dépend des conditions physiologiques et environnementales. Mon projet focalise aussi sur la revue des connaissances portant sur les possibles réseaux de chaperonnes présents dans le nucléole. Une nouvelle catégorie de protéines, les protéines multitâches (NoMP: nucleolar multitasking protein), a été identifiée comme étant des chaperonnes nécessaires pour la fonction spécifique du nucléole. Celles-ci sont B23 et la nucléoline. Ce travail nous a procuré les bases permettant de prédire les interactions entre les chaperonnes dans le nucléole.Plusieurs protéines du nucléole sont dynamiques: elles peuvent se déplacer vers d'autres compartiments cellulaires selon les conditions. Mon projet visait à identifier les partenaires qui se lient à hsc70. J'ai démontré que l'ARN joue un rôle dans l'accumulation nucléolaire de hsc70. De plus, l'inhibition de l'ARN polymérase I augmente la duré de rétention nucléolaire de la hsc70 endogène. Avec des cellules transfectées et l'actinomycine D, j'ai examiné le NoLS lié à GFP qui démontre une accumulation nucléolaire plus élevée, ainsi qu'un délai dans le relâchement du nucléole pendant la récupération du stress à la chaleur. D'autre part, l'inhibition de l'ARN polymérase I n'était pas suffisante pour accumuler hsc70, ou le NoLS liée à GFP, dans le nucléole lors de conditions normales. En plus des liens entre l'ARN nucléolaire et hsc70, ma recherche a démontré que hsc70 et son NoLS se lient à l'ARN polyA+.Mes travaux contribuent à notre compréhension de l'accumulation de hsc70 dans le nucléole lors de la récupération du stress à la chaleur. J'ai identifié d'importants éléments de séquence, des voies et des ancres nucléolaires possibles qui contribuent à l'accumulation de hsc70 au nucléole. Mes travaux regroupent d'importants concepts qui vont possiblement être bénéfiques à la santé humaine.

Freezing stress limits crop productivity and generates substantial economic losses every year. While most temperate cereal crops exhibit some degree of cold tolerance, they require exposure to low, non-freezing temperatures in order to acclimate. This involves the induced expression of cold-regulated (COR) genes. COR gene promoters contain sequences that are recognized by C-repeat Binding Factor 1 (CBF1), a transcription factor that may mediate gene expression via the SAGA (SPT-ADA2-GCN5-acetyltransferase) complex in response to cold stress. The goal of this study was to characterize the function of the adaptor protein ADA2, a member of the SAGA complex that may link CBF1 to chromatin remodeling proteins. Expression analysis confirmed that Brachypodium CBF1 and ADA2 were expressed synchronously in response to cold treatment. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis demonstrated that ADA2 and CBF1 interact directly in planta. These results further support the hypothesis that the SAGA complex exists in Brachypodium and that it may play an important role in mediating the cold response mechanism. / Pour les pays nordiques, les épisodes de gel précoces et tardifs limitent considérablement le rendement des cultures et génèrent de lourdes pertes économiques. Bien que la plupart des plantes céréalières cultivées au Canada possèdent d'emblée un certain niveau de tolérance au gel, elles nécessitent toutes une période d'exposition à de basses températures (de 2 à 10°C) afin de maximiser leurs niveaux de tolérance. Ce processus d'acclimatation repose sur l'expression induite des gènes COR (Cold-Regulated Genes) contrôlés en grande partie par le régulateur CBF1 (C-repeat Binding Factor 1). Récemment, il a été proposé que CBF1 pourrait interagir avec le complexe chromatinien SAGA dans le but d'accomplir sa fonction. Cette interaction serait médiée par une sous-unité du complexe SAGA, la protéine adaptatrice ADA2. Cette dernière représenterait donc le lien moléculaire unissant les mécanismes de régulation génique traditionnels et chromatiniens impliqués dans le développement de la tolérance au gel des plantes. Le but de cette étude était de caractériser l'interaction physique entre CBF1 et ADA2 dans un contexte in planta. Des analyses d'expression en temps réel ont démontré que BradiCBF1 et BradiADA2 sont exprimés de façon similaire en réponse aux basses températures. De plus, des analyses d'interactions utilisant la technique de complémentation bimoléculaire de fluorescence (BiFC) ont démontré pour la première fois une interaction in planta entre les protéines BradiCBF1 and BradiADA2. Les résultats présentés ici suggèrent fortement qu'un complexe apparenté au complexe SAGA existe chez Brachypodium distachyon et que ce dernier pourrait jouer un rôle important lors du développement de la tolérance au gel chez les plantes céréalières.

Nephrin, a key component of the filtration slit diaphragm, undergoes post-translational modifications in the endoplasmic reticulum (ER). Mutations in nephrin lead to proteinuria. We examined the effects of missense mutations in nephrin on protein folding in the ER, cellular trafficking, and induction of the unfolded protein response (UPR). Wild type (WT) nephrin and the I171N, G270C, S366R, S724C and R743C mutant cDNAs were expressed in 293T cells or glomerular epithelial cells (GECs) by transient transfection. Association of nephrin with the ER chaperone, calnexin, was studied by co-immunoprecipitation. Activation of the UPR was assessed by monitoring expression of the ER chaperone, Grp94, phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor-2α subunit (eIF2α), and induction of C/EBP homologous protein-10 (CHOP), as well as activating transcription factor-6 (ATF6)-luciferase reporter activity. All nephrin mutants showed increased association with calnexin, compared with WT nephrin. The I171N and G270C mutants increased expression of Grp94 in 293T cells, and stimulated ATF6-luciferase activity in both 293T cells and GECs. Nephrin S366R and S724C tended to induce the UPR, but changes in Grp94 and ATF6-luciferase activity were less consistent. The R743C mutant did not enhance Grp94 expression, nor ATF6-luciferase activity. All nephrin mutants did not increase eIF2α phosphorylation, nor CHOP expression. Immunofluorescence microscopy showed WT nephrin at the plasma membrane, while the I171N and S366R mutants were perinuclear, colocalized with calnexin. Moreover, the two nephrin mutants induced aggregation of the ER chaperone, calreticulin, compared with WT. Treatment of cells with castanospermine (which reduces the interaction of nephrin with calnexin) resulted in a portion of nephrin I171N and S366R appearing at the plasma membrane. Thus, certain nephrin mutants show impaired folding in the ER, and activate the ATF6 branch of the UPR. Induction of ER chaperones may represent a cytoprotective response, allowing cells to withstand proteotoxic injury. Blocking the interaction of nephrin with calnexin results in a partial rescue of certain nephrin mutants to the plasma membrane. / La néphrine, un composant clé du diaphragme de fente, subit des modifications post-traductionnelles dans le réticulum endoplasmique (RE). Des mutations de la néphrine provoquent une protéinurie. Nous avons examiné les effets des mutations faux-sens de la néphrine sur le repliement de cette protéine dans RE, sur son trafic cellulaire et sur l'induction de réponse déplié protéines (UPR). Le type sauvage (TS) de la néphrine et les mutants d'ADNc, I171N, G270C, S366R, S724C et R743C ont été exprimés dans des cellules 293T ou cellules glomérulaires épithéliales (GECs) par une transfection transitoire. Association de néphrine avec le chaperon de RE, la calnexine, a été étudiée par la co-immunoprécipitation. Activation de l'UPR a été évaluée par l'étude de l'expression du chaperon du RE, Grp94, la phosphorylation de la sous-unité (eIF2α) du facteur 2α d'initiation de la traduction eucaryote, et l'induction de C/EBP homologue de la protéine-10 (CHOP), ainsi que l'activation du facteur-6 de la transcription (ATF6)- l'activité luciférase du gène rapporteur. Tous les mutants de la néphrine ont montré l'association accrue avec la calnexine, par rapport au TS de la néphrine. Les mutants I171N et le G270C ont augmenté l'expression du Grp94 dans les cellules 293T, ont stimulé l'ATF6-activité luciférase dans les deux cellules 293T et GECs. Néphrine S366R et S724C ont tendance à induire l'UPR, mais les changements dans le Grp94 et l'activité ATF6-luciférase ont été moins cohérents. Le mutant R743C n'a pas amélioré l'expression de Grp94, ni l'ATF6-activité luciférase. Tous les mutants de la néphrine n'ont pas augmenté ni la phosphorylation d'eIF2α, ni l'expression de CHOP. La microscopie en immunofluorescence a montré la localisation du TS néphrine à la membrane plasmique, tandis que les mutants I171N et S366R à la partie périnucléaire, colocalisés avec la calnexine. Par ailleurs, les deux mutants de néphrine ont provoqué l'agrégation du chaperon du RE, la calréticuline, par rapport au TS. Le traitement des cellules avec la castanospermine (qui réduit l'interaction de la néphrine avec la calnexine) a entraîné la localisation d'une partie des mutants I171N et S366R de la néphrine à la membrane plasmique. Ainsi, certains mutants de néphrine montrent une déficience du repliment de la protéine dans RE et activent la branche ATF6 de l'UPR. L'induction de chaperons du RE peut représenter une réponse cytoprotectrice, permettant aux cellules de résister aux lesions protéotoxique. Le blocage de l'interaction de la néphrine avec la calnexine resulte à un retour partiel au TS de certains mutants de néphrine, et donc à la localisation de néphrine à la membrane plasmique.

The ErbB2 and TGFβ signaling pathways cooperate to promote breast cancer progression and metastasis. The formation of distant metastases is the leading cause of mortality for breast cancer patients. To identify the mechanisms underlying the synergy between ErbB2 and TGFβ pathways, we transformed mammary epithelial cells with a panel of activated ErbB2 receptors, in which specific autophosphorylation sites that initiate distinct signaling pathways were mutated. We determined tyrosine residues 1226/1227 and 1253 within the ErbB2 receptor are required for TGFβ-induced migration and invasion of breast cancer cells. Using transient knockdown approaches, we subsequently demonstrated that ShcA was required downstream of these tyrosine residues for these TGFβ-mediated effects. In addition, TGFβ stimulation of ErbB2-expressing breast cancer cells with diminished ShcA expression resulted in the formation of larger and more numerous focal adhesions. These results indicated that signaling through ShcA is required for the TGFβ-induced formation of pro-migratory, dynamic focal adhesions in ErbB2-expressing cells. To investigate a requirement for ShcA signaling in the promotion of tumor progression and metastasis in vivo, we generated ErbB2-expressing breast cancer cells with a stable shRNA-mediated knockdown of ShcA expression. Diminished ShcA expression impaired tumor growth and spontaneous metastasis. Immunohistochemical staining revealed that loss of ShcA signaling results in decreased tumor proliferation and endothelial cell recruitment, coupled with an increase in apoptosis. Rescue experiments with wild-type ShcA or a panel of ShcA functional domain mutants revealed that the PTB-domain and three tyrosine residues (239/240 and 313) were necessary for TGFβ-induced migration and invasion. The Grb2 and Crk adaptor proteins have been implicated in signaling downstream of these ShcA tyrosine residues. A transient knockdown of these adaptors uncovered specific roles for Grb2 downstream of ShcA Y313 and the Crk adaptors downstream of ShcA Y239/240 for TGFβ-induced effects. An investigation of the significance of these ShcA tyrosine sites for tumor growth in vivo demonstrated that ShcA signaling through Y313 enhances tumor cell survival while signaling through ShcA Y239/240 promotes the recruitment of endothelial cells. Finally, we employed an inducible knockdown of ShcA to identify acute TGFβ-induced gene expression changes in ErbB2-expressing cells that depend on ShcA expression. We identified numerous candidate genes that were regulated by TGFβ in a ShcA-dependent manner, including the BMP antagonist, Chordin-like 1. We confirmed that reduced ShcA signaling results in the up-regulation of secreted Chordin-like 1 protein in ErbB2-expressing cells following TGFβ stimulation. Functional roles for Chordin-like 1 in ErbB2-driven tumor growth, survival and angiogenesis are currently being investigated.The work described in this thesis is the first to identify ShcA as an integral mediator underlying the cooperation between the ErbB2 and TGFβ signaling pathways in breast cancer progression and to define molecular mechanisms through which ShcA functions in this context. / Les voies de signalisation ErbB2 et TGFβ coopèrent pour favoriser la progression tumorale et la formation de métastases associées au cancer du sein. La formation de métastases appert comme la principale cause de mortalité chez les patientes atteintes du cancer du sein. Dans le but d'identifier les mécanismes impliquants les voies de signalisation ErbB2 and TGFβ, nous avons transformé des lignées de cellules mammaires épithéliales avec différentes versions activées du récepteur ErbB2, dans lesquelles chacun des sites individuels d'autophosphorylation sont mutés. Ainsi, nous avons identifié les tyrosines 1226/1227 et 1253 du récepteur ErbB2 comme nécessaires pour l'augmentation de la migration et de l'invasion observée dans les cellules de cancer de sein traitées avec TGFβ. Par la suite, nous avons démontré que ShcA agissait en aval de ces résidus tyrosines pour médier les effets associés au traitement par TGFβ. Par ailleurs, la stimulation par TGFβ de cellules de cancer du sein exprimant ErbB2 et dans lesquelles l'expression de ShcA était atténuée se traduisait par la formation d'adhésions focales plus larges et plus nombreuses. Ensemble, ces résultats suggèrent qu'une voie de signalisation impliquant ShcA est nécessaire pour la formation d'adhésions focales pro-migratoires en réponse au traitement par TGFβ dans les cellules exprimant ErbB2. Afin de déterminer un rôle potentiel de ShcA pour favoriser la progression tumorale et la formation de métastases in vivo, nous avons généré des lignées cellulaires de cancer du sein dans lesquelles le niveau d'expression de ShcA était diminué de façon stable. Nous avons observé que la diminution du niveau d'expression de ShcA se traduisait par une réduction de la croissance tumorale et la formation de métastases. Par marquage immunohistochimique, nous avons observé que la perte d'expression de ShcA s'accompagnait d'une réduction de la prolifération tumorale et du recrutement des cellules endothéliales associée à une augmentation de l'apoptose. Des expériences de réexpression de ShcA de type-sauvage ou de versions mutantes des différents domaines fonctionnels ont montré que le domaine PTB ainsi que 3 résidus tyrosines (239/240 et 313) étaient impliqués dans l'augmentation de la migration et de l'invasion induite par traitement par TGFβ. Les protéines adaptatrices Grb2 et Crk peuvent signaler en aval de ces trois résidus tyrosines. Une diminution du niveau d'expression de ces différentes protéines adaptatrices a révélé un rôle joué par Grb2 en aval de Y313 de ShcA ainsi qu'un rôle de Crk en aval de Y239/240 de ShcA pour favoriser les effets associés au traitement des cellules par TGFβ. Une analyse in vivo a démontré que la signalisation utilisant Y313 favorisait la survie des cellules tumorales alors que la signalisation utilisant Y239/240 favorisait le recrutement des cellules endothéliales.Finalement, en réduisant l'expression inductible de ShcA nous avons identifié des gènes dont l'expression, qui dépend de l'expression de ShcA, est modifiée en réponse au traitement par TGFβ de cellules de cancer de sein exprimant ErbB2. Ainsi, nous avons identifié plusieurs candidats dont Chordin-like 1, un antagoniste des BMP. Nous avons par la suite confirmé que la réduction d'expression de ShcA se traduisait par une augmentation de la forme secrétée de la protéine Chordin-like 1 dans des cellules exprimant ErbB2 stimulées par TGFβ. Les rôles fonctionnels joués par Chordin-like 1 dans la formation, la croissance, la survie ou l'angiogenèse associées aux tumeurs exprimants ErbB2 est actuellement sous investigation.L'ouvrage présenté dans cette thèse est le premier à identifier ShcA comme étant un médiateur «integral » de la collaboration de signalisation intracellulaire entre ErbB2 et TGF-β lors de la progression du cancer du sein et qui définie le mécanisme moléculaire par lequel ShcA entreprend ses fonctions dans cette situation.

Breast cancer is the most frequently diagnosed and the second leading cause of cancer deaths in Canadian women. The most devastating and deadly feature of the disease is the emergence of metastases. Breast cancer most commonly metastasizes to bone, often leading to a significantly decreased quality of life in affected patients. Despite progress in understanding the underlying molecular biology of breast tumors that relapse to bone, to date there are no therapies capable of curing the disease. Hence, it is essential to gain a more in-depth knowledge of the molecular mechanisms that underlie the emergence and growth of breast cancer skeletal metastases. Consequently, it was attempted to: 1) examine the efficacy of targeting a known pathway important for breast cancer metastasis to bone, 2) identify novel mediators of this process and 3) develop a stratification tool capable of identifying patients with breast cancer that possesses a high likelihood of spreading to bone. Transforming growth factor-beta (TGF-β) signaling is a potent modulator of the invasive and metastatic behavior of breast cancer cells. The work in this thesis demonstrates that expression of a TGF-β ligand trap, which neutralizes TGF-β1 and TGF-β3 in breast cancer cells, diminished their outgrowth in bone and reduced the severity of osteolytic lesion formation. It is further shown that a reduction or loss of host-derived TGF-β1 reduced the incidence of breast tumor outgrowth in the skeleton. Moreover, tumor cells capable of growing within the bone of a TGF-β1 deficient host up-regulated expression of all three TGF-β isoforms within the tumor cells themselves, effectively bypassing the host-deficiency. Next, a gene discovery approach was undertaken to identify novel candidate mediators of breast cancer skeletal metastasis. Invasive breast epithelium was selectively isolated by laser capture microdissection (LCM) performed on bone metastases and primary tumors from patients displaying breast cancer with subsequent recurrence to the skeleton. In this search, ABCC5 was found to be overexpressed in osseous metastases compared to primary mammary tumors metastatic to bone. Furthermore, this protein was detected at substantially higher levels in human and mouse breast cancer cells, which metastasize to bone in animal models. Importantly, removal of this protein from these cells resulted in their decreased ability to induce osteolytic bone lesions, which was correlated with a decreased recruitment of osteoclasts, cells responsible for the bone resorption process. Finally, the molecular changes occurring within the primary breast tumor were investigated in an attempt to identify a prognostic bone metastatic signature. Gene expression profiling was performed on estrogen receptor (ER)-positive primary breast tumors metastastatic to bone and breast cancers, which spread to soft tissue. A 25-gene signature was derived from the top 100 differentially expressed probes and was found to be capable of discriminating breast tumors metastatic to bone from cancers recurring to visceral sites in an independent gene expression dataset. / Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes canadiennes. La caractéristique la plus dramatique et la plus mortelle de cette maladie est l'apparition de métastases. Le cancer du sein métastase le plus souvent au niveau des os, conduisant fréquemment à une qualité de la vie sensiblement diminuée chez les patients atteints. Malgré les progrès réalisés dans la compréhension de la biologie moléculaire sous-jacente des tumeurs du sein qui colonisent l'os, il n'existe, à ce jour, aucun traitement capable de guérir cette affection. Il est ainsi primordial d'acquérir une connaissance plus approfondie des mécanismes moléculaires qui sont à l'origine de l'émergence et de la croissance des métastases du cancer du sein au niveau du squelette. Par conséquent, il fut envisagé: d'examiner l'efficacité du ciblage d'une voie connue, importante pour que le cancer du sein puisse métastaser au niveau de l'os; d'identifier les nouveaux médiateurs de ce processus et de développer un outil de discrimination capable d'identifier les patients atteints d'un cancer du sein qui possède une forte probabilité de dissémination à l'os. La voie de signalisation du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) est un puissant modulateur du comportement invasif et métastatique des cellules cancéreuses du sein. Le travail présenté dans cette thèse démontre que l'expression d'une molécule leurre du ligand du TGF-β, qui neutralise le TGF-β1 et le TGF-β3 dans les cellules cancéreuses du sein, réduit leur développement dans les os et ainsi que la gravité de la formation des lésions ostéolytiques. Il est également démontré qu'une réduction, ou une perte, de l'hôte dérivé du TGF-β1 réduit la fréquence d'apparition d'une excroissance de la tumeur mammaire au niveau du squelette. Par ailleurs, les cellules tumorales capables de croître au sein d'un tissu osseux hôte déficient en TGF-β1 ont montré une augmentation de l'expression des trois isoformes du TGF-β dans les cellules tumorales elles-mêmes, court-circuitant ainsi efficacement cette carence de l'hôte. Une approche de découverte de gènes a été ensuite entreprise pour identifier des nouveaux médiateurs candidats des métastases squelettiques des cancers du sein. L'épithélium invasif du sein a été sélectivement isolé par microdissection à capture laser (LCM), et ceci a été réalisé sur les métastases osseuses et des tumeurs primaires de patientes présentant un cancer du sein avec récidive ultérieure au niveau du squelette. Dans cette recherche, ABCC5 fut montré comme étant surexprimé dans les métastases osseuses, par rapport à des tumeurs primaires mammaires métastasant au niveau l'os. De plus, cette protéine a été détectée à des niveaux nettement plus élevés dans des cellules cancéreuses mammaires d'origine humaine et murine qui métastasent dans l'os dans des modèles animaux. Une autre donnée importante fut que la suppression de cette protéine dans les cellules concernées conduisit à une réduction de leur capacité à induire des lésions osseuses ostéolytiques, ce qui fut corrélée avec une diminution du recrutement d'ostéoclastes, les cellules responsables du processus de résorption osseuse. Pour terminer, les changements moléculaires qui se produisent au sein de la tumeur primaire du sein ont été étudiées dans le but d'identifier une signature pronostiquant des métastases osseuses. Un profilage de l'expression génique a été réalisé sur les tumeurs mammaires primaires positives pour le récepteur aux œstrogènes (ER) et métastasant à l'os mais aussi sur les cancers mammaires, qui se propagent aux tissus mous. Une signature de 25 gènes a été sélectionnée à partir des 100 meilleures sondes exprimées différentiellement et a montré sa capacité à discriminer d'un coté les tumeurs du sein métastasant à l'os et de l'autre les cancers récurrents sur des sites viscéraux et ceci à partir d'un ensemble de données sur l'expression de gènes indépendants.

Gene transcription is highly regulated by proteins called transcription factors, which bind to specific DNA sequences, and recruit a plethora of cofactors that directly modify the chemical composition of N-terminal histone tails or recruit enzymes that do so. These modifications alter the structure of chromatin, and can prime it for or render it refractory to transcription. Many of these recruited cofactors, termed transcriptional coactivators or corepressors, can interact with several classes of transcription factors. Initially characterized as an inhibitor of nuclear receptor-mediated transactivation, Ligand-dependent CoRepressor (LCoR) represses transcription through recruitment of specific C-terminal binding proteins (CtBPs) and histone deacetylases (HDACs) via defined domains. We were interested in determining whether LCoR also serves as a coregulator of other classes of transcription factors. Using yeast two-hybrid screens with the open reading frame of LCoR as bait, we found novel interactions with the transcription factor Krüppel-like factor 6 (KLF6) and another transcriptional coregulator KRüppel-Associated Box (KRAB)-associated protein 1 (KAP-1). KLF6 may act as a tumour suppressor in certain malignancies, while KAP-1 is a corepressor that functions through many zinc finger transcription factors. Functional characterization of these interactions revealed that LCoR regulates the expression of the genes cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A) and cadherin 1 (CDH1) in specific prostate cancer cells via KLF6, and growth arrest and DNA-damage-inducible alpha (GADD45A) and fibroblast growth factor 2 (FGF2) in specific breast cancer cells through KAP-1. CDKN1A expression is regulated by the hormone insulin-like growth factor 1 (IGF-1) in certain cell types, and levels of IGF-1 and CDKN1A are elevated in prostate cancer. We found that LCoR and CDKN1A levels were enhanced in prostate cancer tissue and in IGF-1 treated prostate cancer cells. Additionally, the transcriptional response of a complex composed of KLF6 and LCoR may be altered by IGF-1 as we found that treatment of prostate cancer cells transiently overexpressing KLF6 and LCoR with IGF-1 abrogated their repression of a reporter gene. Hence, IGF-1-mediated transcriptional expression of CDKN1A may occur through KLF6 and LCoR and have implications for prostate cancer development. Similarly, the expression of FGF2 is frequently lost and associated with a more malignant phenotype in breast cancer. Our results show that a transcriptional complex composed of LCoR, KAP-1, and the transcription factor ZBRK1 suppresses the expression of the FGF2 gene in breast cancer cells, which enhanced cell viability. The identification of this transcriptional silencing complex provides a mechanism for the lack of expression of FGF2 in breast cancer. The work presented in this thesis contains four major contributions to further the understanding of the biological function of LCoR. In addition to identifying novel molecular interactions with (1) KLF6 and (2) KAP-1, which illustrate that LCoR can function in transcription independent of nuclear receptors, the functional characterization of these interactions revealed potential roles for LCoR in (3) breast and (4) prostate tumour development. / La transcription des gènes est hautement régulée par des protéines qu'on appelle facteurs de transcription. Ces facteurs se lient à des séquences d'ADN précises et recrutent de nombreux cofacteurs qui modifient directement la composition chimique de l'extrémité N terminale des histones ou recrutent des enzymes qui peuvent le faire. Cela entraîne une modification de la structure de la chromatine afin d'induire la transcription ou l'inhiber. De nombreux cofacteurs, appelés coactivateurs ou corépresseurs, peuvent interagir avec plusieurs classes de facteurs de transcription. Ligand-dependent Corepressor (LCoR), caractérisé initialement comme inhibiteur de la transactivation par les récepteurs nucléaires, réprime la transcription en recrutant C-terminal binding proteins (CtBPs) et des histones désacétylases (HDACs) spécifiques via des domaines définis. Nous nous sommes intéressés à déterminer si LCoR peut aussi agir comme corégulateur d'autres classes de facteurs de transcription. Au cours des travaux présentés ici, un criblage par double hybride chez la levure, utilisant le cadre ouvert de lecture de LCoR comme appât, a permis de découvrir de nouvelles interactions avec le facteur de transcription Krüppel-like transcription factor 6 (KLF6) et avec un autre corégulateur transcriptionnel, Krüppel-Associated Box (KRAB)-associated protein 1 (KAP-1). Il a été déterminé que le facteur KLF6 serait un suppresseur de certaines tumeurs malignes et que la protéine KAP-1 est un corépresseur agissant par le biais de nombreux facteurs de transcription contenant des domaines doigt de zinc. La caractérisation fonctionnelle de ces interactions a révélé que le corépresseur LCoR régule l'expression des gènes cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A) et cadherin 1 (CDH1) dans des cellules spécifiques du cancer de la prostate via le facteur KLF6, et l'expression des gènes growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha (GADD45A) et fibroblast growth factor 2 (FGF2) dans des cellules spécifiques du cancer du sein via la protéine KAP-1. L'expression du gène CDKN1A est régulée par l'hormone insulin-like growth factor 1 (IGF 1) dans certains types de cellules, et des taux élevés de cette hormone et du gène CDKN1A ont été observés dans le cas du cancer de la prostate. Nous avons trouvé des taux élevés de LCoR et CDKN1A dans des tissus du cancer de la prostate et des cellules du cancer de la prostate traitées avec IGF-1. De plus, la réponse transcriptionelle d'un complexe composé par KLF6 et LCoR pourrait être modifié par IGF-1, car nous avons montré que le traitement de cellules du cancer de la prostate surexprimant transitoirement KLF6 et LCoR avec IGF-1 aboli la répression d'un gène indicateur. Par conséquent, l'expression de CDKN1A par IGF-1 pourrait passer par KLF6 et LCoR et avoir des conséquences sur le développement du cancer de la prostate. De même, des études précédentes ont déterminé que l'expression du gène FGF2 est fréquemment perdue et associée à un phénotype plus malin du cancer du sein. Un complexe transcriptionnel composé de LCoR, KAP-1 et du facteur de transcription ZBRK1 réprime l'expression du gène FGF2 et modifie la viabilité des cellules du cancer du sein. L'identification de ce complexe de répression transcriptionnelle présente un mécanisme pour expliquer l'absence du gène FGF2 dans le cancer du sein.La présente thèse est caracterisée par la découverte de quatre contributions majeures permettant de mieux comprendre la fonction biologique du corépresseur LCoR. En plus d'avoir permis l'identification de nouvelles interactions moléculaires avec (1) KLF6 et (2) KAP-1, illustrant que LCoR peut agir sur la transcription indépendamment de récepteurs nucléaires, la caractérisation fonctionnelle de ces interactions a révélé des rôles potentiels du corépresseur LCoR dans le développement des cancers du (3) sein et de la (4) prostate.

Inhibitors of translation have proven invaluable in delineating the overall mechanism of protein synthesis. Unlike inhibitors of prokaryotic protein synthesis, the therapeutic development of drugs that directly interfere in the eukaryotic mRNA translation for treatment of human disease has remained largely unexplored. To begin to investigate this possibility and expand the current repertoire of compounds that affect eukaryotic translation, we have undertaken several different experimental screening approaches, two of which are described below and will form the basis of this thesis. In chapter 2, we performed a multiplexed high-throughput chemical screen to identify novel inhibitors of eukaryotic protein synthesis. We identified intercalators as having unique biological properties in our assays: at high concentrations they behave like elongation inhibitors and blocked the peptidyl-transferase activity of the ribosome, while at lower concentrations they preferentially block HCV-driven, cap-independent but not cap-dependent translation. This activity appeared to be due to their ability to block the innate affinity of the HCV IRES for the 40S ribosomal subunit. Moreover, a number of intercalator-based peptide-conjugates (which can chemically "thread" through and bind strands of nucleic acid in a sequence-specific manner) were tested and one, PAC-6, was found to be a selective inhibitor of HCV-dependent initiation.In chapter 3, we performed a shRNA-based drop-out screen to identify novel genes and pathways that could reverse resistance to ABT-737 treatment. Using genetically-defined Arf-/-Eµ-myc lymphoma cells, pools of shRNAs targeting known factors and regulators of protein synthesis were retrovirally introduced and genomic DNA collected over the course 10 days for both vehicle and ABT-737 treated cohorts. Following deep sequencing analysis of shRNA abundance, several constructs were identified that were selectively depleted only in the presence of ABT-737. Of them, two shRNAs against the RNA/DNA helicase, DHX9, validated. Although knockdown of DHX9 was found to sensitize both mouse and human cells to ABT-737 treatment, it did so without altering Mcl-1 levels. Instead, loss of DHX9 appeared to activate a p53-dependent apoptotic program which was found to be both necessary and sufficient for the ABT-737-shDHX9 synthetic lethal interaction. / La compréhension du mécanisme global de la synthèse protéique a rapidement progressée en majeur partie grâce a l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques qui bloquent ce processus. Contrairement aux inhibiteurs de la synthèse protéique procaryote, l'utilisation de molécules pouvant moduler la traduction des ARNm eucaryotes dans un but thérapeutique reste encore largement sous-évalué. Afin d'étudier cette possibilité et d'élargir le répertoire de composés chimiques pouvant interférer avec la synthèse protéique eucaryote, nous avons effectué plusieurs criblage différents. Deux d'entre eux sont décrits plus bas et formeront les fondements de cette thèse.Tel que décrit dans le chapitre 2, nous avons tout d'abord effectué un criblage à haut débit de molécules afin d'identifier de nouveaux inhibiteurs de la synthèse protéique eucaryote. Ceci nous a permis de découvrir que les molécules qui peuvent s'intercaler dans les structures en double brin des acides nucléiques possèdent des propriétés uniques d'inhibition de la traduction. En effet, à hautes concentrations, elles se comportent exactement comme des inhibiteurs de l'élongation et bloquent l'activité peptidyl-transférase des ribosomes, alors qu'à faibles concentrations, elles bloquent préférentiellement la traduction cap-indépendant sous contrôle de l'IRES de HCV sans affecter la traduction dépendante du cap. Cette activité semble être due à la capacité des molécules d'interférer avec la liaison de la sous-unité 40S à l'IRES de HCV. De plus, certaines molécules qui combinent une portion intercalatrice et une portion peptidique (connue pour pouvoir sonder et se lier spécifiquement des brins d'acides nucléiques de manière spécifique) ont été testées et une d'entre elles, nommé PAC-6, permet l'inhibition spécifique de l'initiation de la traduction sous contrôle de l'IRES de HCV.Dans le chapitre 3, nous avons effectué un criblage d'une librairie de shRNA afin d'identifier des gènes ou des voies de signalisation qui peuvent inverser la résistance de cellules à ABT-737. Des cellules de lymphomes Arf-/-Eµ-Myc génétiquement modifiées ont été infecté avec un groupe de shRNAs ciblant des gènes connus pour contrôler tous les aspects de la synthèse protéique et avons isolé l'ADN génomique de ces cellules après 10 jours de traitements avec, soit le véhicule, soit avec ABT-737. Suite à l'analyse de l'abondance relative des shRNAs par séquençage de nouvelle génération, nous en avons identifié plusieurs dont la représentation diminue sélectivement en présence d'ABT-737. Parmi ceux-ci, deux shRNAs uniques, ciblant l'hélicase à ARN/ADN DHX9 ont été identifiés et par la suite confirmés indépendamment. La diminution des niveaux de DHX9 permet la sensibilisation des cellules murines ou humaines à ABT-737 sans toutefois altérer les niveaux de Mcl-1. Plutôt, la perte de DHX9 semble activer un programme d'apoptose dépendant de p53 qui est nécessaire et suffisant pour cette interaction synthétique létale entre ABT-737 et DHX9.

Acts of violence account for 1.43 million deaths worldwide annually and individual acts of aggression account for the majority of these lives lost. Longitudinal studies on the development of physical aggression have found that while children start using physical aggression very early in life, the majority of them learn to use alternative behaviors during childhood and adolescence. The challenge is that a minority of children (3-7%) maintain chronic levels of physical aggression. While we know that genetic factors and early social experiences are involved in the development of aggression, the main question is "What is the mechanism that registers the response to early life adversity as well as stores life-long and system-wide programs of aggressive phenotypes?" Evidence in animals and in humans has emerged suggesting that epigenetic mechanisms, such as DNA methylation, are responsive to adverse environments and are maintained until adulthood. Epigenetic mechanisms are known to serve as long-lasting regulators of gene expression programs. This doctoral thesis delineates the effects of early adversity in a rhesus macaque model of maternal deprivation on DNA methylation patterns in the prefrontal cortex (PFC) and in T cells to compare the central and the peripheral epigenetic marks of social experience. Moreover, it determines the associations between DNA methylation patterns in T cells and childhood physical aggression in men. Whole genome methylation analyses using methylated DNA immunoprecipitation followed by hybridization to genome-wide promoter microarrays were used to assess the DNA methylation profiles in adult monkeys who were randomized into differential rearing groups (maternal versus surrogate-peer rearing) in their first year of life. We show that differential rearing leads to differential DNA methylation profiles in both the PFC and T cells. These differentially methylated promoters tend to cluster by chromosomal region and by gene function in both tissues, suggesting that the response to early adversity is genome- and system-wide. These results support the use of peripheral tissues in human studies examining epigenetic and phenotypic consequences of social adversity. We then used peripheral blood samples from adult men who were on a chronic physical aggression trajectory from childhood to adolescence (CPA) and compared them to a control group from the same background. ELISA analysis of plasma levels of 10 inflammatory cytokines identified that men from the CPA group had lower plasma levels of five cytokines (IL-1α, IL-4, IL-6, IL-8 and IL-10). Moreover, interrogation of the state of DNA methylation across the entire genomic loci containing these five cytokines and cytokine regulator genes (NFkB1, NFAT5 and STAT6) revealed significant associations between differential DNA methylation and CPA. Using whole genome methylation analysis in these men from either CPA or control groups, we revealed associations between physical aggression and DNA methylation in specific gene promoters that tended to cluster into distinct chromosomal regions as well as in relevant gene function categories known to be involved in aggression. In summary, my study demonstrates that adverse social experiences and adverse social phenotypes are associated with altered DNA methylation patterns across the genome. My findings are consistent with the hypothesis that DNA methylation is a mechanism that registers the response to early life adversity in the genome and has a long-lasting association with aggressive phenotypes in humans. Moreover, the finding of DNA methylation alterations in relevant immune genes and immune signaling pathways further supports the hypothesis that the epigenetic programs associated with aggression are not limited to the brain and occur in the immune system as well. This is consistent with several studies that indicate peripheral immune components playing a role in regulating behavioral states. / Les actes de violence représentent 1,43 millions de morts par an dans le monde. Des études longitudinales sur le développement de l'agressivité physique (AP) ont montré que bien que les enfants commencent à se servir de l'AP très tôt dans leur vie, la majorité d'entre eux apprennent à utiliser des comportements alternatifs au cours de l'enfance. Le problème est qu'une minorité d'enfants (3-7%) maintiennent des niveaux d'AP élevés. Bien que nous sachions que les facteurs génétiques ainsi que les premiers contacts sociaux sont impliqués dans le développement de l'AP, la question principale demeure:«Quel sont les mécanismes qui sont capable d'enregistrer la réponse à l'adversité social à l'enfance, de la conserver durant la vie et de programmer les phénotypes agressifs?» Des évidences chez les animaux et l'homme ont émergé suggérant que des mécanismes épigénétiques, tels que la méthylation de l'ADN, réagissent aux environnements adverses et se maintiennent jusqu'à l'âge adulte. Les mécanismes épigénétiques sont aussi connus pour réguler les programmes d'expression génique. Cette thèse de doctorat détermine les effets de l'adversité au début de la vie sur les profils de méthylation de l'ADN du cortex préfrontal (CPF) et des cellules T afin de comparer les marques épigénétiques centrales et périphériques des contacts sociaux chez le macaque rhesus. De plus, elle détermine les associations entre les profils de méthylation de l'ADN dans les cellules T et l'AP à l'enfance chez l'homme. Des analyses de la méthylation du génome entier utilisant l'immunoprécipitation de l'ADN méthylé suivie par l'hybridation sur micropuces de promoteurs, ont servie à mesurer les profils de méthylation de singes adultes qui ont été randomisés dans des groupes d'élevage différents (élevé par leur mère versus par des pairs). Nous montrons que les différentes conditions d'élevage conduisent à des profils de méthylation différents à la fois dans le CPF et dans les cellules T. Ces promoteurs différentiellement méthylés tendent à être regroupés par région chromosomique et par fonction génique dans les deux tissus, suggérant que la réponse à l'adversité se produit à une échelle génomique et systémique. Nous avons ensuite utilisé des échantillons de sang provenant d'hommes adultes qui étaient sur une trajectoire d'AP chronique de l'enfance à l'adolescence (APC) et nous les avons comparés à un groupe control ayant les mêmes origines. L'analyse du niveau plasmatique de 10 cytokines par une méthode immuno-enzymatique indique que les hommes du groupe APC ont des niveaux plasmatiques plus faibles pour cinq cytokines (IL-1α, IL-4, IL-6, IL-8 et IL-10). L'interrogation du niveau de méthylation de l'ADN des loci génomiques de ces cinq cytokines et de leurs régulateurs révèle des associations significatives entre la méthylation et l'APC. En utilisant des analyses génomiques de la méthylation de l'ADN chez ces hommes, nous avons révélé des associations entre l'AP et la méthylation dans plusieurs promoteurs. Ces promoteurs tendent à se regrouper dans des régions chromosomiques distinctes ainsi que dans des catégories fonctionnelles déjà connues pour être impliquées dans l'AP. En résumé, mon étude doctorale démontre que les expériences sociales et les phénotypes adverses sont associés à des profils de méthylation de l'ADN altérés au travers du génome. Mes données soutiennent l'hypothèse que la méthylation de l'ADN est un mécanisme qui enregistre la réponse à l'adversité au début de la vie et qu'il s'associe de façon continue avec les phénotypes d'agressivité chez l'homme. De plus, la découverte que ces altérations surviennent à l'intérieur de gènes et de fonctions du système immunitaire supporte l'hypothèse que les programmes épigénétiques associés avec l'AP ne sont pas limités au cerveau mais se produisent également dans le système immunitaire. Ceci est cohérent avec plusieurs études qui indiquent que le système immunitaire joue un rôle dans la régulation des comportements.

Cancer cell metabolism is often characterized by a shift from an oxidative to a glycolytic bioenergetic pathway, a phenomenon known as the Warburg effect. miR-378* is embedded within PPARGC1b which encodes PGC-1beta, a transcriptional regulator of oxidative energy metabolism. We show that miR-378* acts as a molecular switch involved in the orchestration of the Warburg effect in breast cancer cells via interference with the PGC-1beta/ERRgamma bioenergetics transcriptional pathway. Moreover, we identify that the expression of miR-378* is regulated by the breast cancer oncogene ERBB2, and that its expression in human breast cancer correlates with disease progression. Furthermore, we uncover that CAMKK2, the upstream kinase of the cellular energy sensor AMPK, is a functional direct target of miR-378* in breast cancer cells, through which miR-378* represses AMPK pathway activity.We have identified that modulation of the relative availabilities of the Estrogen-Related Receptor (ERR) isoforms ERRalpha and gamma is capable of inducing the Warburg effect. We then turned to an in-vivo system to further investigate the role of ERR in breast cancer. We found that the absence of ERRalpha delays ERBB2-induced mammary tumor onset but accelerates disease progression after onset. Moreover, tumor bearing ERRalpha KO mice exhibit signs of cancer cachexia, including failure to maintain normal body weight, heightened inflammation, and metabolic derangements such as elevated serum amino acids, molecular markers in the skeletal muscle and adipose tissue, and reduced adipose mass. Together, we identify that systemic ablation or inhibition of ERRalpha may render the host more susceptible to cancer cachexia, a disease characterized by elevated inflammation, metabolic derangements and tissue atrophy. The absence of mir-378 mouse models limited such in-vivo study of the functionally-related miRNA. Therefore, we produced mir-378 conditional and total knockout mouse models, which revealed thermogenesis-related phenotypes in the brown adipose tissue (BAT). / Le métabolisme des cellules cancéreuses est souvent caractérisé par une utilisation préférentielle de la voie de la glycolyse, au détriment de la phosphorylation oxydative, un phénomène connu sous le nom d'effet de Warburg. Le microARN miR378* est situé dans le gène PPARGC1b, qui code pour la protéine PGC-1beta, un régulateur transcriptionel du métabolisme oxidatif. Nous avons démontré que le miR378*, en interférant ERRgamma, est impliqué dans l'orchestration de l'effet de Warburg dans les cellules tumorales du sein. De plus, nous avons identifié que l'expression du miR378* est régulée par l'oncogène ERBB2 et corrèle avec l'agressivité du cancer du sein chez l'humain. Nous avons aussi établi que CAMKK2 est une cible directe du miR378* dans les cellules cancéreuses du sein, via laquelle miR378* réprime l'activité d'AMPK.Nous avons observé que la disponibilité relative des isoformes α et γ du récepteur associé au récepteur des estrogènes (ERR) était capable d'induire l'effet de Warburg. Ceci nous a amené à explorer le rôle d'ERR dans le développement du cancer du sein. Nous avons observé, dans un modèle de tumeur mammaire, que l'absence d'ERRalpha ralentissait l'apparition du cancer, mais augmentait la vitesse de la croissance tumorale une fois la tumeur établie. De plus, les souris knock-out pour ERRalpha ayant une tumeur montre des signes cachexie, incluant une perte de poids, la présence d'inflammation et des désordres métaboliques tels qu'un niveau élevé d'acides aminés dans le sérum et une réduction de la masse adipeuse. Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que l'inhibition d'ERRalpha rend les animaux plus susceptible à la cachexie cancéreuse, une maladie caractérisée par un niveau élevé d'inflammation, des dérangements métaboliques et une atrophie tissulaire.Finalement, nous avons développé un modèle de souris knock-out, total ou conditionnel, pour le mir378. Nos résultats suggèrent notamment une implication pour le mir378 dans des tissus adipeux bruns.

Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) genomic RNA (gRNA) dimerization appears essential for viral infectivity via, among others, facilitating gRNA strand exchange during reverse transcription, but the gRNA dimerization mechanisms remain largely unknown. What is well known about gRNA dimerization is that the dimerization process requires the proteolytic processing of Pr55gag polyprotein into smaller products. If the gag processing is blocked experimentally, it will lead to the formation of low-mobility dimers which is termed immature dimers, as apposed to high-mobility dimers (mature dimers) formed in the wild type HIV-1. Two kinds of dimers have been isolated from HIV-1 particles: Immature dimers isolated from grown-up (≥ 24h old) protease-inactive (PR-in) and from newly released (0-15min old) virions; mature dimers isolated from grown-up wild type and some mutants of HIV-1. My first research project is to identify the roles of NC-containing proteins including Gag polyprotein, NCp15, NCp9, and NCp7 in HIV-1 gRNA dimerization. I showed for the first time that the formation of immature genomic RNA dimers (igRNAds) in protease-inactive (PR-in) HIV-1 is protein-dependent (Gag-dependent, not spontaneous) and the nucleocapsid (NC) portion of the Gag polyprotein chaperones the formation of igRNAds. Based on the effect of 19 mutations studied in grown-up PR-in HIV-1, I showed that the proximal zinc finger and the linker sequences but not the distal zinc finger of the nucleocapsid protein play critical roles in the formation of igRNAds in PR-in HIV-1. However, the basic nature of the basis residues of the N-terminus and the linker are not involved in igRNA dimer formation. Other maturation products of NC, i.e. NCp15, NCp9, and NCp7, have differential roles in HIV-1 gRNA dimerization. Newly released p9 HIV-1 contains much lower level of immature dimers compared to NCp15 and NCp7 HIV-1 and the rate of accumulation of immature dimers is similar to PR-in HIV-1. But, NCp9 is as efficient as NCp7 in the transformation of immature dimers to mature dimers. On the other hand, NCp15 like NCp7 directs the fast accumulation of immature dimers in newly released HIV-1. Nonetheless, NCP15 like Gag polyprotein is quite inefficient in the maturation process, i.e. the transformation of immature dimers to mature dimers. To summarize: NCp7 is efficient in fast formation of immature gRNA dimers and the maturation process; NCp15 is only efficient in the formation of fast immature dimers; NCp9 is efficient in the transformation process but not in the fast formation of immature dimers. The Dimer Initiation Site (DIS) is a dimerization initiation site for all immature gRNA dimers, irrespective of their mechanism of formation. In the second part of my thesis I studied the role of the 5' transactivation response element (TAR) in HIV-1 gRNA dimerization. By making mutations in the upper TAR stem-loop structure including two palindrome sequences, I showed that this region contributes enormously to HIV-1 gRNA dimerization. However, gRNA dimerization was not restored in the compensatory mutants of both palindromes, suggesting that TAR-TAR kissing mechanism is not involved in gRNA dimerization. By jointly mutating TAR and deleting DIS, I showed that the TAR-dependent dimerization is not associated with the DIS. For the first time I showed that the UCU bulge of TAR is very important for HIV-1 gRNA dimerization and we conclude that the role of large TAR mutations in gRNA dimerization is entirely assumed by the TAR bulge. / La dimérization de l'ARN génomique (gRNA) du Virus d'Immunodéficience Humaine 1 (VIH-1) est essentiel pour un virus infectieux parce que, entre autres, elle facilite l'échange de brins pendant la transcription inverse. On sait déjà que le processus de dimérisation requiert au moins un certain degré de maturation protéolytique de la polyprotéine Pr55gag, une protéine dont la maturation progressive génère les protéines NCp15, NCp9 et, finalement, NCp7. J'ai d'abord identifié les rôles respectifs de Pr55gag, NCp15, NCp9 et NCp7 dans la dimérisation de l'ARN génomique (ARNg). J'ai montré que la formation de dimères immatures du gRNA (igRNAds) est dépendante de Gag chez les VIH-1 avec une protéase-inactive (PR-in), et que la portion nucleocapside (NC) de Pr55gag est essentielle à cette forme de dimérisation. Me basant sur les effets de 19 mutations étudiées chez les VIH-1 PR-in adultes (vieux de 12 h et plus), j'ai montré que le doigt de zinc proximal et la séquence du linker du NC, mais non son doigt de zinc distal, jouent un rôle critique dans la formation de igRNAds chez les VIH-1 PR-in. Cependant, la nature basique des résidus du N-terminus et du linker ne contribue pas à la formation de igRNAds. Les autres produits de maturation de NC, c.-à-d. NCp15, NCp9 and NCp7, jouent des rôles différentiels dans la dimérisation de l'ARN du VIH-1. Les VIH-1 p9 fraichement sortis contiennent un très faible niveau de dimères immatures par rapport aux VIH-1 p15 et p7, et le taux d'accumulation des ces dimères ressemble à celui qui est observé chez les VIH-1 PR-in. Mais NCp9 est aussi efficace que NCp7 dans la maturation des dimères immatures. Par ailleurs, NCp15 forme des dimères immatures aussi rapidement que NCp7, mais est incapable de les transformer en dimères matures. En résumé: NCp7 est efficace à la fois en formation rapide et en maturation des dimères immatures; NCp15 est efficace uniquement en formation de dimères immatures; NCp9 est efficace en maturation, mais pas en formation de dimères immatures. Le DIS est le site d'initiation de la dimérisation de tous les dimères immatures, peu importe leur mécanisme de formation. Dans la 2ème partie de ma thèse, j'ai étudié le rôle de l'ARN TAR 5' (transactivation response element) dans la dimérisation du VIH-1. En introduisant des mutations dans le haut du TAR tige-boucle, qui contient deux séquences palindromiques, j'ai montré que cette région contribue énormément à la dimérisation de l'ARNg du VIH-1. Cependant, la dimérisation n'a pas été rétablie par des mutations compensatoires dans chacun de ces 2 palindromes, suggérant qu'un mécanisme de TAR-TAR "kissing" n'est pas significatif pendant la dimérisation de l'ARNg. En mutagénisant TAR et en supprimant le DIS, j'ai montré que les mutations dans TAR et dans le DIS avaient des rôles indépendants durant la dimérisation. Pour la première fois, j'ai montré que la boucle UGU de TAR joue un rôle très important dans la dimérisation de l'ARNg, et je conclus que le rôle de TAR dans la dimérisation de l'ARNg est entièrement assumé par la boucle du TAR.