Infection with human T cell Leukemia virus (HTLV-1) can cause Adult T-cell Leukemia (ATL) or the neurological disorder HTLV-1-Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP). Although the majority of HTLV-1--infected individuals remain asymptomatic carriers (AC) during their lifetime, 2-5% will develop either ATL or HAM/TSP. The factors that determine HTLV-1 pathogenesis remain elusive, and therefore represent a serious obstacle in the establishment of effective therapies for HTLV-1-associated diseases. / Using gene expression profiling of CD4+ T-lymphocytes isolated from HTLV-1-infected individuals, we identified candidate genes differentially regulated in HTLV-1-associated diseases. Of particular interest, SOCS1 was up-regulated in HAM/TSP and AC patients -- but not in ATL. SOCS1 positively correlated with HTLV-1 mRNA in HAM/TSP patient samples. SOCS1-mediated degradation of IRF3 - inhibited antiviral signaling during HTLV-1 infection. Our study reveals a novel evasion mechanism utilized by HTLV-1 which leads to increased retroviral replication, without triggering an IRF3-dependent interferon response. Thus, targeting SOCS1 could represent a potential new approach to enhance the therapeutic potency of IFN-alpha/beta treatment in HAM/TSP disease. / Although treatment of hematological malignancies has improved considerably, this has not benefited ATL patients, as they are completely refractory to conventional chemotherapeutic regimens. Oncolytic viruses, such as Vesicular stomatitis virus (VSV), have emerged as a potential treatment for cancer. Here we show that in vitro VSV infection induced significant oncolysis in highly proliferating primary ATL cells, but not in primary Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) cells which are arrested in the G0 phase. As chronic activation and proliferation is characteristic of ATL cells, we examined the effect of T-cell activation on VSV permissiveness and lysis. Activation of primary CD4+ T-lymphocytes was sufficient to induce VSV replication and VSV-triggered cell death, suggesting that cellular signaling pathways - ERK, JNK or AKT - that promote VSV replication are engaged during T-cell activation. Similarly, mitogenic activation of primary CLL promotes the exit from G0 and entrance into the cell cycle, rendering them susceptible to VSV-mediated oncolysis. Moreover, a global increase in protein translation mediated by the activation of mTOR and eIF4E was crucial for VSV replication in primary lymphocytes. These findings provide novel molecular targets for ATL and CLL therapeutics.

Viruses are intracellular pathogens that use the host cell to produce new infectious progeny. For all positive-strand RNA viruses that have been investigated so far, viral replication takes place in cytoplasmic virus-induced membrane structures. For turnip mosaic virus (TuMV), the generation of vesicles likely associated with the replication complex depends on the synthesis of the viral protein 6K. To further characterize the vesicles formed during TuMV infection, Nicotiana benthamiana plants were agroinfiltrated with a TuMV infectious clone expressing 6K protein fused to GFP. Using confocal microscopy, cytoplasmic aggregates were observed, corresponding to the 6KGFP-induced vesicles which house the viral replication complexes (VRCs). Intracellular movement of these vesicles was visualized by time-lapse imaging. Vesicle trafficking was inhibited when plants were infiltrated with latrunculin B, an inhibitor of microfilament polymerization. The absence of movement had severe effects on viral accumulation. Viral vesicles also aligned with actin filaments. These results indicate that microfilaments are necessary for VRC trafficking which is important for virus infectivity. / The biogenesis of viral vesicles was investigated by infecting cells with two recombinant TuMVs producing 6KGFP or 6KmCherry-labelled vesicles. Individual vesicle within a cell contained unique protein products derived from each recombinant demonstrating the origin of a vesicle from a single viral genome. Green and red sectoring was also observed, meaning that vesicles could fuse together. The presence of the eukaryotic translation factors eIF(iso)4E, PABP and eEF1A enclosed in VRC was demonstrated previously by our group. These data combined to a single-genome origin suggest that viral translation occur within these structures. The same host factors were also found to co-localize with the active replicating sites along with viral proteins VPg-Pro, RdRp and CI using immunofluorescence labelling in infected protoplasts. These data bring accumulating evidence for the possible coupling of viral translation and replication. / Les virus sont des parasites intracellulaires qui utilisent la cellule hôte pour produire une nouvelle descendance infectieuse. Pour tous les virus à ARN positif étudiés jusqu'à maintenant, la réplication virale prend place dans des structures membranaires induites par le virus. Chez le virus de la mosaïque du navet (TuMV), la formation de vésicules probablement associées au complexe de réplication dépend de la synthèse de la protéine virale 6K. Afin de caractériser les vésicules formées durant l'infection de TuMV, des plants de Nicotiana benthamiana ont été agroinfiltrés avec un clone infectieux de TuMV exprimant la protéine 6K fusionnée à GFP. Des agrégats cytoplasmiques ont été observés par microscopie confocale, correspondant aux vésicules induites par la protéine 6KGFP et abritant le complexe de réplication virale (VRC). Le mouvement intracellulaire de ces vésicules a été visualisé par imagerie time-lapse. Le trafic des vésicules a été inhibé lorsque les plantes étaient infiltrées avec de la latrunculin B, un inhibiteur de polymérisation des microfilaments. L'absence de mouvement a également conduit à une sévère diminution de l'accumulation virale. Les vésicules colocalisent avec les filaments d'actine. Ces résultats indiquent que les microfilaments sont nécessaires au mouvement des vésicules lequel est important pour l'infection virale. / La biogenèse des vésicules virales a été investiguée en infectant les cellules avec deux clones infectieux de TuMV produisant des vésicules étiquetées par 6KGFP ou 6KmCherry. Des vésicules individuelles contenant des protéines uniques dérivant d'un seul clone recombinant a démontré que l'origine des vésicules provient d'un seul génome. Des vésicules ayant des secteurs vert et rouge ont aussi été observé, indiquant que la fusion de vésicules est possible. La présence des facteurs eucaryotes de traduction eIF(iso)4E, PABP et eEF1A à l'intérieur des vésicules a été démontré par notre groupe. Ces données combinées à l'origine unique des vésicules suggèrent que la traduction virale se produit à l'intérieur de ces vésicules. Les mêmes facteurs de traduction ainsi que les protéines virales VPg-Pro, RdRp et CI colocalisent avec les sites de réplication active dans des protoplastes infectés. Ces données apportent des indices supplémentaires sur la possibilité de couplage entre la traduction et la réplication virale chez TuMV.

Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) is a member of the Retrovirus family and is the causative agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). As an obligate intracellular parasite, HIV-1 uses cellular proteins and machinery to ensure transmission to uninfected cells. One such cellular protein involved in the late stages of viral replication is Staufen1. It is a main component of mRNA ribonucleoproteins (RNPs) and plays distinct roles in mRNA transport, translation and decay. In the context of HIV-1, Staufen1 was initially found to be selectively encapsidated into the virions. Subsequent work determined its association with vRNA and precursor protein Gag within HIV-1 RNPs. Recently we demonstrated that Staufen1 regulates the viral assembly process by inducing Gag multimerization.In Chapter 2 of the present work, we used tandem affinity purification method followed by mass spectrometry to characterize the Staufen1-containing RNPs. We focused on the investigation of the proteins that associate with Staufen1 complexes, isolated from cells that either do or do not express HIV-1. We further performed a detailed comparison of the protein content between native Staufen1 and Staufen1 HIV-1 RNPs and defined the modulations caused from HIV-1 expression. In Chapter 3, we used bimolecular and trimolecular fluorescence complementation methods (BiFC and TriFC) that allow for direct visualization and localization of protein-protein and protein-protein and RNA interactions in living cells, to show that Gag and Staufen1 interact, which was demonstrated by small multi-fluorescent punctae or vesicles in cells. We demonstrated that these protein partners mainly associate in the cytoplasm. However, we also found that they interact at cholesterol-enriched GM-1-containing membrane microdomains. Importantly, Gag specifically recruited Staufen1 to these lipid raft membranes suggesting a key function for this host factor during Gag assembly. Notably in TriFC experiments, in which one protein partner was tethered to mRNA, Gag-Staufen1 interactions were observed demonstrating active recruitment of one protein when the other is bound to mRNA.Overall, we used both proteomics and live cell visualization to examine fundamental viral-host interactions. We have completely characterized the composition of Staufen1 RNPs and have demonstrated how HIV-1 uses these RNPs for its own purpose. These studies also enhance our understanding of the mechanisms and the specific dynamic features of the viral-host (Gag-Staufen1) interactions in living cells, as monitored by the modern fluorescence complementation assays. The findings presented here are significant help to advance research in the HIV-1 field because a better understanding of the mechanism of retrovirus assembly and budding will aid in the development of novel antiviral therapies targeting the critical late steps in the viral replication cycle. / Le virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un membre de la famille de Rétrovirus et est responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). Considéré comme un parasite intracellulaire obligatoire, le VIH-1 utilise les protéines et les machineries cellulaires pour assurer la transmission aux cellules non infectées. Un des facteurs impliqués dans les étapes finales de réplication virale est la protéine Staufen1. Cette protéine est un composant important des ARNm ribonucléoprotéiques et joue des rôles clés dans le transport, la traduction et la dégradation de l'ARNm. Concernant le VIH-1, Staufen1 a été initialement découvert comme étant spécifiquement encapsidé dans les virions. Des travaux plus approfondis ont déterminé son association avec l'ARNv et le précurseur Gag dans les VIH-1 RNPs. Récemment, nous avons démontré que Staufen1 régule le processus d'assemblage viral en induisant le multimérisation de Gag.Dans le travail présent, nous avons employé la méthode de purification d'affinité en tandem suivie de la spectrométrie de masse pour caractériser les RNPs contenus dans Staufen1. Nous nous sommes concentrés sur la recherche des protéines qui s'associent aux complexes Staufen1 isolés des cellules qui expriment ou non VIH-1. Ensuite, nous avons effectué une comparaison détaillée du contenu protéique entre Staufen1 sous forme native et Staufen1 complexé au RNPs VIH-1 et nous avons défini les modulations causées par l'expression de VIH-1.Nous avons utilisé les méthodes de complémentation par fluorescence bimoléculaire et trimoleculaire qui permettent la visualisation et la localisation directes des interactions protéine-protéine et des interactions protéine-protéine et d'ARN dans des cellules vivantes, pour prouver que Gag et Staufen1 interagissent comme démontré par la fluorescence ponctuée ou les vésicules dans les cellules. Nous avons démontré que les protéines partenaires s'associent principalement dans le cytoplasme. Cependant, nous avons également constaté qu'ils interagissent dans des microdomaines membranaires contenant du cholestérol enrichis en GM-1. De manière importante, Gag recrute spécifiquement Staufen1 au niveau de ces membranes de radeaux lipidiques, suggérant une fonction essentielle de ce facteur d'hôte pendant l'assemblage de Gag. En particulier, des expériences de TriFC dans lesquelles une protéine partenaire est attachée à l'ARNm ont permis de montrer des interactions Gag-Staufen1 indiquant un recrutement actif des protéines lorsqu'elles sont attachées à l'ARNm.De façon générale, les travaux présentent des recherches de protéomique fondamentale et de visualisation de cellules vivantes d'interaction virus-hôte. Ces expériences présentent la caractérisation complète de la composition de Staufen1 RNPs et démontre comment le VIH-1 s'adapte pour ses propres besoins. Cette thèse s'enrichit également de notre compréhension des mécanismes et des caractéristiques dynamiques spécifiques des interactions virus- hôte (Gag-Staufen1) dans des cellules vivantes, contrôlées par des techniques récentes de complémentation de fluorescence. Les résultats présentés ici sont considérables et contribuent à l'avancée des recherches dans le domaine du VIH-1, parce qu'une meilleure compréhension du mécanisme de l'ensemblage et du bourgeonnement du rétrovirus augmente la possibilité de développer de nouvelles thérapies antivirales, visant les étapes tardives critiques du cycle viral de réplication.

Viruses are obligate intracellular parasites. Most possess small genomes with a limited coding capacity, which means that they rely on host factors for the completion of their life cycle. The recruitment of cellular proteins is essential as in their absence viruses cannot replicate effectively. Tandem affinity purification was used in Arabidopsis thaliana to identify host interactors of Turnip mosaic virus (TuMV) RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). The heat shock cognate 70-3 (Hsc70-3) and poly(A)-binding (PABP) proteins were recovered and shown to interact with the RdRp in vitro. As previously shown for PABP, Hsc70 was redistributed to nuclear and membranous fractions from infected plants and both RdRp interactors were co-immunoprecipitated from a membrane-enriched extract using RdRp specific antibodies. Fluorescently-tagged RdRp and Hsc70-3 localized to cytoplasm and nucleus when expressed alone or in combination in Nicotiana benthamiana. However, when co-expressed with TuMV membrane binding protein 6K-VPg-Pro, they were redistributed to large perinuclear vesicles where replication takes place. Thus, Hsc70-3 and PABP2 are potentially integral components of the replicase complex and could have important roles to play in potyviral RdRp functions. To further characterize the role of PABP in potyvirus infection single and double gene knockouts were isolated and characterized for all high expressing class II PABP genes in Arabidopsis thaliana: PAB2, PAB4 and PAB8, all of which were found to be viable and fertile. Whereas single knockout plants, for the most part, demonstrate a normal phenotype, pab2 pab4 and pab2 pab8 double mutants had important debilitations in regard to the growth and development of both vegetative and reproductive organs. Experiments with these PABP deficient plants indicate that partial PABP depletion in A. thaliana, although not sufficient to confer complete resistance, can impede replicative cycle of TuMV in the cell. TuMV replication in the / Les virus sont des parasites intracellulaires stricts. La plupart possèdent de petits génomes ayant une capacité d'encodage limitée et dépendent conséquemment des facteurs de l'hôte pour compléter leur cycle d'infection. Le recrutement de ces protéines est essentiel à leur réplication. Nous avons utilisé une stratégie de purification en tandem dans Arabidopsis thaliana dans le but d'identifier les protéines de l'hôte interagissant avec la polymérase virale à ARN (RdRp) du virus de la mosaïque du navet (TuMV). Les protéines Hsc70-3 et PABP ont été purifiées et leur interaction avec la RdRp confirmée in vitro. Tel que rapporté pour la PABP, la Hsc70 s'est retrouvée redistribuée aux fractions nucléaires et membranaires dans des plants infectés. De plus, nous avons été en mesure de co-immunoprécipiter ces deux protéines dans un extrait membranaire avec un anticorps anti-RdRp. Lorsqu'exprimées seules ou ensemble dans Nicotiana benthamiana, la RdRp et la Hsc70-3 localisèrent au cytoplasme et au noyau. Par contre, lorsque co-exprimées avec le polypeptide 6K-VPg-Pro du TuMV, elles se trouvèrent redistribuées à l'intérieur d'une vésicule périnucléaire là où le virus se réplique. Hsc70-3 et PABP2 sont donc potentiellement des protéines faisant partie du complexe de réplication et ont probablement un rôle important à jouer dans les fonctions de la RdRp. Afin de déterminer le rôle de la PABP dans le cycle de réplication des potyvirus, nous avons généré des mutants d'A. thaliana knockout simple ou double pour tous les gènes de PABP de la classe II; PAB2, PAB4 et PAB8. Alors que les mutants simples présentent un phénotype normal, les mutants double pab2 pab4 et pab2 pab8 ont des déficiences de croissance et de développement. Les expériences menées avec ces plants indiquent qu'une déplétion partielle des niveaux de PABP, quoique étant insuffisante pour mener à un phénotype de résistance complet, inhibe le cycle

First-generation integrase strand-transfer inhibitors (INSTIs), such as raltegravir (RAL) and elvitegravir (EVG), have been clinically proven to be effective ARVs for the treatment of HIV-positive patients. However, their relatively low genetic barrier for resistance makes them susceptible to the emergence of drug resistance mutations. In contrast, dolutegravir (DTG) is a newer INSTI that appears to have a high genetic barrier to resistance in vivo. However, the emergence of the resistance mutation R263K followed by the polymorphic substitution M50I has been observed in cell culture. The M50I polymorphism is also observed in 10-25% of INSTI-naïve patients and has been reported in combination with R263K in a patient failing treatment with RAL. Using biochemical cell-free strand-transfer assays and resistance assays in TZM-bl cells, we demonstrate that the M50I polymorphism in combination with R263K increases resistance to DTG in tissue culture and in biochemical assays but does not restore the viral fitness cost associated with the R263K mutation. Since the combination of the R263K mutation and the M50I polymorphism results in a virus with decreased viral fitness and limited cross-resistance, the R263K resistance pathway may represent an evolutionary dead-end. Although this hypothesis has not yet been proven, it may be more advantageous to treat HIV-positive individuals with DTG in first-line than in second or third-line therapy. / Les inhibiteurs de transfert de brin d'intégrase (INSTIs) de première génération, comme le raltégravir (RAL) et l'elvitegravir (EVG), sont des médicaments antirétroviraux efficaces pour le traitement des patients positifs au VIH. Cependant, leur relativement faible barrière génétique les rend sensibles à l'apparition de mutations de résistance aux médicaments. En revanche, le dolutégravir (DTG) est un INSTI plus récent qui semble avoir une haute barrière génétique à la résistance chez les patients traités avec ce médicament. Néanmoins, en culture cellulaire, les sélections en culture de tissue ont montré l'apparition de la mutation de résistance R263K suivie par la substitution polymorphique M50I. Le polymorphisme M50I est observé dans 10 à 25 % des patients naïfs aux INSTIs et a été décrit en association avec R263K dans un patient en échec avec RAL. Grace à l'utilisation d'un test biochimique de transfert de brin, de la mesure de la capacité réplicative et de tests de résistance dans les cellules TZM -bl, nous avons montré que le polymorphisme M50I en combinaison avec R263K augmente la résistance contre le DTG en culture de tissus et dans des dosages biochimiques mais ne compense pas pour le défaut de capacité réplicative qui est associé à la mutation R263K. Etant donné que la combinaison de la mutation R263K et du polymorphisme M50I résulte en un virus à capacité réplicative diminué et une résistance croisée limitée, la voie de résistance R263K pourrait représenter une impasse évolutive. Bien que cette hypothèse n'ait pas encore été prouvée, il pourrait être plus avantageux de traiter les personnes séropositives avec DTG en première ligne qu'en deuxième ou troisième ligne thérapeutique.

Interferon-inducible transmembrane proteins (IFITMs) restrict entry of many pH-dependent enveloped viruses such as Influenza A virus, dengue virus, hepatitis C virus, Ebola virus, and even non-enveloped virus such as Reovirus. These proteins are believed to have two transmembrane or intramembrane domains and prevent viral membrane fusion without relocating the virus to other sites or changing the pH of the endosome environment. Previously, our group reported that IFITMs inhibit human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), a virus that does not require access to endosome for entry. In this study, we set to provide more evidence for restriction at entry of a pH-independent virus and explore the mechanism of inhibition. Simian immunodeficiency virus strains that infect African green monkey (SIVAGM) are found to be significantly restricted by human IFITM2. SIV strain from sooty mangabey is partially restricted, while strain from macaque is unaffected. The restriction of SIVAGM by human IFITM2 occurs at entry. Interestingly, IFITM2 restricts these viruses better than IFITM3 does, despite their high homology at the amino acid level. We found that 2 amino acid residues at the N-terminal domain are responsible for the higher restriction efficiency by IFITM2. We also cloned AGM IFITMs to test whether the monkey proteins can inhibit HIV-1. Surprisingly, AGM do not have IFITM2 (similar to macaque), but AGM IFITM3 inhibits all tested strains including SIVMAC better than it inhibits HIV strains. These findings have therefore expanded the pH-independent viruses that are inhibited by IFITM proteins and provide a new avenue to explore the antiviral actions of IFITM. / Les protéines transmembranaires inductibles par interféron (IFITM) limitent l'entrée de nombreux virus enveloppés dont l'entrée dépend du pH, tels que les virus de la grippe, le virus de la dengue, le virus de l'hépatite C, le virus Ebola, et même des virus non enveloppés tels que le reovirus. Ces protéines ont deux domaines transmembranaires ou intramembranaires et peuvent empêcher la fusion des membranes virales sans altérer le site d'entrée ou de modifier le pH de l'environnement des endosomes. Notre groupe a rapporté auparavant que les protéines IFITM pouvaient aussi inhiber le virus de l'immunodéficience humaine de type I (HIV-1), un virus qui ne nécessite pas l'accès aux endosomes lors de l'entrée. Dans cette étude, nous avons décidé à la fois de fournir plus de preuves quant à la restriction d'un virus dont l'entrée est indépendante du pH mais également d'explorer le mécanisme d'inhibition. Les souches de virus d'immunodéficience simienne (SIV) qui infectent les singes verts d'afrique (SIVAGM) se trouvent être considérablement inhibées par les protéines IFITM humaines. Les souches de SIV provenant des mangabeys (SIVSMM) sont partiellement affectées, tandis que la souche de SIV infectant le macaque (SIVMAC) est résistante aux protéines IFITM. De plus, nous avons démontré que les protéines IFITM humaines inhibent l'étape d'entrée de SIVAGM et que ces virus sont plus affectés par IFITM2 que par IFITM3. Nous avons aussi constaté que les acides aminés situés à l'extrémité N-terminale sont responsables de l'inhibition plus importante d'IFITM2 par rapport à IFITM3. Nous avons également cloné les gènes IFITM issus des singes verts d'Afrique pour tester s'ils peuvent inhiber HIV-1. De manière surprenante, les singes verts d'Afrique n'ont pas de IFITM2, mais IFITM3 issu de ces mêmes singes, inhibe toutes les souches examinées, y compris SIVMAC, plus efficacement qu'il inhibe les souches de HIV. Ces résultats ont donc élargi les virus pH-indépendant qui sont inhibés par des protéines IFITM et fournir une nouvelle avenue à explorer concernant les actions antivirales de IFITM.

E138K, a G→A mutation in the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcriptase (RT), is preferentially selected by etravirine (ETR) and rilpivirine (RPV) over other substitutions at position E138 that offer greater drug resistance. We hypothesized that there was a mutational bias for the E138K substitution and designed an allele-specific PCR to monitor the emergence of E138A/G/K/Q/R/V during ETR or RPV selection experiments. E138K, as well as E138G, consistently emerged first during selection experiments, followed by E138A, E138Q and E138R. Surprisingly, E138K was identified as a minority in 23% of drug-naïve subtype B patients, and was not further enriched in patients with the M184I substitution. The high prevalence of E138K minority species could reflect a low fitness cost of E138K; however, E138K was one of the least fit substitutions at codon E138, even after taking into account the dNTP pools of the cells used in competition experiments. Ultra-deep sequencing analysis revealed other minority species in a pattern consistent with the mutational bias of HIV-1 RT. These results confirm the mutational bias of HIV-1 in patients and highlight the importance of G→A mutations in HIV-1 drug resistance evolution.This G→A bias reflects enriched adenosine in HIV-1 codons, a feature that is mysteriously targeted by the anti-HIV-1 restriction factor, Schlafen family protein 11 (SLFN11). Our in silico modeling of SLFN11 suggested putative structure-function relationships and a relation to Ski2-family RNA helicases. / E138K, une mutation G → A dans l'immunodéficience humaine de type virus humain 1 (VIH-1) et dans la transcriptase inverse (TI), est de préférence choisie par l'étravirine (ETR) et rilpivirine (RPV) plutôt que d'autres substitutions à la position E138 qui offrent une plus grande résistance. Nous avons supposé qu'il y avait un biais mutationnel pour la substitution E138K et conçu une PCR allèle spécifique pour surveiller l'émergence de E138A/G/K/Q/R/V lors d'expériences de sélection avec ETR ou RPV. E138K, ainsi que E138G, constamment apparue au cours d'expériences de sélection, suivi d'E138A, E138Q et E138R. Étonnamment, E138K a été identifiée comme une infime minorité dans 23% des cas de sous-type B de patients naïfs aux médicaments, et n'a pas augmenté chez les patients atteints de la substitution M184I. La prévalence élevée des espèces minoritaires de E138K pourrait refléter un faible coût de remise en forme de E138K, mais E138K était l'un des substitutions moins performants au niveau du codon E138, même après avoir pris en compte la concentration de dNTP dans cellules utilisées dans des expériences de compétition. Une analyse de séquençage en profondeure a révélé d'autres espèces minoritaires dans un modèle cohérent avec le biais mutationnel du VIH-1 TI. Ces résultats soulignent l'importance de G → A mutations du VIH-1 dans l'évolution de la résistance aux médicaments.Ce G → A biais a enrichi l'adénosine dans le codons VIH-1, une fonctionnalité qui est mystérieusement ciblé par le facteur anti-VIH-1 restriction, Schlafen protéine de la famille 11 (SLFN11). Notre modélisation in silico de SLFN11 suggère des relations structure/fonction présumée et une relation à l'hélicase ARN de famille Ski2.

The interferon-induced protein kinase RNA-activated (PKR) is activated after virus infection but not during human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection of lymphocytes. The TAR RNA binding protein (TRBP) counteracts the inhibitory effects of PKR on HIV-1 expression and replication. In U251MG astrocytes, which are low TRBP producers, PKR is activated upon HIV-1 transfection and viral production is low. Astrocytes overexpressing TRBP express more viral proteins. Expression of adenosine deaminase acting on RNA-1 (ADAR1)-p150 and its binding to PKR are increased during high HIV-1 replication. ADAR1 also reverses PKR inhibition of HIV-1 expression and production in HEK 293T and astrocytes. DNA- and RNA-binding domains of ADAR1 are required for PKR inhibition. Surprisingly, the PKR activator protein (PACT) also reversed PKR inhibition of HIV-1 expression in HEK 293T. These results indicate that three double stranded RNA binding proteins, TRBP, ADAR1 and PACT belong to a multiprotein complex that inhibits PKR function during HIV-1 infection. / La protéine kinase induite par l'interféron activée par l'ARN (PKR) est activée après une infection virale, mais pas durant l'infection des lymphocytes par le Virus de l'Immunodéficience Humaine de type-1 (VIH-1). La protéine de liaison à l'ARN TAR (TRBP) empêche l'effet inhibiteur de PKR sur l'expression et la réplication du VIH-1. Dans les astrocytes U251MG, exprimant faiblement TRBP, PKR est activée par le VIH-1 et la production virale reste basse. Des astrocytes qui surexpriment TRBP produisent plus de protéines virales. L'expression de l'adénosine déaminase agissant sur l'ARN-1 (ADAR1)-p150 et sa liaison à PKR augmentent quand le VIH-1 se réplique activement. ADAR1 inverse l'inhibition de l'expression et de la production du VIH-1 par PKR. L'inhibition de PKR nécessite les domaines de liaison à l'ARN et à l'ADN d'ADAR1. Étonnamment, l'activateur de PKR (PACT) inverse aussi l'inhibition du VIH-1 par PKR dans les HEK 293T. Ces résultats indiquent que trois protéines liant l'ARN double brin, TRBP, ADAR1 et PACT forment un complexe multiprotéique qui inhibe la fonction de PKR pendant l'infection du VIH-1.

Dendritic cells (DC) have a central role in cell-mediated immunity and they are today in the middle of many immunotherapy strategies. Recently, a clinical trial was initiated at the Montreal Chest Institute, to evaluate the effect of an immunotherapy (AGS-004) containing autologous DC to amplify the T cell immune responses of HIV-1-infected subjects. However, concerns have been raised that B cell activation following DC immunotherapy may lead to the development of autoimmune diseases. Here, we studied the safety, patient tolerance and changes in total B cells and B cell subsets following administration of AGS-004 in ten HIV-1 subjects receiving antiretroviral therapy (ART). Clinically, AGS-004 was safe, well tolerated and caused few mild side effects. Moreover, CD4 and CD8 cell counts and HIV-1 viral load were unchanged throughout the 48-weeks follow-up study period. In addition, total B cells and B cell subsets, which were measured as an indicator of the immune activation status, did not change over time, except that the proportion of B memory cells significantly increased after receiving the AGS-004 immunotherapy (P=0.005). Collectively, these data show that the AGS-004 is relatively well tolerable and induces an increase in B memory cells. Further investigations would need to be done to confirm the presence of an activated immune status including functional properties of these B memory cells and antibody measurements. / Les cellules dendritiques (DC) ont un rôle central dans l'immunité à médiation cellulaire et elles sont aujourd'hui au centre de nombreuses stratégies d'immunothérapie. Récemment, un essai clinique à base des DC autologues, a été initié à l'Institut Thoracique de Montréal pour évaluer l'effet d'une immunothérapie (AGS-004) à amplifier les réponses immunitaires des lymphocytes T chez les sujets infectés par le VIH-1. Cependant, le risque potentiel de l'activation des lymphocytes B, menant au développement de maladies auto-immunes, a été soulevé suivant des immunothérapies à base de DC. Dans le présent travail, nous avons évalué l'innocuité, la tolérance et les changements des lymphocytes B et leurs sous-populations après DC immunothérapie chez dix sujets infectés par le VIH-1 et recevant une thérapie antirétrovirale. Cliniquement, l'AGS-004 était sans danger, bien tolérée avec quelques effets secondaires bénins. De plus, les valeurs de la charge virale et les décomptes lymphocytaires CD4 et CD8 n'ont pas été modifiées tout au long de la période de suivi de 48 semaines. En outre, les pourcentages de lymphocytes B totaux et leurs sous populations n'ont pas changé, à l'exception des lymphocytes B mémoires qui ont considérablement augmenté après l'immunothérapie (P=0.005). Collectivement, ces résultats montrent que l'AGS-004 est relativement bien tolérée et induit une augmentation des lymphocytes B mémoires. Il demeure donc intéressant de confirmer ces résultats et d'étudier la fonction de ces lymphocytes de manière plus poussée ainsi que de mesurer la production des anticorps. fr

The reverse transcriptase (RT) enzyme of human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) is an RNA- and DNA-dependent DNA polymerase that also exhibits RNase H activity. The polymerase and RNase H active sites of RT are structurally linked through the connection domain. RT is a major antiretroviral target but the development of viral resistance often leads to therapy failure. Genotyping protocols detect mutations in the polymerase active site that confer resistance to nucleoside analogue RT inhibitors such as zidovudine (AZT). It has been shown however, that mutations outside of this region, such as the N348I substitution in the connection domain, also confer resistance to AZT. Here, we have investigated the mechanism of N348I drug resistance. Our biochemical results have shown that the N348I mutation affects drug susceptibility by reducing nucleic acid substrate binding in the RNase H domain of RT. The N348I mutation also compensates for enzymatic deficits introduced by other resistance-conferring mutations, thus providing a rationale for its selection pattern in vivo.Additionally, we have investigated the mechanism through which INDOPY-1, a newly discovered antiretroviral agent, disrupts RT function. Although INDOPY-1 is not a nucleoside analogue, it can compete with incoming nucleotides and select for mutations at the site of nucleotide binding. Based on these observations, we propose that this antiretroviral agent belongs to a new class of RT inhibitors that we name "Nucleotide-competing RT Inhibitors". Finally, cellular ATP was shown to enhance the potency of INDOPY-1, a property never before seen with any other RT inhibitors. Based on the biochemical properties of this interaction, we propose to describe ATP as an "enhancer" of INDOPY-1-mediated RT inhibition. ATP enhances the binding of INDOPY-1 to RT by "capping" the inhibitor in the polymerase active site.Work presented in this thesis characterizes a novel mechanism of resistance to clinically approved RT inhibitors. It also describes, for the first time, a new class of RT inhibitors that function through a unique mechanism of action. / La transcriptase inverse (RT) du VIH-1 est une polymérase d'ADN et d'ARN qui est aussi capable de dégrader l'ARN viral durant la polymérisation. Le domaine de connextion de la RT crée un lien entre le site actif de la polymérase et le site actif d' RNase H de cette enzyme. La RT est une cible majeure de la thérapie contre le SIDA. Mais, à cause du taux de mutation élevé du virus, le développement de résistance aux médicaments est rapide, ce qui engendre la neutralisation des effets avantageux des thérapies antivirales. Les analogues de nucléosides, comme zidovudine (AZT), sont souvent utilisés durant la thérapie anti-SIDA. Les tests génotypiques qui détectent la résistance virale incluent seulement le domaine de la polymérase de la RT. Par contre, il a été démontré que des mutations dans les domaines de la connextion, par example le mutation N348I, peuvent causer la résistance à AZT. Nous avons étudié le mécanisme de résistance à la mutation N348I. Nos resultats biochimiques montrent que N348I a un effet négatif sur l'affinité de l'ARN pour le site actif d'RNase H. Nous montrons aussi que la mutation N348I peut compenser pour des domages causés par d'autres mutations. Ceci peut expliquer l'apparence de cette mutation in vivo. Nous avons aussi étudié le mécanisme d'action d'INDOPY-1, un nouveau agent inhibatoire de la RT. Malgré que l'INDOPY-1 n'est pas un analogue de nucléoside, cet agent peut entrer en compétition avec les nucléotides et les mutations de résistance sont selectionnées dans le site d'association des nucléotides. C'est ainsi que nous avons proposé que l'INDOPY-1 appartient à une nouvelle catégorie d'inhibiteurs que nous nommons «Nucleotide-competing RT inhibitors». Un autre trait caractéristique de l' INDOPY-1 est que sa capacité d'inhibition peut être augmentée par l'ATP cellulaire. Basé sur ceci, nous décrivons l'ATP comme étant le «renforceur» de l'INDOPY-1. Ce mécanisme de renforcement se produit lorsque l'ATP «encapsule» l'INDOPY-1 dans le site actif de la polymérase de la RT.En conclusion, nous avons characterisé un nouveau mécanisme de résistance aux analogues de nucléosides. Nous avons aussi découvert le premier composé d'une nouvelle classe d'agents inhibatoires de la RT.