Over the last 30 years, the human immunodeficiency virus (HIV)/acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) mêlée has endured despite valiant efforts made by the research community. Although great strides in treatment efficacy have been made, an effective vaccine remains beyond our reach. Anti- HIV microbicides, (topically applied agents to prevent the transmission of HIV), offer an infection prevention strategy that may buy us time until an effective vaccine is discovered. Indeed, antiretroviral (ARV)-based microbicides have proven more effective than any vaccine clinical trial to date. Improved formulations, including combination ARV- based microbicides, may prove to be even more clinically efficacious in the future. However, the pre-clinical evaluation of candidate microbicide ARVs is prudent, lest a formulation proves inimitably toxic or useless during human trials. Of course, pre-clinical drug assessments have limitations; what we learn from in vitro tissue culture experiments does not necessarily translate seamlessly to in vivo efficacy. Pre-clinical assessment may, nevertheless, aid in advancing the best possible candidate ARVs, permitting each candidate microbicide ARV to be ranked in the context of better toxicity, efficacy, and drug resistance development profiles. The following thesis describes the pre-clinical assessment of the lead candidate microbicide ARVs, tenofovir (TFV) (a nucleotide reverse transcriptase inhibitor (NtRTI)), dapivirine (DAP) (a nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor(NNRTI)), and BMS- 599793, an HIV-1 entry inhibitor. How these drugs perform as HIV-1 infection preventatives in the context of wild type (WT) and drug resistant (DR)HIV-1 transmission in vitro is focused upon. / Au cours des 30 dernières années, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), agent causative du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) a enduré malgré les vaillants efforts déployés par la communauté de la recherche. Bien que de grands progrès au niveau de l'efficacité du traitement ont été accomplis, un vaccin efficace reste hors de notre portée. Les microbicides anti-VIH (agent topiques appliqués pour prévenir la transmission du VIH) offrent une stratégie de prévention des infections et peuvent probablement nous acheter du temps jusqu'au moment ou un vaccin efficace sera découvert. En effet, les antirétroviraux (ARV) lorsqu'utilisés comme microbicides sesont révélés plus efficaces que tout essai clinique du vaccin, à ce jour. Des formulations améliorées, y compris les combinaisons d'ARV à base de microbicides, pourront s'avérer encore plus efficaces dans l'avenir. Cependant, l'évaluation préclinique des candidats ARV de microbicide est une précaution importante lorsque nous prenons en considération le fait que certains ARV peuvent être toxiques ou inutiles au cours d'essais sur les humains. Bien entendu, les évaluations précliniques de drogues ont des limitations; ce que nous apprenons à partir d'expériences de culture de tissus n'est pas nécessairement traduit parfaitement in vivo au point de vue de l'efficacité. L'évaluation préclinique peut, néanmoins aider à faire avancer le candidat ARV le meilleur, en permettant à chaque candidat microbicide d'être classé dans le contexte de la toxicité de l'efficacité et des profils de résistance. La thèse qui suit décrit l'évaluation préclinique de la ténofovir (TFV) (un nucléotide inhibiteur de la transcriptase inverse (NtRTI), de la dapivirine (DAP) (un inhibiteur non-nucléosidique de la transcriptase inverse (INNTI)) et de la BMS-599793, un inhibiteur d'entrée du VIH-1. Comment exercer ces médicaments préventifs d'infection au VIH-1 dans le contexte de virus de type sauvage (WT) et virus résistant aux médicaments est le thème de la présente thèse.

Micronutrients are increasingly appreciated as potent immunomodulators. Long used to 'treat' measles virus (MeV), vitamin A was recently shown to act through RIG-I to up-regulate type 1 interferons. Similar actions are seen with some (mumps virus and CDV) but not all members of the Paramyxoviridae. However, children infected with respiratory syncytial virus (RSV), a close relative of MeV, do worse when given pharmacological doses of vitamin A. RSV is known to elicit a pathologic Th2-biased response. Vitamin A also has a strong Th2-deviating influence. Our primary objective was to develop a small animal model of vitamin A deficiency and sufficiency in which we could assess the impact of vitamin A status and supplementation on RSV infection in vivo. Such a model will be of great use to characterize the mechanism of action of retinoids in this infection. We succeeded in the development of this model by restricting dietary retinol through 2 generations of BALB/c mice (ie: deficiency state) and introducing novel means to reliably attain a state of consistent vitamin A supplementation (ie: reconstituted & excess states). Preliminary data using this model suggested that there were marked differences in RSV pathology between deficient and sufficient mouse groups. Like the apparent situation in humans, infection in the vitamin A deficient mice was paradoxically less severe than in mice with a positive vitamin A status. This model and the data generated with it may be of particular interest in regions with diets high in vitamin A (North America in particular). Historically, very little attention has been given to possible negative effects of micronutrient 'over-nutrition'. The limited human data and the preliminary data from our new model brings into question whether or not we are 'priming' ourselves for more severe RSV infection than would otherwise occur. The data generated in this model may also be highly relevant to guide supplementation efforts in regions of the world that currently have less access to vitamin A. / Les micronutriments sont des plus appréciés comme immunomodulateurs puissants. Longtemps utilisé pour traiter measles virus (MeV), la vitamine A a été récemment montré à agir par le biais de RIG-I pour réguler les interférons de type 1. Des actions similaires sont observés avec certains (canine distemper virus, CDV), mais pas tous les membres du Paramyxoviridae. Cependant, les enfants infectés par des voies respiratoire, respiratory syncycial virus (RSV), un proche cousine de MeV, faire pire lorsqu'il est administré des doses pharmacologiques de vitamine A. Le RSV est connu pour induire une résponse pathologique biaisée au Th2. La vitamine A est également une forte influence pour la Th2 déviation. Notre principal objectif était de développer un modèle animal de la carence en vitamine A et la suffisance dans lesquels nous pourrions évaluer l'impact du statut en vitamine A et de la supplémentation sur l'infection à RSV in vivo. Un tel modèle sera d'une grande utilité pour caractériser le mécanisme d'action des rétinoïdes dans cette infection. Nous avons réussi dans le développement de ce modèle en limitant le rétinol alimentaires grâce à deux générations de souris BALB / c (ie: état de carence) et en introduisant de nouveaux moyens de atteindre un état fiable de vitamine A cohérente supplémentation (ie: les Etats reconstitué & excès). Les données préliminaires utilisant ce modèle suggéré qu'il y avait des différences marquées dans la pathologie du RSV entre les groupes de souris déficientes et suffisante. Comme la situation apparente dans les humains, l'infection dans la vitamine A des souris déficientes en était paradoxalement moins sévère que dans les souris avec une vitamine positifs d'un statut. Ce modèle et les données générées avec elle peut être d'un intérêt particulier dans les régions où les régimes son riches en vitamine A (Amérique du Nord en particulier). Historiquement, très peu d'attention a été accordée aux effets négatifs possibles des micronutriments sur-nutrition. Les données humaines limitées et les données préliminaires de notre nouveau modèle remet en question si oui ou non nous sommes d'amorçage nous-mêmes pour l'infection à VRS plus sévères que se produirait autrement. Les données générées dans ce modèle peut également être très pertinentes pour guider les efforts de la supplémentation dans les régions du monde qui ont actuellement un accès moindre à la vitamine A.

The Hepatitis C Virus (HCV) is a major public health concern considering it infects around 3% of the global population and there is currently no virus-specific therapy or vaccine. Several virally-encoded proteins have been identified as potential targets for inhibitor design including the helicase-containing nonstructural protein three (NS3). / Helicases are enzymes that are responsible for the separation of double-stranded nucleic acids prior to most processes of nucleic acid metabolism. It is well documented that disabling the HCV helicase through mutation results in the arrest of the viral lifecycle. The aim of our work was to characterize the details of the molecular biology of the HCV helicase. / We have cloned the helicase domain of NS3 and have conducted studies on its NTPase, DNA binding, and unwinding activities using a collection of biochemical assays. We were able to describe the previously unknown interface that exists between the helicase and a DNA substrate and identify a basic amino acids cluster (K360-K380) that is important for DNA binding and unwinding. We have shown that the previously uncharacterized Motif IV is responsible for binding at the junction between substrate and product DNA. Furthermore, we have implicated residues within Subdomain 3 (K583-K589) that are likely involved in the strand separation process. / Helicases catalyze the separation of nucleic acid strands using the energy that is derived from the hydrolysis of nucleotide triphosphates (NTPs). This chemical reaction powers conformational changes within the protein, resulting in translocation of the helicase along DNA and RNA substrates to eliminate structural features that shield the genetic code. During the second phase of our study, we used a high-resolution protein footprinting assay, among other biochemical tests, to study the link between NTP hydrolysis and the strand separation process. We found that the dynamic movement of Subdomain 2, which contains both Motif IV (in contact with the DNA) and Motif VI (in contact with the NTP) is responsible for transducing NTP hydrolysis energy into the DNA unwinding activity of HCV NS3. / Tenant compte du fait que le virus de l'hépatite C (HCV) infecte approximativement 3% de la population mondiale et qu'il n'existe ni médicament spécifique ni vaccin pour ce virus, celui-ci représente une inquiétude majeure en santé publique. Plusieurs protéines virales ont été identifiées comme sources possibles pour la création d'agents inhibiteurs, incluant la protéine non-structurale 3 (NS3) qui comprend l'activité de l'hélicase. / Les hélicases sont les enzymes responsables de la séparation des deux brins des acides nucléiques qui précède la plupart des processus métaboliques de ceux-ci. La désactivation par mutation de l'hélicase du HCV provoquant l'arrêt du cycle viral est bien documentée. Le but de notre travail était de caractériser les détails de la biologie moléculaire de l'hélicase du HCV. / Nous avons cloné le domaine de l'hélicase de la NS3. Utilisant une multitude d'analyses biochimiques, nous avons étudié son activité NTPase, ainsi que ses activités de fixation et de déroulement d'ADN. Nous avons pu décrire l'interface jusqu'ici inconnue qui existe entre l'hélicase et un substrat d'ADN, et identifier une grappe d'aminoacides (K360-K380) impliqués dans la fixation et le déroulement d'ADN. Nous avons démontré que le Motif IV est responsable de la fixation à la jonction entre le substrat et le produit d'ADN. Nous avons également identifié des résidus du Sous-domaine 3 (K583-K589) qui semblent très probablement impliqués dans le processus de séparation des brins. / L'hélicase catalyse la séparation des brins des acides nucléiques en utilisant l'énergie dérivée de l'hydrolyse de nucléotides triphosphates (NTP). Cette réaction chimique fournit l'énergie nécessaire aux changements conformationnels de la protéine, responsables du mouvement de l'hélicase le long des substrats d'ADN et d'ARN qui élimine les structures masquant le code génétique. Dans la deuxième étape de notre recherche, nous avons utilisé, parmi d'autres tests biochimiques, une méthode d'analyse d'emprunte protéique à haute résolution pour étudier la relation entre l'hydrolyse des NTPs et la séparation des brins des acides nucléiques. Nous avons découvert que le mouvement dynamique du Sous-domaine 2, qui contient à la fois Motif IV (en contact avec l'ADN) et Motif VI (en contact avec le NTP), est responsable de la transduction de l'énergie produite par l'hydrolyse des NTPs en l'énergie nécessaire pour le déroulement d'ADN du HCV NS3.

Translation of mRNA into protein is a fundamental process and requires tight regulation. Primary control occurs at the initiation step. A critical protein for this regulation is the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E), which binds to the 5´ cap structure found on all nuclear transcribed mRNAs. This interaction initiates translation by assembling the eIF4F complex on the mRNA, which subsequently recruits the ribosome. The function of eIF4E is regulated in two ways, by the 4E binding proteins (4E-BPs), which disrupt the eIF4F complex and secondly by eIF4E phosphorylation on serine 209. However, the consequences of eIF4E phosphorylation are not clearly understood. / Cells continuously encounter pathogens including viruses. Lacking their own metabolic machinery, viruses rely on the translational apparatus of the host to produce their proteins. During many viral infections reprogramming of the cellular translation system occurs, favoring translation of viral mRNAs. Altering the eIF4F complex is one means by which reprogramming occurs. Picornaviruses initiate translation of their mRNAs independent of eIF4E through an internal ribosomal entry site (IRES). Work in this thesis demonstrates that eIF4E still impacts picornavirus mRNA translation, but only when viral mRNAs compete with cellular RNAs. IRES mediated translation was strongly enhanced when eIF4E abundance was decreased in an in vitro system by addition of 4E-BP or in vivo by siRNA knock down. Decreased eIF4E abundance reduced cap-dependent translation, but stimulated IRES mediated translation. / Viral invasion is immediately recognized by the cell and accordingly, several defense mechanisms are activated. One of them entails secretion of type I interferon. This thesis shows that phosphorylation of eIF4E on serine 209 impedes type I interferon production. Cells carrying an altered eIF4E phosphorylation site, impairing eIF4E phosphorylation, secreted elevated levels of type I interferon upon stimulation with synthetic RNA. Consequently, these cells were more protected against infection with interferon sensitive viruses. In conclusion, regulation of eIF4E is important for picornavirus infection and plays a key role in generating a potent antiviral response. / La traduction des ARN messagers (ARNm) en protéines est un processus essentiel qui requiert une étroite régulation. Le principal contrôle a lieu à l'étape de l'initiation. Une protéine essentielle pour cette régulation est le facteur d'initiation de la traduction 4E (eIF4E), qui se lie à la structure de la coiffe présente en 5' de tous les ARNm transcrits par le noyau. Cette interaction initie la traduction par l'assemblage du complexe eIF4F sur l'ARNm, ce qui permet le recrutement des ribosomes. La fonction d'eIF4E est régulée d'une part par les protéines se liant à 4E (4E-BPs) qui dissocient le complexe eIF4F, et d'autre part par la phosphorylation d'eIF4E sur la sérine 209. Toutefois, les conséquences de cette dernière ne sont pas clairement comprises. / Les cellules rencontrent constamment des pathogènes, dont des virus. Ces derniers étant dépourvue de machinerie métabolique propre, ils se doivent d'utiliser l'appareil traductionnel de l'hôte pour exprimer leurs protéines. De nombreuses infections virales résultent en un changement du système de traduction cellulaire favorisant la traduction de protéines à partir des ARNm viraux. L'altération du complexe eIF4F est l'un des moyens utilisés lors de cette reprogrammation. Les Picornavirus initie la traduction de leurs ARNm indépendamment d'eIF4E par le biais d'un site d'entrée interne des ribosomes (IRES). Le travail effectué lors de cette thèse démontre qu'eIF4E peut toujours influencer la traduction des ARNm des picornavirus, mais uniquement lorsque ceux-ci entrent en compétition avec les ARN cellulaires. La traduction à partir de l'IRES est accrue lorsque la quantité d'eIF4E disponible est réduite dans un système in vitro par addition de 4E-BP, ou in vivo par un ARN interférant. La diminution des niveaux d'eIF4E réduit la traduction dépendante de la coiffe, mais stimule la traduction par l'IRES. / Les infections virales sont reconnues immédiatement par les cellules et engendrent l'activation de plusieurs mécanismes de défense. L'un d'entre eux implique la sécrétion d'interféron de type I. Nous avons démontré que la phosphorylation d'eIF4E sur la sérine 209 entrave cette production d'interféron de type I. Des cellules dont le site de phosphorylation d'eIF4E a été altéré pour empêcher sa phosphorylation, produisent des niveaux plus élevés d'interféron de type I suite à une stimulation par des ARN synthétiques. En conséquence, elles sont mieux protégées contre les infections virales provenant de virus sensibles aux interférons. En conclusion, la régulation d'eIF4E est importante lors des infections par les picornavirus et elle joue un rôle essentiel dans la genèse d'une réponse virale efficace.

Jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) and enzootic nasal tumour virus (ENTV) are two highly related oncogenic retroviruses that induce a contagious cancer in sheep and goats respectively. Both JSRV and ENTV use hyaluronidase-2 (Hyal2) as a cell entry receptor, yet JSRV induces lung tumours and ENTV causes tumours in the nasal epithelium. Unlike most acutely transforming retroviruses, the genomes of JSRV and ENTV do not contain an oncogene derived from the host cell; instead, the viral envelope protein (Env) functions as an active oncogene in addition of mediating cell entry. JSRV and ENTV Env are first synthesized as precursors that are cleaved by a cellular protease into two functional subunits: the surface (SU) subunit that contains the receptor binding domain and the transmembrane (TM) subunit that mediates membrane fusion. While most of previous studies have focused on the oncogenic properties of these proteins, little was known about how they mediate membrane fusion and viral entry. The goal of my Ph.D study was to investigate the mechanisms of fusion and cell entry by JSRV and ENTV Env as well as their regulations. We found that, although most retroviruses are believed to use a pH-independent pathway for entry, JSRV requires an acidic pH for entry and fusion and that its fusogenicity was negatively regulated by its cytoplasmic tail. Unexpectedly, ENTV Env requires an unusually low pH (<4.5) for fusion activation. While an irreversible inhibitor, Bafilomycin A1, which prevents acidification in the endosomes and lysosomes inhibited entry of JSRV and ENTV, ENTV Env-mediated infection was considerably enhanced in the presence of lysosomotropic agents or leupeptin, suggesting that JSRV and ENTV likely fuse in distinct cellular compartments. Importantly, we found that SU also modulates the fusion activity of JSRV and ENTV Env, despite that TM dictates the differential pH requirements between JSRV and ENTV. / Le virus JSRV (Jaagsiekte sheep retrovirus) et ENTV (enzootic nasal tumor virus) sont deux rétrovirus oncogéniques apparentés qui induisent un cancer contagieux chez le mouton et la chèvre respectivement. Le récepteur utilisé lors de l'entrée de JSRV et d'ENTV dans la cellule cible est la protéine cellulaire hyaluronidase-2 (Hyal2). Cependant, alors qu'ils reconnaissent le même récepteur à la surface de la cellule, JSRV cause la formation de tumeurs au poumon tandis qu'ENTV induit l'apparition de tumeurs nasales. À l'opposé de la plupart des rétrovirus oncogéniques causant rapidement la formation de tumeurs, les génomes du JSRV et d'ENTV ne contiennent pas d'oncogène dérivé de la cellule hôte. Étonnamment, la protéine virale d'envelope (Env) joue un rôle d'oncogène actif en plus d'assurer ses fonctions durant l'entrée virale. Les Envs du JSRV et d'ENTV sont d'abord synthétisées sous forme de précurseurs qui seront éventuellement clivés dans l'appareil de golgi par une protéase cellulaire en ses deux sous-unités fonctionnelles : la sous-unité de surface (SU), qui contient le domaine de liaison au récepteur, et la sous-unité transmembranaire (TM) qui possède l'activité fusogénique. Alors que la plupart des études sur le JSRV et l'ENTV se concentrent sur les propriétés oncogéniques d'Env, les mécanismes par lesquels Env accomplit l'entrée virale et provoque la fusion de la membrane virale et la membrane cellulaire demeurent inconnus. Le but de ce projet de doctorat était d'étudier les mécanismes d'activation de la fusion ainsi que de mieux comprendre leur régulation. Alors qu'en principe la majorité des rétrovirus entrent dans la cellule via la fusion à la surface de la cellule à pH neutre, notre étude démontre que JSRV requiert un pH acide pour l'entrée et la fusion virale. De plus, l'activité fusogénique d'Env est régulée négativement par sa queu

An estimated 33 millions of individuals are currently infected with HIV worldwide; the majority of them lives in Sub-Saharan Africa and do not have access to antiretroviral treatment despite all efforts from the international community. Despite efforts made in the area of prevention and treatment, the virus is still continuing to infect people worldwide. It is therefore believed that a safe, effective and affordable vaccine is the best solution to the global HIV epidemic. Unfortunately, despite recent advances in our understanding of HIV-1 pathogenesis and immunology, this goal remains elusive. / Vaccination started with Edward Jenner's success with smallpox immunization in 1796. Since then, a number of successful vaccines have been developed including, polio, measles, mumps, rubella, hepatitis B and influenza. The quest for an effective HIV-1 vaccine has proved to be very difficult because of specific characteristic of the virus, the lack of understanding of correlates of protection from infection and disease progression and the inadequacy of assays currently used to evaluate immune responses. / This thesis focuses on characterizing the qualitative and quantitative features of HIV-specific T cell immune responses in individuals in primary infection as well as their fate in progressive HIV disease. The rationale for studying individuals in primary HIV infection is that events during this phase of infection are believed to set the stage for the subsequent course of infection. We first developed an ELISPOT assay able to detect both IFN-γ and IL-2 secretion simultaneously. This assay was used for the comprehensive screening and characterization of responses to the entire HIV proteome in individuals during primary and chronic infections. / We showed that the dual color ELISPOT assay developed in our laboratory is capable of detecting 3 functional lymphocyte populations: single IFN-γ, dual IFN-γ/IL-2 and single IL-2 secreting cells. We demonstrated that this assay is sensitive, reproducible and able to detect both CD4+ and CD8+ T cell responses. We found that the breadth and magnitude of responses directed against the entire HIV proteome was not associated with control of viremia. Interestingly, we found an association between Gag p55-, and particularly Gag p24-specific responses, with concurrent and set point VL, for all 3 functional subsets detected. We also showed that the contribution of IFN-γ/IL-2 secreting cells to the total HIV-specific response as well as their proliferative capacity was reduced by the 2nd year of HIV infection. / Taken together, we believe that the results presented in this thesis contribute to furthering our understanding of immune correlates of protection from disease progression. These results suggest that vaccine strategies designed to focus immune responses against Gag may have a better chance of controlling HIV viral replication to levels that slow disease progression and reduce HIV transmission both at the individual and the population levels. / A ce jour, près de 33 millions d'individus sont infectés par le virus du VIH à travers le monde, parmi lesquels la majorité non seulement se retrouvent dans les pays de l'Afrique au Sud du Sahara mais aussi n'ont pas accès aux médicaments antiviraux, malgré les efforts soutenus de la communauté internationale. / Le meilleur moyen pour contrôler la pandémie serait la mise au point d'un vaccin efficace et bon marché. Jusqu'à ce jour, la mise au point de ce vaccin s'est avéré plutôt difficile car les corrélats de protection contre l'infection et le contrôle de la maladie ne sont pas encore élucidés. / Pour étudier la réponse immunitaire anti-VIH à médiation cellulaire, la communauté scientifique a besoin des tests plus adéquats. C'est ainsi que nous avons commencé par mettre au point une nouvelle stratégie basée sur l'ELISPOT qui consiste à détecter simultanément la sécrétion d'IFN-γ et d'IL-2 par les cellules VIH-spécifiques. Cette strategie permet d'étudier trois sous-populations des cellules T, aussi bien les cellules CD8+ que les cellules CD4+, les quelles réponses correspondent aux déterminants génétiques exprimés par le virus dans son entièreté. / En ce qui concerne les corrélats de protection contre l'évolution de la maladie, la contribution principale de ce travail de recherche est décrite dans le chapitre 3 de cette thèse. En effet, nous avons montré que la réponse VIH-spécifique reconnaissant le Gag p55 et plus spécifiquement le Gag p24 est associée au control de la virémie aussi bien pendant la primo infection qu'au set point. Ceci suggère que l'efficacité de la réponse immunitaire à médiation cellulaire naturellement acquise ou induite par vaccination dépend primordialement de la capacité de cibler cette portion du virus. En d'autres termes, la mise au point d'un vaccin efficace contre le virus VIH devrait essentiellement viser le développement des réponses cellulaires de forte magnitude dirigées contre le Gag du virus VIH / Dans le chapitre 3 de cette thèse, nous avons étudié l'évolution des différentes sous-populations des cellules VIH-spécifiques telles que détectées par l'ELISPOT à deux couleurs décrits dans le chapitre 2. Dans le même ordre d'idées, nous avons aussi étudié la capacité proliférative de ces sous-populations lymphocytaires pendant la primo infection et l'infection chronique. Nous avons montré que la contribution de la réponse immunitaire sécrétrice d'IFN-γ et d'IL-2 ainsi que leur capacité proliférative sont essentiellement réduites 2 ans après l'infection VIH. / En guise de conclusion, au regard des résultats décrits dans cette thèse, nous estimons avoir contribué à une meilleure compréhension des corrélats de protection contre l'évolution de la maladie. Nous avons en outre mis au point un test qui peut être utilisé pour détecter et analyser des réponses immunitaires à médiation cellulaire contre le VIH et cette stratégie peut être modifiée et adaptée en vue d'étudier la réponse immunitaire à médiation cellulaire contre d'autres virus ou des bactéries infectant les humains. Les résultats décrits dans ce travail de recherche suggèrent que la réponse VIH-spécifique induite par vaccination devrait viser particulièrement la portion Gag du virus en vue de réduire la réplication virale à des faibles taux. Ce qui devrait avoir un impact sur la progression de la maladie ainsi que la transmissibilité à l'échelle individuelle et collective.

Despite recent advancements in our understanding of its pathogenesis, measles virus (MeV) remains a major concern for human health. In developing countries, the impact of MeV infection is particularly dire in part due to vaccine quality issues and malnutrition. Although the mechanism remains poorly understood, the morbidity and mortality due to MeV infection in undernourished children can be significantly improved by vitamin A (VA) supplements. / Small animal models can be very helpful to better understand the activity of defined micronutrients in viral infection. Unfortunately, there is no appropriate small animal model for MeV infection due to the limited host tropism of this virus. Canine distemper virus (CDV) and MeV are both members of the morbillivirus genus and share 88% amino acid homology. Ferret infection with attenuated CDV is highly reminiscent of human MeV, producing many of the same signs and symptoms, including rash, systemic viral dissemination and immunosuppression. Using in vitro models, our laboratory has recently characterized the molecular mechanism of retinoid action against MeV. Using the ferret model, our laboratory has recently demonstrated significant reduction in morbidity in CDV-infected ferrets given high dose VA treatment. / The central goal of this thesis work was to better understand the apparent beneficial influence of VA in CDV infection and to provide the 'missing link' between the in vivo MeV-human and CDV-ferret observations and the in vitro MeV studies. Using immortalized canine cell lines, we have demonstrated that in vitro VA treatment can inhibit CDV replication similarly to the suppression of MeV in human cells. In addition, we used the CDV-ferret model to study the impact of vitamin A deficiency on morbillivirus infection. / CDV-infected ferrets are one of the first models to faithfully reproduce the classic signs and symptoms of MeV in humans. Our results provide further evidence of the utility of this model to study MeV pathogenesis and to explore the antiviral mechanisms of vitamin A during morbillivirus infection. / En dépit des améliorations récentes dans notre compréhension de sa pathogénèse, le virus de la rougeole (MeV) demeure un souci constant pour la santé internationale. Dans des pays en voie de développement, son impact est particulièrement importante, en partie dû à des problèmes de qualité du vaccin et de malnutrition chez les enfants. Bien que le mécanisme demeure mal compris, la morbidité et la mortalité dues à la rougeole chez les enfants mal nourris peuvent être sensiblement améliorées par des suppléments de vitamine A. / Un modèle animal est essentiel pour mieux comprendre l'activité antivirale de la vitamine A. Malheureusement, il n'y a aucun modèle animal approprié pour la rougeole dû au tropisme limité de ce virus. Cependant, le virus de la maladie de Carré (CDV) et le MeV font tout les deux partie du genus des morbillivirus et sont très étroitement liés (homologie de 88% en acide aminé). L'infection du furet avec une souche atténuée de CDV est similaire a celle de la rougeole chez humain, reproduisant les mêmes signes et symptômes, y compris l'éruption cutanée, la dissémination systémique du virus et l'inhibition du système immunitaire chez l'animal. En utilisant ce modèle, notre laboratoire a récemment démontré que le traitement avec une forte dose de vitamin A résulte en une réduction marquée de la morbidité chez les furets infectés par le CDV. En outre, une étude récemment publiée a démontré que le traitement de vitamine A peut inhiber la réplication du MeV dans plusieurs souches de cellules humaines d'origines épithéliales et immunitaires. fr / Malgré notre progrès, beaucoup d'autres aspects de l'influence de la vitamine A sur les infections par des morbillivirus demeurent à être caractérisés. Pour fournir le lien absent entre l'étude in vivo du furet infecté par le CDV et in vitro du MeV, nous avons démontré que le traitement in vitro de vitamine A inhibe la réplication du CDV chez des cellules lymphoides canines pareillement à MeV chez les cellules humaines. En outre, nous avons utilisé le modèle du furet infecté par le CDV pour étudier le rôle de la déficience en vitamine A chez l'infection par des morbillivirus. fr / Le furet infecté par le CDV est un des premiers modèles qui peut reproduire loyalement la pathogénèse du MeV chez l'homme. Nos résultats attesterons davantage de la validité d'employer le modèle de CDV-furet pour étudier la pathogénèse des morbillivirus et les mécanismes antiviraux de la vitamine A sur leurs infections. fr

The genetic differences and polymorphisms between HIV-1 subtype B and non-B subtypes have been well documented. Classically, however, antiretrovirals (ARVs), including protease inhibitors (PIs), have been designed based on structural and functional information obtained utilizing subtype B HIV-1. With the advent of antiretroviral therapy (ART) in developing countries and the emergence of non-B infections in developed countries, the impact of these polymorphisms must be evaluated in terms of ART efficacy. / The 36th amino acid in the viral protease (PR) of B subtypes is Methionine (M), while non-B subtypes code for Isoleucine (I). I at position 36 is associated with PI resistance in subtype B HIV-1; therefore, we sought to investigate the effect of this single nucleotide polymorphism on emergence of resistance mutations and PI susceptibility in various HIV-1 subtypes in vitro. Our results indicate that the effect of this single nucleotide polymorphism appears to be subtype specific and PI specific. / Les différences génétiques (polymorphismes) entre les différents sous-types du VIH-1, soit B et non-B, sont bien documentées. Toutefois, les antirétroviraux incluant les inhibiteurs de la protéase, ont été conçus de façon structurelle et fonctionnelle en utilisant les informations obtenues à partir du sous-type B. L'impact des polymorphismes des différents sous-types du VIH-1 sur l'efficacité des antirétroviraux doit être évalué dû à l'émergence des infections de sous-types non-B dans les pays développés ainsi qu'avec l'arrivée de la thérapie antirétrovirale dans les pays en voie de développement. / Le 36e acide aminé de la protéase virale de sous-type B du VIH-1 est une méthionine. Cependant, cet acide aminé est remplacé par une isoleucine dans les sous-types non-B. La présence d'une isoleucine à la position 36 entraîne une résistance du VIH-1 sous-type B pour les inhibiteurs de la protéase. Nous avons examiné l'effet de ce polymorphisme sur les mutations de résistance dans les différents sous-types de VIH in vitro. Nos résultats indiquent que l'effet de ce polymorphisme serait différent selon le sous-type.

The HIV-1 accessory protein Vif (virion infectivity factor) is required for HIV-1 to replicate in certain "non-permissive" cell types, which include major targets of HIV-1, such as primary T lymphocytes and macrophages, as well as T-cell lines such as H9. Vif is not required for viral replication in other "permissive" cell types such as SupT1, Jurkat, 293, HeLa, and CEM-SS lines. Recent studies demonstrate that non-permissive cells contain a protein called human APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G), which prevents HIV-1 replication in the absence of Vif. The human APOBEC3G (hA3G) is incorporated into HIV-1 during viral assembly, and inhibits HIV-1 replication in newly-infected cells. Vif is able to bind to hA3G in the cytoplasm, and induces degradation of hA3G through proteasome-dependent pathway. This prevents the incorporation of hA3G into HIV-1, thereby abolishing the anti-HIV activity of hA3G. Our project mainly focuses on the antiviral mechanism of hA3G. It has been shown that the presence of hA3G in HIV-1 strongly inhibits the ability of the virus to produce new viral DNA upon infection. Our new observation is that the reduction in late DNA synthesis is due to the hA3G induced inhibition of strand transfer steps in reverse transcription. Analysis of viral cDNA intermediates in vivo reveals that hA3G causes an inhibition of the minus and plus strand transfers, without having a significant impact on DNA elongation. Using an in vitro system to measure minus strand transfer similarly shows a dose-dependent reduction of strand transfer by hA3G. This inhibition of strand transfer occurs independently the editing activity of hA3G and is correlated with its ability to prevent RNaseH degradation of the template RNA. As hA3G expresses in human cells hosting HIV-1, inhibition of Vif-mediated hA3G degradation clearly represents a new anti-HIV-1 strategy for drug discovery. We have established a screening system to discover inhibitors that protect hA3G from Vif-mediated degradation. Through screening, compounds IMB-26 and IMB-35 were identified to be specific inhibitors for the degradation of hA3G by Vif. The inhibitors suppressed HIV-1 replication in hA3G-containing cells but not in those without hA3G. The anti-HIV effect correlated with the endogenous hA3G level. HIV-1 particles from hA3G-expressing cells treated with IMB-26/35 contained a hA3G level higher than that from those without IMB-26/35 treatment, and showed decreased infectivity. IMB-26/35 blocked Vif/hA3G interaction, and therefore protected hA3G from Vif-mediated degradation. The compounds were safe with an anti-HIV therapeutic index >200 in vitro. LD50 of IMB-26 in mice was >1000 mg/kg (intraperitoneally). / La protéine virale du VIH-1 Vif (virion infectivity factor) est nécessaire pour la réplication du VIH dans certains types de cellules dites non permissibles. Ces types de cellules incluent les cellules souches des lymphocytes T et des macrophages, ainsi que les lignées cellulaires des lymphocytes T, comme la lignée H9. Parmi ce groupe de lignées cellulaires, certaines sont les cibles naturelles du virus. Vif n'est pas nécessaire pour la réplication du VIH dans d'autres types de cellules dites permissibles, comme les lignées SupT1, Jurkat, 293, HeLa, et CEM-SS. Des études récentes ont démontré que les lignées non permissibles contiennent la protéine APOBEC3G (Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G). La protéine humaine APOBEC3G (h3AG) est incorporée dans la particule virale durant l'assemblage du VIH et bloque la réplication du virus suite à l'infection de nouvelles cellules. Vif lie la protéine h3AG dans le cytoplasme et induit sa dégradation par le proteasome, ce qui rends les cellules non permissibles susceptibles à l'infection par le VIH.Notre projet consiste à étudier le mécanisme antiviral du h3AG. Il a déjà été montré que le hA3G inhibe la production d'ADN suite à une nouvelle infection. Nous avons remarqué que la réduction de la synthèse d'ADN est le résultat de l'inhibition de changement de brin pendant la transcription reverse. L'analyse des intermédiaires d'ADNc durant la réplication in vivo révèle que le hA3G inhibe les transferts des brins positifs et négatifs sans affecter l'étape d'élongation durant la synthèse d'ADN. Des tests menés in vitro montrent une réduction du transfert bu brin négatif dépendante de la dose du hA3G. Cette inhibition est indépendante de l'activité d'édition du hA3G, mais elle dépend de la capacité du h3AG à inhiber la dégradation de la matrice d'ARN, une étape accomplie par la RNase H. Puisque la hA3G est produite dans les cellules humaines infectées par le VIH, l'inhibition de sa dégradation par Vif constitue une cible potentielle dans un traitement éventuel contre la VIH. Alors, nous avons mis au point un système de criblage pour découvrir des inhibiteurs qui empêcheraient la dégradation de la hA3G par Vif. Nous avons identifié deux composés, IMB-26 et IMB-35, qui inhibent spécifiquement cette dégradation. Ces inhibiteurs ont bloqué la réplication du VIH dans des cellules qui contiennent la hA3G mais n'ont pas montré d'effets sur des cellules qui ne contiennent pas la hA3G. Nous avons observé une corrélation entre le niveau du hA3G et l'effet antivirale. Le traitement des cellules avec les composés IMB-26/35 augmente le niveau du hA3G et diminue la capacité du virus d'infecter de nouvelles cellules. En culture cellulaire, les index thérapeutique de ces composés est >200. Ce qui prévoit qu'ils seront sécuritaires. Chez les souris, la LD50 du IMB-26 est >1000 mg/kg (intra péritonéale). En conclusion, notre projet a permis l'identification de deux nouveaux composés antiviraux qui agissent en stabilisant la hA3G.

Thesis (Ph.D.)--University of California, San Francisco, 2007. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 68-11, Section: B, page: 7176. Adviser: Joseph DeRisi.