Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 Å, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 Å, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 °C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 °C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 °C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 °C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de α-hélice e 42% de folhas- β. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and β-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both β-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 Å, and Rg of 20 and 27 Å, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 °C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 °C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 °C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 °C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de α-helices and 42% de β-sheet.

O aumento na demanda mundial por energia, a perspectiva de encolhimento dos recursos energéticos e a preocupação global com a questão ambiental, despertaram o interesse por fontes alternativas de energia. A biomassa lignocelulósica é abundante e de baixo custo, com potencial para complementar a produção em larga escala de combustíveis. A degradação das moléculas constituintes da parede celular à açúcares fermentescíveis e então à etanol, ocorre através da hidrólise enzimática da biomassa. Contudo, a utilização de enzimas para esse fim encontra-se em estágio exploratório e representa um gargalo na implementação de tecnologias de etanol 2G em escala industrial, desencadeando a busca de celulases bioquimicamente mais ativas, estáveis e economicamente viáveis. O presente trabalho visou a caracterização da endoglucanase I do fungo Trichoderma harzianum, e para isso foi realizada expressão, ensaios bioquímicos e biofísicos do domínio catalítico (ThCel7B-CCD) e da proteína inteira (ThCel7B-full). A enzima exibiu um perfil acidofílico, com atividade ótima em pH 3,0 a 55°C. A proteína também se mostrou capaz de hidrolisar uma variedade de substratos, sendo a maior atividade hidrolítica em β-glucano (75 U mg-1). Ao analisar a estabilidade térmica medida a 55°C em pH 5, a atividade residual manteve-se intacta por mais de 2 meses. Outra característica relevante foi o elevado grau de sinergismo entre ThCel7B e ThCel7A. Análises de microscopia eletrônica de flocos de aveia submetidas à hidrólise com ThCel7B evidenciaram os efeitos de degradação do substrato em relação às amostras controle. O conjunto desses resultados, além de importante para a compreensão do mecanismo molecular de ThCel7B e de outras endoglucanases da família GH7, também revelou uma enzima de interesse biotecnológicos uma vez que o comportamento ácido e sua estabilidade térmica são características relevantes para aplicações industriais sob condições extremamente ácidas. / The increase in global energy demand, shrinkage perspective of energy resources and global concern about environmental issues, aroused interest in finding alternative sources of energy. Lignocellulosic biomass is plentiful and inexpensive, and has the potential to complement the large-scale production of fuel. The degradation of molecules that constitute the cell wall to fermentable sugars and then to ethanol, occurs via the enzymatic hydrolysis of biomass. However, the use of enzymes for this purpose is in exploratory stage and represents a bottleneck in the implementation of 2G ethanol technologies in industrial scale, supporting studies about biochemically most active, stable and economically viable cellulases. This work aimed the characterization of endoglucanase I from fungus Trichoderma harzianum and for that, was performed expression and biochemical and biophysical assays of the catalytic domain (ThCel7B-CCD) and full protein (ThCel7B-full). The enzyme exhibited a acidophilic profile, with optimal activity at pH 3.0 at 55°C. The protein was also able to hydrolyze a variety of substrates, with higher hydrolytic activity in β-glucano (75 U mg-1). Analyzing the thermal stability as pH 5, residual activity remained intact for over 2 months. Another important feature was the high degree of synergy between ThCel7B and ThCel7A (DS 3). Electron microscopy analysis of oat samples subjected to hydrolysis with ThCel7B show the substrate degradation effects in relation to the control samples. All these results, as well as important for understanding the molecular mechanism of ThCel7B and other endoglucanases of GH7 family, also disclose an enzyme of biotechnological interest because the acid behavior and thermal stability are promises of industrial applications under extremely acidic conditions.

Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 Å, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 Å, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 °C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 °C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 °C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 °C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de α-hélice e 42% de folhas- β. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and β-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both β-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 Å, and Rg of 20 and 27 Å, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 °C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 °C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 °C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 °C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de α-helices and 42% de β-sheet.

Bacillus sp VLSH08 screened from sea wetland in Nam Dinh province produces an extracellular endo-1,4-beta-glucanase. According to the results of the classified Kit API 50/CHB as well as sequence of 1500 bp fragment coding for 16S rRNA gene of the Bacillus sp VLSH 08 strain showed that the taxonomical characteristics between the strain VLSH 08 and Bacillus amyloliquefaciene JN999857 are similar of 98%. Culture supernatant of this strain showed optimal cellulase activity at pH 5.8 and 60 Celsius degree and that was enhanced 2.03 times in the presence of 5 mM Co2+. Moreover, the gene encoding endo-1,4-beta-glucanase from this strain was cloned in Escherichia coli using pCR2.1 vector. The entire gene for the enzyme contained a 1500-bp single open reading frame encoding 500 amino acids, including a 29-amino acid signal peptide. The amino acid sequence of this enzyme is very close to that of an EG of Bacillus subtilis (EU022560.1) and an EG of Bacillus amyloliquefaciene (EU022559.1) which all belong to the cellulase family E2. A cocktail of enzyme containing this endo-1,4-beta-glucanase used for biomass hydrolysis indicated that the cellulose conversion attained to 72.76% cellulose after 48 hours. / Chủng vi khuẩn Bacillus sp VLSH08 được tuyển chọn từ tập hợp chủng vi khuẩn phân lập ở vùng ngập mặn tỉnh Nam Định có khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-1,4-beta-glucanase ngoại bào. Kết quả phân loại chủng vi khuẩn Bacillus sp VLSH08 bằng Kit hóa sinh API 50/CHB cũng như trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy độ tương đồng của chủng Bacillus sp VLSH08 và chủng Bacillus amyloliquefaciene JN999857 đạt 98%. Dịch lên men của chủng được sử dụng làm nguồn enzyme thô để nghiên cứu hoạt độ tối ưu của enzyme ở pH 5,8 và nhiệt đô 60oC. Hoạt tính enzyme tăng 2,03 lần khi có mặt 5 mM ion Co2+. Đồng thời, gen mã hóa cho enzyme endo-1,4-betaglucanase cũng được tách dòng trong tế bào Escherichia coli sử dụng vector pCR 2.1. Gen mã hóa cho enzyme này có chiều dài 1500 bp, mã hóa cho 500 axit amin, bao gồm 29 axit amin của chuỗi peptid tín hiệu. So sánh cho thấy trình tự gen endo-1,4-beta-glucanase của chủng Bacillus sp VLSH08 có độ tương đồng cao với enzyme này của chủng Bacillus subtilis (EU022560.1) và của chủng Bacillus amyloliquefaciene (EU022559.1). Tất cả các enzyme nhóm này đều thuộc họ cellulase E2. Enzyme của chủng này cũng đã được phối trộn với các enzyme khác tạo thành cocktail để thủy phân sinh khối cho kết quả cellulose bị thủy phân 72,76% sau 48 giờ.

O aumento na demanda mundial por energia, a perspectiva de encolhimento dos recursos energéticos e a preocupação global com a questão ambiental, despertaram o interesse por fontes alternativas de energia. A biomassa lignocelulósica é abundante e de baixo custo, com potencial para complementar a produção em larga escala de combustíveis. A degradação das moléculas constituintes da parede celular à açúcares fermentescíveis e então à etanol, ocorre através da hidrólise enzimática da biomassa. Contudo, a utilização de enzimas para esse fim encontra-se em estágio exploratório e representa um gargalo na implementação de tecnologias de etanol 2G em escala industrial, desencadeando a busca de celulases bioquimicamente mais ativas, estáveis e economicamente viáveis. O presente trabalho visou a caracterização da endoglucanase I do fungo Trichoderma harzianum, e para isso foi realizada expressão, ensaios bioquímicos e biofísicos do domínio catalítico (ThCel7B-CCD) e da proteína inteira (ThCel7B-full). A enzima exibiu um perfil acidofílico, com atividade ótima em pH 3,0 a 55°C. A proteína também se mostrou capaz de hidrolisar uma variedade de substratos, sendo a maior atividade hidrolítica em β-glucano (75 U mg-1). Ao analisar a estabilidade térmica medida a 55°C em pH 5, a atividade residual manteve-se intacta por mais de 2 meses. Outra característica relevante foi o elevado grau de sinergismo entre ThCel7B e ThCel7A. Análises de microscopia eletrônica de flocos de aveia submetidas à hidrólise com ThCel7B evidenciaram os efeitos de degradação do substrato em relação às amostras controle. O conjunto desses resultados, além de importante para a compreensão do mecanismo molecular de ThCel7B e de outras endoglucanases da família GH7, também revelou uma enzima de interesse biotecnológicos uma vez que o comportamento ácido e sua estabilidade térmica são características relevantes para aplicações industriais sob condições extremamente ácidas. / The increase in global energy demand, shrinkage perspective of energy resources and global concern about environmental issues, aroused interest in finding alternative sources of energy. Lignocellulosic biomass is plentiful and inexpensive, and has the potential to complement the large-scale production of fuel. The degradation of molecules that constitute the cell wall to fermentable sugars and then to ethanol, occurs via the enzymatic hydrolysis of biomass. However, the use of enzymes for this purpose is in exploratory stage and represents a bottleneck in the implementation of 2G ethanol technologies in industrial scale, supporting studies about biochemically most active, stable and economically viable cellulases. This work aimed the characterization of endoglucanase I from fungus Trichoderma harzianum and for that, was performed expression and biochemical and biophysical assays of the catalytic domain (ThCel7B-CCD) and full protein (ThCel7B-full). The enzyme exhibited a acidophilic profile, with optimal activity at pH 3.0 at 55°C. The protein was also able to hydrolyze a variety of substrates, with higher hydrolytic activity in β-glucano (75 U mg-1). Analyzing the thermal stability as pH 5, residual activity remained intact for over 2 months. Another important feature was the high degree of synergy between ThCel7B and ThCel7A (DS 3). Electron microscopy analysis of oat samples subjected to hydrolysis with ThCel7B show the substrate degradation effects in relation to the control samples. All these results, as well as important for understanding the molecular mechanism of ThCel7B and other endoglucanases of GH7 family, also disclose an enzyme of biotechnological interest because the acid behavior and thermal stability are promises of industrial applications under extremely acidic conditions.

Bacillus sp VLSH08 screened from sea wetland in Nam Dinh province produces an extracellular endo-1,4-beta-glucanase. According to the results of the classified Kit API 50/CHB as well as sequence of 1500 bp fragment coding for 16S rRNA gene of the Bacillus sp VLSH 08 strain showed that the taxonomical characteristics between the strain VLSH 08 and Bacillus amyloliquefaciene JN999857 are similar of 98%. Culture supernatant of this strain showed optimal cellulase activity at pH 5.8 and 60 Celsius degree and that was enhanced 2.03 times in the presence of 5 mM Co2+. Moreover, the gene encoding endo-1,4-beta-glucanase from this strain was cloned in Escherichia coli using pCR2.1 vector. The entire gene for the enzyme contained a 1500-bp single open reading frame encoding 500 amino acids, including a 29-amino acid signal peptide. The amino acid sequence of this enzyme is very close to that of an EG of Bacillus subtilis (EU022560.1) and an EG of Bacillus amyloliquefaciene (EU022559.1) which all belong to the cellulase family E2. A cocktail of enzyme containing this endo-1,4-beta-glucanase used for biomass hydrolysis indicated that the cellulose conversion attained to 72.76% cellulose after 48 hours. / Chủng vi khuẩn Bacillus sp VLSH08 được tuyển chọn từ tập hợp chủng vi khuẩn phân lập ở vùng ngập mặn tỉnh Nam Định có khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-1,4-beta-glucanase ngoại bào. Kết quả phân loại chủng vi khuẩn Bacillus sp VLSH08 bằng Kit hóa sinh API 50/CHB cũng như trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy độ tương đồng của chủng Bacillus sp VLSH08 và chủng Bacillus amyloliquefaciene JN999857 đạt 98%. Dịch lên men của chủng được sử dụng làm nguồn enzyme thô để nghiên cứu hoạt độ tối ưu của enzyme ở pH 5,8 và nhiệt đô 60oC. Hoạt tính enzyme tăng 2,03 lần khi có mặt 5 mM ion Co2+. Đồng thời, gen mã hóa cho enzyme endo-1,4-betaglucanase cũng được tách dòng trong tế bào Escherichia coli sử dụng vector pCR 2.1. Gen mã hóa cho enzyme này có chiều dài 1500 bp, mã hóa cho 500 axit amin, bao gồm 29 axit amin của chuỗi peptid tín hiệu. So sánh cho thấy trình tự gen endo-1,4-beta-glucanase của chủng Bacillus sp VLSH08 có độ tương đồng cao với enzyme này của chủng Bacillus subtilis (EU022560.1) và của chủng Bacillus amyloliquefaciene (EU022559.1). Tất cả các enzyme nhóm này đều thuộc họ cellulase E2. Enzyme của chủng này cũng đã được phối trộn với các enzyme khác tạo thành cocktail để thủy phân sinh khối cho kết quả cellulose bị thủy phân 72,76% sau 48 giờ.