Hydroxytyrosol [2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethanol], a potent bioactive molecule mainly present in virgin olive oil and to a lower extent in wine, is also a by-product of dopamine metabolism. In a previous clinical trial designed to assess the effects of moderate wine intake it was found that hydroxytyrosol urinary recoveries were higher than the corresponding to the dose administered, suggesting an endogenous formation. The aim of the present work was to assess new mechanisms responsible for hydroxytyrosol generation by using an array of methodologies and studies ranging from in vitro assays to in vivo experiments in animal models and humans. The mechanisms identified as being involved in the generation of hydroxytyrosol were (1) CYP2A6/CYP2D6-catalyzed tyrosol-to-hydroxytyrosol biotransformation, (2) ethanol-induced increase in tyrosol bioavailability, and (3) alteration of dopamine oxidative metabolism due to ethanol. Considering these observations, it is postulated that hydroxytyrosol may contribute significantly to the health effects derived from moderate wine intake. / L’hidroxitirosol [2-(3,4-dihidroxiphenil)etanol], una potent molècula bioactiva present de forma rellevant a l’oli d’oliva verge i minoritàriament al vi, és també un producte del metabolisme de la dopamina. En un assaig clínic previ dissenyat per avaluar els efectes del consum moderat de vi es trobà que les recuperacions urinàries d’hidroxitirosol eren superiors a la dosi administrada, suggerint-ne una gènesi endògena. L’objectiu del present treball fou estudiar nous mecanismes responsables de la generació d’hidroxitirosol mitjançant diverses tècniques i estudis, des d’assajos in vitro a experiments in vivo en animals i humans. Els mecanismes involucrats a la generació d’hidroxitirosol són (1) la biotransformació de tirosol a hidroxitirosol catalitzada per CYP2A6/CYP2D6, (2) l’augment a la biodisponibilitat del tirosol induïda per l’etanol, i (3) l’alteració del metabolisme oxidatiu de la dopamina per l’etanol. Globalment, aquestes observacions donen a l’hidroxitirosol un paper clau en la comprensió dels efectes beneficiosos associats al consum moderat de vi.

Over the past years it has been described the important role of oxidative stress in the Metabolic Stress related manifestations, specifically in the obesity. It is well known that agents that reduce oxidative stress represent an important tool to reduce the obesity-induced complications such as hepatic steatosis. In this sense, flavonoids are described as antioxidant molecules, due to their scavenging properties. Moreover, omega-3 PUFAs are considered effective in the treatment and prevention of several chronic diseases. Therefore, the principal aim of this thesis was to study the antioxidant effects of flavonoids and n-3 PUFAs, as well as the possible additive effects of two compounds together. These studies were developed under several oxidative stress conditions (metabolic, chemical) both in vitro and in vivo. It has been demonstrated the importance of using nutritional supplements in different oxidative stress conditions. / Durant els últims anys s’ha descrit la importància que té l’estrès oxidatiu en les diferents patologies associades al Síndrome Metabòlic, especialment en l’obesitat. Així, agents que redueixen l’estrès oxidatiu son una important eina per reduir les complicacions relacionades amb l’obesitat, incloent la esteatosis hepàtica, definida com l’acumulació de greix al fetge. En aquest sentit, els polifenols, que presenten activitat antioxidant, i els àcids grassos poliinsaturats omega-3 que són considerats efectius en el tractament d’esteatosis hepàtica i en el desenvolupament de malalties cardiovasculars, són una bona eina per combatre aquest estrès oxidatiu. En aquesta tesi, s’ha estudiat en condicions d’estrès oxidatiu tant in vitro (hepatòcits) com in vivo (estat postprandial, estat d’obesitat induïda per la dieta o d’obesitat genètica) els efectes antioxidants dels flavonoides i/o omega-3 tant de manera individual com conjunta. S’ha demostrat la importància d’utilitzar suplements alimentaris en condicions metabòliques d’estrès oxidatiu.

L’objectiu d’aquesta tesis es desenvolupar una nova estratègia preventiva i terapèutica que requereixi les mínimes modificacions dels hàbits dietètics simultàniament efectiva en contra de l’obesitat i les seves malalties associades. Per aquest estudi s’han seleccionat compostos alimentaris presents en una dieta sana on el seus efectes beneficiosos han estat documentats tant en la obesitat com el risc de patir malalties cardiovasculars. S’inclou els polifenols com l’epigallocatechin gallate (EGCG) i les proantocyanidines i també els àcids grassos poliinsaturats omega 3 (PUFAs) o l’àcid docosahexaenoic (DHA). El treball esta enfocat en el funcionament mitocondrial del múscul, el teixit mes important de l’organisme en el control del balanç de nutrients. Els nostres resultats indiquen que hi ha una millora postprandial amb un increment de la capacitat d’oxidació dels àcids grassos millorant el perfil lipídic i la flexibilitat metabòlica. / El objetivo principal de esta tesis es desarrollar una nueva estrategia preventiva y terapéutica que requiera les mínimas modificaciones de los hábitos dietéticos simultáneamente efectiva en contra de la obesidad y sus enfermedades asociadas. Para este estudio se han seleccionado compuestos alimentarios presentes en una dieta sana dónde sus efectos beneficiosos han estado documentados tanto en la obesidad como en el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares. Se incluyen los polifenoles como el epigalocatequin galato (EGCG) y las proantocianidinas; también los ácidos grasos poliinsaturados omega 3 (PUFAs) y el acido docosahexaenoico (DHA). El trabajo está enfocado en el funcionamiento mitocondrial de musculo, el tejido más importante del organismo en el control del balance de nutrientes. Nuestros resultados indican que hay una mejora postprandial con un incremento de la capacidad de oxidación de los ácidos grasos mejorando el perfil lipídico y la flexibilidad metabólica. / The global goal of the present thesis is the development of a new preventative and therapeutic strategy that requires only minor modifications of dietary habits and simultaneously effective against obesity and its major associated diseases. For this study, we have selected food ingredients characteristic in healthy diets which has been documented beneficial effects on obesity or cardiovascular disease risk. These include plant polyphenols, epigallocatechin gallate (EGCG) and proanthocyanidins as well as the sea fish omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and docosahexaenoic acid (DHA). Our work is focused on the mitochondrial function of skeletal muscle, a major player in the body’s overall nutrient balance, and adipose tissue, which is the key regulator of energy homeostasis in the organism affected by obesity and related diseases. Our results indicate a postprandial improvement with an increase of the fatty acid oxidation capacity, improving lipid profile and metabolic flexibility.

The answer to whether or not, human pancreatic ribonuclease may have a diagnostic value as a serum marker of pancreatic disease, depend upon the specific detection of ribonucleases originated in pancreas amogn those coexisting in serum. From our point of view, two approaches would be necessary. On one hand the characterization of the carbohydrate component of the human pancreatic ribonuclease because glycosylation is organ-specific. On the other hand, obtain monoclonal antibodies in order to specifically recognize the secretory -typeribonuclease in serum. The purification system that has been established consists of two chromatographic steps using HPLC. The first, an exchange cromatography, allows for a partial purification of ribonuclease component. The second, a reversed-phase chromatography, resolves chromatographically the human pancreatic ribonuclease heterogeneity into different fractions / La resposta a si la ribonucleasa de pàncreas humà pot tenir algun valor diagnòstic com a marcador sèric de disfuncions pancreàtiques passa per la identificació de forma inequívoca de la ribonucleasa de pàncreas humà en sèrum. Segons el nostre enfoc, caldrien dues aproximacions, d’una banda la caracterització a nivell glucídic de la ribonucleasa de pàncreas humà, i de l’altra, el desenvolupament d’anticossos monoclonals dirigits a discriminar la ribonucleasa de tipus secretori d’entre els diferents tipus que coexisteixen en sèrum. En aquest sentit s’ha establert un sistema de purificació de la ribonucleasa pancreàtica humana que fos ràpid i repetitiu que respectés l’heterogeneïtat glucídica per a la seva posterior caracterització. El sistema de purificació establert a partir de pàncrees obtinguts a partir de donants sans d’òrgans consta de dues etapes cromatogràfiques per HPLC. La primera, una cromatografia de bescanvi catiònic, possibilita una purificació parcial, mentre la cromatografia de la fase inversa permet resoldre cromatogràficament l’heterogeneïtat de la ribonucleasa humana de pàncreas en diferents fraccions

Electrospinning is a manufacturing process that uses an electric field to produce fibers from a polymer solution. The accumulation of these fibers conform a three-dimensional fiber matrix or scaffold. Fibers can be prepared in a wide diameter range, namely from a micrometer to nanometer size. Furthermore, the fiber matrix or scaffold has a large surface per mass unit, a porous structure and mechanical properties influenced by the orientation of the fibers. The electrospinning technique is highly versatile and therefore a large number of polymers with different properties can be processed. However, a large number of variables can influence the characteristics of the resulting fibers, either because they are related to the polymer properties (e.g., solubility, molecular weight, etc.) or with the specific processing parameters (voltage, flow rate or distance tip-collector). Electrospun fiber matrices are attractive for biomedical applications as for example tissue engineering and drug delivery systems. In the last case, it is important the possibility to load the fibers with different drugs for their direct and localized administration into the human body. The goal of this Thesis is the study of different matrices constituted by electrospun micro- nanofibers and specifically four points have been considered. In the first one, polylactide electrospun scaffolds have been loaded with different molecules with antioxidant activity (i.e., vitamin B6 in pyridoxine and pyridoxal forms, p-coumaric acid and caffeic acid). The influence of these molecules on physical properties, morphology, in vitro release profiles and biocompatibility was determined. Furthermore, the application of these new materials for the inhibition of oxidative DNA damage caused by free radical initiators was demonstrated, and consequently, they appear appropriate candidates for purification of plasmidic or genomic DNA. In the second point, PLLA matrices loaded with two or three drugs were prepared in order to get a multifunctional activity. Thus, antioxidant, anti-inflammatory and antimicrobial molecules were considered in order to prevent chain oxidation processes in different biomolecules (proteins, DNA, etc.), avoid the subsequent local inflammation, and reduce the potential risk of microbial infection of wounds, respectively. These matrices are especially interesting due to the synergies and antagonisms that may occur during their simultaneous release. In the third point, the possibility of preparing biodegradable scaffolds from non electrospinable polymers has been considered. These polymers may have advantages like conductivity/electroactivity or bactericide activity. Hybrid scaffolds constituted by different ratios of polylactide as a biodegradable polymer and (poly(3-thiophene methyl acetate)) as electroactive polymer were evaluated. PLA nanofibers were also successfully loaded with polyhexamethylenebiguanide hydrochloride giving rise to 3D biodegradable scaffolds with a well proven antibacterial activity and a release that was highly dependent on the hydrophilicity of the medium. Finally electrospun scaffolds were obtained using a sacrificial polymer (e.g. poly(ethylene glycol) (PEG)) that could easily be subsequently removed by solubilization in aqueous media. Three approaches were evaluated: a) Preparation of scaffolds constituted by different ratios of PLA and PEG electrospun fibers, b) Preparation of scaffolds constituted by electrospun fibers with different PLA and PEG content; c) Preparation of scaffolds constituted by coaxial electrospun fibers with different core-shell polymer distributions. Cell colonization was in all cases favoured. The three procedures allowed preparing scaffolds with a differentiated drug release behavior. / La técnica de 'electrospinning' o electrohilado es un proceso de fabricación que utiliza un campo eléctrico para producir fibras a partir de disoluciones de polímeros. La acumulación de estas fibras conforma una matriz tri-dimensional o 'scaffold', y las fibras pueden ser preparadas en escala micro y nanométrica. Además, estas matrices o 'scaffold' se caracterizan por su gran superficie por unidad de masa, estructura porosa y propiedades mecánicas influenciadas por la orientación de las fibras. El 'electrospinning' es muy versátil y un gran número de polímeros con diferentes propiedades pueden ser procesados. Sin embargo, un gran número de variables pueden influir en las características de las fibras obtenidas, siendo variables propias del polímero (p.e., solubilidad, peso molecular, etc.) o relacionadas a los parámetros del proceso (voltaje, flujo, distancia colector-aguja). Estas matrices de fibras son atractivas para aplicaciones biomédicas como la ingeniería de tejidos y sistemas de liberación controlada de fármacos. En el último caso, es importante la carga de diferentes fármacos o drogas para su administración directa y localizada en el cuerpo humano. El objetivo de esta Tesis es el estudio de diferentes matrices constituidas por nano o microfibras electrohiladas. El desarrollo de este estudio se divide en cuatro bloques. En el primer bloque, matrices de fibras de poliláctico (PLA) fueron cargadas con diferentes moléculas con actividad antioxidante (vitamina B6 en sus formas de piridoxina y piridoxal, ácido p-cumárico y ácido cafeico). Se determinó la influencia de estas moléculas sobre las propiedades físicas, morfología, liberación in vitro y biocompatibilidad de dichas matrices. Además, se demostró la aplicación de estos nuevos materiales en la inhibición del daño oxidativo del ADN causado por iniciadores de radicales libres, y en consecuencia, estas matrices serían útiles para la purificación de ADN plasmídico o genómico. En el segundo bloque, las matrices de PLA fueron cargadas con dos o tres fármacos para obtener matrices multifuncionales en base a sus actividades. Con esta finalidad, moléculas con actividad antioxidante, anti-inflamatoria, y antimicrobiana fueron cargadas en las matrices para evitar los procesos de oxidación de diferentes biomoléculas (proteínas, ADN, etc.), evitar la inflamación local, y reducir el riesgo potencial de infección microbiana de las heridas, respectivamente. Estas matrices son especialmente interesantes debido a las sinergias y antagonismos que pueden ocurrir durante su liberación simultánea. En el tercer bloque, se prepararon matrices biodegradables a partir de polímeros no-electrohilables. Estos polímeros pueden presentar características particulares, como actividad bactericida, o actividad conductora/electroactividad. Matrices hibridas conformadas con diferentes ratios de PLA usado como polímero biodegradable y el poli(3-tiofeno metil acetato) como polímero electroactivo fueron preparadas y evaluadas. También se prepararon matrices de nanofibras de PLA cargadas con clorhidrato de polihexametilenbiguanida (PHMB) obteniéndose matrices biodegradables con actividad antibacteriana, y la liberación del PHMB fue altamente dependiente de la hidrófilicidad del medio. Finalmente, en el cuarto bloque, se prepararon matrices electrohiladas usando un polímero de sacrificio (polietilenglicol o PEG) que puede ser eliminado fácilmente por solubilización en medios acuosos. Tres preparaciones diferentes fueron evaluadas: a) Matrices constituidas por diferentes proporciones de PLA y PEG en las fibras, b) Matrices constituidas por fibras de PLA y fibras de PEG y, c) Matrices constituidas por fibras coaxiales con diferentes distribuciones de polímeros en el núcleo y la corteza de la fibra. La colonización celular en todas estas matrices fue mejorada. Estos tres procedimientos permitieron obtener matrices con diferentes comportamientos para la liberación de fármacos.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process by which epithelial cells acquire a mesenchymal phenotype. It is characterized by the down-regulation of the adherens junction protein E-cadherin, and it is important during embryonic development. Snail1 expression is sufficient to trigger EMT in cultured cells and is found up-regulated in some cancers. Snail1 is stabilized both at mRNA and protein levels and in this project we analyzed the action of ubiquitin ligases affecting protein half-life. Apart from the already described β-Trcp1, that degrades Snail1 in a GSK-3β phosphorylation-dependent manner, we found the F-box proteins FBXL14 and FBXL5 as novel E3 ubiquitin ligases for Snail1. FBXL14 is a cytoplasmic ubiquitin ligase that is down-regulated in hypoxia through a transcriptional mechanism. FBXL5 is nuclear and modulates Snail1 binding to the DNA and nuclear ubiquitination. FBXL5 protein is destabilized after γ-irradiation, inducing high levels of Snail1. Together, these ligases keep a tight control of Snail1 cellular levels, maintaining them low in normal conditions. / La transició epiteli-mesènquima (per l’acrònim en anglès de: “epithelial to mesenchymal transition”, EMT) és un procés durant el qual cèl•lules epitelials adquireixen un fenotip mesenquimal. Està caracteritzat per la baixada de l’E-caderina, una proteïna de les unions adherents, i és important en el desenvolupament embrionari. L’expressió de Snail1 és suficient per desencadenar la EMT en cèl•lules en cultiu i s’ha trobat sobre-expressada en alguns càncers. Snail1 s’estabilitza tant a nivell de mRNA com de proteïna i en aquest projecte hem analitzat l’acció de les lligases d’ubiquitina que afecten els nivells de la proteïna. Apart de la ja descrita β-Trcp1, que degrada Snail1 de manera depenent a la fosforilació de Snail1 per GSK-3β, hem trobat les proteïnes F-box FBXL14 i FBXL5 con a noves lligases d’ubiquitina E3 que degraden Snail1. La FBXL14 és citoplasmàtica i els seus nivells disminueixen en hipòxia a través d’un mecanisme transcripcional. La FBXL5 és nuclear i modula tant la unió de Snail1 al DNA com la seva ubiquitinació nuclear. La proteïna FBXL5 es desestabilitza degut a la radiació gamma (γ) induint els nivells de Snail1.

En Drosophila, el desequilibrio en cuanto al contenido de genes ligados al cromosoma X entre hembras (XX) y machos (XY) es corregido mediante la duplicación de la transcripción del único cromosoma X del macho. Este proceso, llamado compensación de dosis, es mediado por un ensamblaje molecular compuesto por al menos cinco proteínas (MSL1, MSL2, MSL3, MLE y MOF) y dos RNAs largos no codificantes (roX1 y roX2), llamado complejo de compensación de dosis (DCC). La compensación de dosis requiere dos condiciones fundamentales: el reconocimiento específico del cromosoma X por el DCC, y la restricción del proceso a moscas macho. La proteína de unión a RNA Upstream-of-N-Ras (UNR) está implicada en la consecución de ambas condiciones, y aquí hemos estudiado los mecanismos moleculares por los que UNR actúa. Hemos encontrado que, en machos, UNR promueve la compensación de dosis facilitando la asociación de roX2 a MLE, necesaria para una correcta formación del DCC y para su unión al cromosoma X. En hembras, UNR inhibe la compensación de dosis, al menos en parte, promoviendo la unión de SXL al extremo 3’ UTR del mRNA que codifica para msl2, lo que resulta en represión de la traducción de msl2 e inhibición de la formación del DCC. / In Drosophila, the imbalance in X-linked gene content between females (XX) and males (XY) is restored through the 2-fold hypertranscription of the single male X-chromosome. This process, which is called dosage compensation, is mediated by the action of the dosage compensation complex (DCC), a ribonucleoprotein assembly composed of at least five proteins (MSL1, MSL2, MSL3, MLE and MOF) and two long non-coding RNAs (roX1 and roX2). Two features are essential for correct dosage compensation: the specific recognition of the X-chromosome by the DCC and the confinement of the DCC function to the male organism. The RNA binding protein Upstream of N-ras (UNR) is involved in the regulation of these two processes and we have dissected the molecular mechanisms by which this regulation occurs. We have found that, in male flies, UNR promotes dosage compensation by facilitating the association of roX2 with MLE, which is required for correct DCC formation and X-chromosome targeting. In female flies, UNR represses dosage compensation in part by enhancing the binding of SXL to the 3’UTR of msl2 mRNA, thus ensuring tight msl2 translational repression and subsequent inhibition of DCC formation.

Las proantocianidinas ejercen efectos beneficiosos sobre algunos desordenes metabólicos que se consideran factores de riesgo de las enfermedades cardiovasculares. La desregulación del metabolismo lipoproteico juega un papel muy importante en los estados lipídicos alterados. Por lo tanto, los objetivos de esta Tesis fueron: estudiar la contribución del hígado y el intestino en la respuesta hipolipidémica de las proantocianidinas y evaluar los efectos de las proantocianidinas en modelos dislipidémicos nutricionales. Para realizar los experimentos se utilizaron tres modelos experimentales: ratas, ratones y células Caco2. Los resultados obtenidos fueron: que en un test de tolerancia lipídica tanto los quilomicrones como las VLDL contribuyen al efecto hipotrigliceridémico de las proantocianidinas pero su influencia depende del tiempo. Además, las proantocianidinas reprimen la secreción de TG por el hígado in vivo y por el intestino in vitro. ACSL se manifiesta como un gen diana de ellas en las células intestinales. Y finalmente, las proantocianidinas corrigen la dislipidemia pero no contrarrestan la ganancia de peso inducida por la dieta aunque estas tienen un efecto bimodal sobre la retención de energía in vivo. / Proanthocyanidins have been shown to exert advantageous actions on several metabolic disorders that are risk factors of cardiovascular diseases. Lipoprotein metabolism plays an important role in altered lipid states. Therefore, the aims of this Thesis were: To assess the contribution of the liver and the intestine in the hypolipidemic response triggered by proanthocyanidins and to evaluate the short-term effect of an oral intake of proanthocyanidins in dyslipidemic nutritional models. For these purposes, three experimental models have been used: Rats, mice and human Caco2 cells. The obtained results are: In a fat tolerance test, both chylomicrons and VLDL contribute to the hypotriglyceridemic action of proanthocyanidins but their influence depends on time. Moreover, proanthocyanidins repress TG secretion by the liver in vivo and by the intestine in vitro. Furthermore, ACSL manifests as their target gene in intestinal cells. Finally, proanthocyanidins correct dyslipidemia but not the weight gain induced by diet though these have a bimodal effect on energy retention in vivo.

Human color perception is mediated by cone photoreceptor cells which mainly locate on the fovea of the eye. Bright light activates the photosensitive opsin pigments which are embedded in the outer segment membrane discs of cone retinal cells thereby initiating the complex process of photopic vision with a fast response. The cone visual pigments are G-protein coupled receptors which share analogous structure and functional features with rhodopsin, the most thoroughly studied G-protein coupled receptor from rod photoreceptor cells mediating scotopic vision and distributed throughout the retina. These visual pigments modulate spectral tuning of visible light depending on the molecular variance around the protein bound chromophore, 11-cis-retinal, which is a vitamin A derivative acting as an inverse agonist. Various mutations have been clinically identified in the cone opsin genes and associated with visual dysfunction ranging from mild color blindness to severe cone dystrophies. As the crystal structure of the cone pigments is yet to be resolved, identifying key molecular mechanisms that play major roles in optimal functioning of these photoreceptor proteins, should be helpful in providing a deeper understanding of their function and in designing novel therapeutic strategies for congenital retinal cone dysfunction. In order to study such light sensitive, delicate membrane proteins, the human cone opsin genes have been transiently expressed in mammalian cells, regenerated with their natural chromophore and immunopurified in dark conditions. The purified recombinant chromophore-regenerated cone opsins in solution have been characterized in detail by means of biophysical approaches, including spectroscopic, biochemical, and functional analysis, in order to uncover novel properties that help in optimizing the function of these receptors. Site-directed mutagenesis was employed to obtain the clinically identified mutations in cone opsins related to visual disorders and to compare the structure and function of these mutated opsins with the molecular properties of the wild-type cone opsins expressed in the same way. The results of the present study indicate that the cone opsins are less stable in solution and their retinal binding site is more open than rhodopsin. The ligand binding studies using retinal analogs, show that the photoactivated rhodopsin loses its ability to regenerate with its natural chromophore with time but not with an analog, 9-cis-retinal but cone opsin shows regeneration with both retinal analogs under the same experimental conditions. The highly identical red and green cone opsins exhibit different ligand binding modes during regeneration with their natural chromophore, 11-cis-retinal. A secondary retinal uptake, with a slower kinetics, has been also observed with the red and green cone pigments during regeneration with 11-cis-retinal which is altered in the case of blue cone opsin. The role of specific amino acids involved in the regeneration mechanism has also been clarified. Most of the cone opsin mutants studied, associated with visual disorders, fail to regenerate with the ligand due to protein misfolding resulting in aggregation in solution. R330Q green cone opsin mutant show a regeneration ability similar to that of the native pigment but a compromised transducin binding efficiency. Though the N94K deuteranopic mutant apparently aggregates when expressed in mammalian, chromophore binding to opsin would be through an unprotonated Schiff base linkage. Overall, in the present study the molecular properties of cone opsins have been compared among them and with the well-studied rhodopsin. This has led to the proposal of novel molecular mechanisms for cone opsins. The determined structural differences between visual pigments may be linked to their molecular evolution, and the proposal of secondary retinoid binding to visual pigments may function as a regulatory mechanism of dark adaptation. / La percepción del color humano se realiza a través de las células fotorreceptoras de los conos, localizados en la fóvea del ojo. La luz brillante activa los pigmentos fotosensibles que se encuentran en los discos de membrana del segmento externo de estas células iniciando con ello el complejo y rápido proceso de la visión fotópica. Los pigmentos visuales conos son receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que comparten estructura análoga y características funcionales a la rodopsina, el GPCR más estudiado y localizado en las células fotorreceptoras de los bastones y responsable de la visión escotópica . Estos pigmentos visuales modulan la sintonización espectral de la luz visible, dependiendo de las diferencias moleculares alrededor del cromóforo ligado a la proteína, 11-cis-retinal, que es un derivado de la vitamina A y que actúa como un agonista inverso. Varias mutaciones han sido identificadas clínicamente en los genes de las opsinas de los conos asociadas a disfunciones visuales; desde la leve ceguera al color a la grave distrofia de las células fotorreceptoras. Como la estructura cristalina de los pigmentos de los conos está todavía por resolver, identificar mecanismos moleculares que juegan un papel importante en el funcionamiento óptimo de estas proteínas, ayudará a obtener una comprensión más profunda de su función y al diseño de nuevas estrategias terapéuticas para la disfunción congénita de los conos. Con el fin de estudiar estas proteínas de membrana sensibles a la luz y delicadas, se han expresado transitoriamente en células de mamífero, regenerado con su cromóforo natural, inmunopurificado en oscuridad y se han caracterizado por medio de técnicas biofísicas, bioquímicas, y funcionales, a fin de descubrir nuevas propiedades que ayuden a la optimización de su función. Mutagénesis dirigida se ha utilizado para obtener las mutaciones clínicamente identificados en opsinas de conos relacionados con los trastornos visuales y comparar la estructura y la función de estas opsinas mutadas con las propiedades moleculares de opsina de conos cono salvaje. Los resultados del presente estudio indican que las opsinas de los conos son menos estables y su sitio de unión al retinal es más abierta que en la rodopsina. Estudios de unión al ligando utilizando análogos del retinal, muestran que la rodopsina fotoactivada pierde su capacidad de regenerarse con su cromóforo natural con el tiempo, aunque la mantiene con el análogo 9-cis-retinal, comparado con la regeneración de los conos, que pueden hacerlo con ambos análogos de retinal. Las altamente idénticas opsinas de conos rojo y verde muestran modos de unión diferente al ligando durante la regeneración con su cromóforo natural, 11-cis retinal. También se ha observado una captación secundaria de retinal, con una cinética más lenta, con los pigmentos de los conos rojos y verdes durante la regeneración con 11-cis-retinal que se altera en el caso de los conos azules. También se discute el papel de los aminoácidos específicos implicados en el mecanismo de la regeneración. La mayoría de los mutantes estudiados, no logran regenerar con el ligando debido al mal plegamiento proteico. El cono verde R330Q muestra una capacidad de regeneración similar a la del pigmento nativo, pero con una baja eficacia de unión a la proteína G, transducina. Aunque inicialmente el mutante N94K parece agregado cuando se expresa en células de mamífero, el cromóforo que se une a la opsina a través de una base de Schiff no protonada. En general, este estudio compara las propiedades moleculares de las opsinas de conos entre ellos y con la rodopsina, proponiendo nuevos mecanismos moleculares para las opsinas de conos. Las diferencias estructurales entre determinados pigmentos visuales pueden estar relacionados con su evolución molecular, y la propuesta de la unión secundaria de retinal a estos pigmentos visuales puede funcionar como un mecanismo de regulación de la adaptación a la oscuridad.

La malaltia del fetge gras no alcohòlic (MFGNA) inclou un espectre histològic que va des de la esteatosi simple (SS) a l'esteatohepatitis no alcohòlica (EHNA), sent aquesta última freqüentment progressiva. Donat que l'acumulació hepàtica de lípids sembla ser un mecanisme crucial en la patogènesi de la MFGNA, una millor comprensió dels mecanismes subjacents que condueixen a l'acumulació inicial de lipíds hepàtics podria ser de gran interès per controlar la progressió de la malaltia. El sistema endocannabinoide (SE), mitjançant principalment els receptors cannabinoides CB1 i CB2, sembla ser que juga un paper important en la patogènesi de la MFGNA modulant el metabolisme lipídic. Així, la hipòtesi establerta és que, en pacients amb MFGNA, l'expressió de gens i factors de transcripció implicats en la regulació del metabolisme lipídic hepàtic, així com l'expressió dels receptors cannabinoides pot estar alterada; i aquesta alteració podria estar relacionada amb l'aparició de dany hepàtic. En conseqüència, vam evaluar l'expressió hepàtica d'alguns gens clau involucrats en la síntesi de novo d'àcids grassos (AG), captació i transport d’AG, oxidació d’AG, inflamació, així com l’expressió de CB1 i CB2 en una extensa cohort de dones obeses mòrbides amb MFGNA segons la seva histologia hepàtica. La principal troballa ha estat que, en el fetge de dones obeses mòrbides amb SS, els gens clau involucrats en la síntesis de novo d’AG presenten una relació inversa amb el grau histològic d’esteatosi, suggerint que la via lipogènica podria estar disminuïda en etapes avançades d’SS. Respecte al SE, els nostres resultats suggereixen un paper perjudicial de CB1 en la MFGNA, mentre que el rol de CB2 no és del tot aclarit. / La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) incluye un espectro histológico que va desde la esteatosis simple (SS) a la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), siendo esta última frecuentemente progresiva. Dado que la acumulación hepática de lípidos parece ser un mecanismo crucial en la patogénesis de la EHGNA, una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes que conducen a la acumulación inicial de lípidos hepáticos podría ser de gran interés para controlar la progresión de la enfermedad. El sistema endocannabinoide (SE), mediado principalmente por los receptores cannabinoides CB1 y CB2, parece juegar un papel importante en la patogénesis de la EHGNA modulando el metabolismo lipídico. Así, la hipótesis establecida es que, en pacientes con EHGNA, la expresión de genes y factores de transcripción implicados en la regulación del metabolismo lipídico hepático, así como la expresión de los receptores cannabinoides puede estar alterada; y esta alteración podría estar relacionada con la aparición de daño hepático. En consecuencia, evaluamos la expresión hepática de algunos genes clave involucrados en la síntesis de novo de ácidos grasos (AG), captación, transporte y oxidación de AG, inflamación, así como la expresión de CB1 y CB2 en una extensa cohorte de mujeres obesas mórbidas con EHGNA según su histología hepática. El principal hallazgo fue que, en el hígado de mujeres obesas mórbidas con SS, los genes clave involucrados en la síntesis de novo de AG presentan una relación inversa con el grado histológico de esteatosis, sugiriendo que la via lipogénica podría estar disminuida en estadios avanzados de esteatosis. Respecto al SE, nuestros resultados sugieren un papel perjudicial de CB1 en la EHGNA, mientras que el papel de CB2 no es del todo esclarecido. / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) encompasses a histological spectrum from simple steatosis (SS) to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), with the latter being more frequently progressive. Due to lipid accumulation in the human liver seems to be a crucial mechanism in the NAFLD pathogenesis, an improved understanding of the underlying mechanisms leading to the initial hepatic lipid accumulation could be of great interest for controlling the progression of NAFLD. It has also been reported that the endocannabinoid (EC) system, mediated mainly by CB1 and CB2 cannabinoid receptors, plays an important role in NAFLD pathogenesis by modulating lipid metabolism. We therefore hypothesized that in patients with NAFLD, the expression of genes and transcription factors involved in the regulation of hepatic lipid metabolism, as well as the expression of cannabinoid receptors could be altered; and this alteration may be related to the onset of liver damage. Consequently, we wished to further investigate the fatty acid (FA) metabolism and the EC system by evaluating the hepatic expression of some key genes involved in de novo synthesis FA, FA uptake and transport, FA oxidation, and inflammation; as well as CB1 and CB2 expression in an extensive cohort of morbidly obese (MO) women according to their liver histology. The major finding is that, in liver of MO women with SS, the key genes related to de novo fatty acid synthesis have an inverse relationship with the histological degree of simple steatosis; suggesting that the lipogenic pathway seems to be down-regulated in advanced stages of SS. Regarding the EC system, our results suggest a deleterious role of CB1 in NAFLD, while the role of CB2 is not fully clarified.