Transgenic approaches hold great promise in alleviating, to a major extend such micronutrient deficiencies as exemplified by numerous reports in the literature over the past decade. However, there is a limited understanding of the regulatory mechanisms that control the accumulation of specific vitamins in plants. For this reason, I analyzed a maize population expressing combinations of the carotenogenic genes Zmpsy1, PacrtI, Gllycb, Glbch and ParacrtW in an effort to unravel as yet unknown regulatory bottlenecks.I also investigated in more detail the corn bch family. My results suggest that diverse regulatory strategies may be in operation to control the accumulation of carotenoids in endosperm tissue. I recovered multiple independent transgenic rice lines expressing Arabidopsis thaliana ρ hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD), which catalyzes the first committed step in vitamin E biosynthesis. My results revealed bottlenecks that act as metabolic tipping points in the pathway.

Les glutaredoxines són tiol oxidoreductases que regulen l'estat redox dels grups sulfidril de les proteïnes. Al llevat Saccharomyces cerevisiae Grx1 i Grx2 són glutaredoxines ditiòliques localitzades al citosol, mentres que Grx3, Grx4 i Grx5 són monotiòliques. Grx5 es localitza a la matriu mitocondrial i participa en la síntesi de centres ferro/sofre (Fe/S). Quan és absent, enzims amb centres Fe/S com l'aconitasa són inactives, no hi ha creixement en condicions respiratòries, hi ha acumulació de ferro intracel.lular i es produeix una oxidació constitutiva de proteïnes. Grx5 conté un domini tioredoxina simple. En canvi, Grx3 i Grx4 posseeixen un domini de tipus tioredoxina unit al domini glutaredoxina. Aquestes darreres dues proteïnes es localitzen al nucli, éssent el domini tioredoxina necessari per aquesta localització. S'ha utilitzat el mutant nul grx5 com model de cèl·lules que manifesten un estrés oxidatiu endògen constitutiu (oposat a les situacions on l'estrés és provocat per un estímul extern) per tal d'estudiar el transcriptoma cel·lular en les esmentades condicions. Així, s'ha observat que: (i) s'indueixen principalment gens del reguló Aft1 involucrats en la captació i utilització de ferro, i (ii) es reprimeix l'expressió de gens implicats en el metabolisme respiratori depenents del regulador Hap4. Aquest darrer efecte és suprimit per la sobreexpressió de HAP4, de manera que la inhibició del metabolisme respiratori en condicions moderadament oxidants podria constituir una resposta protectora per part de les cèl.lules del llevat. Utilitzant una construcció capaç d'internalitzar proteïnes a la mitocondria mitjançant la senyal de localització mitocondrial de Grx5, s'ha demostrat que les glutaredoxines ditiòliques de S. cerevisiae no poden rescatar els defectes d'un mutant grx5, mentres que les monotiòliques Grx3 i Grx4 sí que ho fan quan són adreçades a la matriu mitocondrial. Això demostra que les glutaredoxines ditiòliques són funcionalment divergents de les monotiòliques, però que aquestes darreres poden intercanviar les seues activitats biològiques entre elles quan s'eliminen les barreres dels compartiments cel.lulars. La conservació funcional entre glutaredoxines monotiòliques s'extén al llarg de l'escala evolutiva, ja que els defectes del mutant grx5 de S. cerevisiae són també suprimits per altres proteïnes de la mateixa família com són Grx4 de Escherichia coli, GrxC de Synechocystis sp. i les respectives proteïnes homòlogues de pollastre i de cèl.lules humanes. / Las glutaredoxinas son tiol oxidoreductasas que regulan el estado redox de los grupos sulfidrilo de las proteínas. En la levadura Saccharomyces cerevisiae Grx1 y Grx2 son glutaredoxinas ditiólicas localizadas en el citosol, mientras que Grx3, Grx4 y Grx5 son monotiólicas. Grx5 se localiza en la matriz mitocondrial y está involucrada en la síntesis de centros hierro/azufre (Fe/S). En su ausencia, enzimas con centros Fe/S como la aconitasa son inactivas, no hay crecimiento en condiciones respiratorias, hay acumulación de hierro intracelular y se produce una oxidación constitutiva de proteínas. Mientras que Grx5 contiene un dominio glutaredoxina simple, Grx3 y Grx4 poseen un domino tipo tioredoxina fusionado al dominio glutaredoxina. Estas dos últimas proteínas se localizan en el núcleo, siendo el dominio tioredoxina necesario para tal localización. Se ha utilizado el mutante nulo grx5 como modelo de células que manifiestan un estrés oxidativo endógeno constitutivo (opuesto a las situaciones de estrés provocadas por un estímulo externo) para estudiar el transcriptoma celular en dichas condiciones. Se ha observado que: (i) se inducen principalmente genes del regulón Aft1 involucrados en la captación y utilización de hierro, y (ii) se reprime la expresión de genes implicados en el metabolismo respiratorio dependientes del regulador Hap4. Este último efecto es suprimido por la sobreexpresión de HAP4, de modo que la inhibición del metabolismo respiratorio durante condiciones moderadamente oxidantes podría constituir una respuesta protectora por parte de las células de la levadura. Utilizando una construcción capaz de internalizar proteínas en la mitocondria gracias a la señal de localización mitocondrial de Grx5, se ha demostrado que las glutaredoxinas ditiólicas de S. cerevisiae no son capaces de rescatar los defectos de un mutante grx5, en tanto que las monotiólicas Grx3 y Grx4 sí lo hacen cuando son dirigidas a la matriz mitocondrial. Ello demuestra que las glutaredoxinas ditiólicas son funcionalmente divergentes de las monotiólicas, pero que estas últimas pueden intercambiar entre ellas sus actividades biológicas cuando se sobrepasan las barreras compartimentales. La conservación funcional entre glutaredoxinas monotiólicas se extiende a lo largo de toda la escala evolutiva, dado que los defectos del mutante grx5 de S. cerevisiae son también suprimidos por otras proteínas de la misma familia como son Grx4 de Escherichia coli, GrxC de Synechocystis sp. y las respectivas proteínas homólogas de pollo y de células humanas. / Monothiol glutaredoxins are thiol oxidoreductases that regulate the redox state of sulfhydryl groups in proteins. In the yeast Saccharomyces cerevisiae Grx1 and Grx2 are dithiol glutaredoxins located at the cytosol, while Grx3, Grx4 and Grx5 are monothiol ones. Grx5 is located at the mitochondrial matrix and is involved in the synthesis of iron/sulfur (Fe/S) centers. In its absence, enzymes with Fe/S centers such as aconitase are inactive, there is no growth in respiratory conditions, iron is accumulated inside the cells and a constitutive oxidation of proteins occurs. While Grx5 contains a single glutaredoxin domain, Grx3 and Grx4 have a thioredoxin type domain fused to the glutaredoxin domain. These two proteins are located at the nucleus, the thioredoxin domain being necessary for such location. The null grx5 mutant has been used as a model for cells that display constitutive endogenous oxidative stress (as opposed to situations where the stress is caused by external stimulus), in order to study the cell transcriptome in such conditions. Thus, it has been observed that: (i) there is a general induction of the Aft1 regulon genes involved in iron uptake and utilization, and (ii) there is a repression of genes required for respiratory metabolism that depend on the Hap4 regulator. This latter effect is suppressed by the overexpression of HAP4. It is proposed that inhibition of respiratory metabolism during moderately oxidative conditions would constitute a protective response by the yeast cells. By using a genetic construction that is able to internalize proteins into the mitochondria by means of the mitochondrial targeting sequence of Grx5, it has been demonstrated that the S. cerevisiae monothiol glutaredoxins are unable to rescue the defects of a grx5 mutant, while the monothiol ones Grx3 and Grx4 rescue such defects when internalized into the mitochondrial matrix. This fact demonstrates that dithiol glutaredoxins are functionally divergent from monothiol ones, but these latter can interchange their biological activities when the compartment barriers are surpassed. Functional conservation among monothiol glutaredoxins extends along the evolutive scale, since the defects of the grx5 mutant of S. cerevisiae are also suppressed by other proteins of the same family such as Grx4 of Escherichia coli, GrxC of Synechocystis sp. and the respective homologues of chicken and human cells.

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Una suplementación de la dieta con alimentos ricos en omega-3 provoca un aumento de estos ácidos grasos en las membranas celulares, incrementando la capacidad de deformación de los eritrocitos y provocando una mayor capacidad de transporte de oxígeno. Los omega-3 activan la expresión de genes que alteran la utilización energética de los ácidos grasos y de oxígeno a nivel mitocondrial, debido a su interacción con factores de transcripción como los PPARs y NFκβ, los cuales están implicados en la regulación de genes de enzimas antioxidantes e inflamatorios. En contraposición, los omega-3 debido a su naturaleza química tienen una marcada susceptibilidad a oxidarse e iniciar procesos de peroxidación lipídica. Durante el entrenamiento regular y el ejercicio moderado se producen moderadas cantidades de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno (RONS), moléculas altamente reactivas que pueden reaccionar con facilidad con los diferentes componentes moleculares de las células, induciendo daños oxidativo y nitrosativo, alterando su estructura y su función. Sin embargo, estas RONS tienen otro efecto ya que actúan como promotores de la expresión de genes antioxidantes e inducen la activación de las defensas antioxidantes. Las RONS tienen un doble papel, uno que provoca un daño oxidativo y otro que induce una protección frente a altas cantidades de especies reactivas. En este último caso se pone de manifiesto la existencia de efectos horméticos en la producción de bajos niveles de RONS durante el entrenamiento de deportistas. El estado de las defensas antioxidantes previo a la actividad física contribuye a determinar si ésta genera un desequilibrio oxidativo afectando a la viabilidad y funcionalidad celular. El objetivo principal de la presente tesis ha sido estudiar la acción de alimentos funcionales ricos en ácidos grasos esenciales sobre la situación de estrés oxidativo inducido por la actividad física aguda y sobre las adaptaciones al estrés oxidativo inducidas por el entrenamiento. La realización de un entrenamiento deportivo regular, como el entrenamiento futbolístico, mejora la maquinaria antioxidante endógena de diferentes fracciones sanguíneas, plasma, eritrocitos, neutrófilos y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), mediante mecanismos de activación enzimática e incremento proteico de enzimas. Esta mejora de la capacidad antioxidante provocada por el ejercicio regular va acompañada de un daño oxidativo y nitrosativo en las diferentes fracciones sanguíneas, con la excepción de los neutrófilos donde se observa una disminución de los marcadores de daño oxidativo en lípidos y proteínas. Sin embargo, esta mayor capacidad antioxidante inducida por el entrenamiento regular protege a las diferentes fracciones sanguíneas frente a una producción aguda de RONS provocada por un ejercicio intenso. Las PBMCs son las células sanguíneas con mayor daño oxidativo tras un periodo de entrenamiento presentando signos de peroxidación lipídica y nitración de proteínas, probablemente atribuible a una alta producción de RONS en estas células. Esta peor adaptación estaría relacionada con que el entrenamiento regular provoca en PBMCs un aumento del sistema antioxidante basado en la actividad glutatión peroxidasa, dependiente de la disponibilidad de glutatión, en detrimento del basado en la actividad catalasa, independiente de glutatión, favoreciéndose de esta manera la eliminación de bajas concentraciones de H2O2 frente a las altas. La suplementación de la dieta con una bebida funcional de almendra rica en un ácido graso poliinsaturado omega-3, el docosahexaenoico (DHA), que proporciona una ingesta diaria adicional de 1.14 g diarios de DHA aumenta los niveles plasmáticos y eritrocitarios de este ácido graso. La suplementación con DHA, durante un periodo de entrenamiento regular, proporciona respecto a los que no han suplementado su dieta, una mayor capacidad antioxidante y un menor daño nitrosativo tras un ejercicio agudo en eritrocitos, una menor tasa de producción de ROS en las PBMCs y una disminución del tiempo para generar especies reactivas de oxígeno durante la denominada explosión oxidativa en neutrófilos activados después del ejercicio.

TrkA es va descobrir com a un oncogén producte de la fusió del seu domini tirosinakinasa (TK) amb la tropomiosina. Posteriorment, va augmentar el seu interès endescobrir-se que la proteïna nativa constituïa el receptor del factor de creixementnerviós (NGF).Es coneixen bé els esdeveniments que tenen lloc a partir de la unió del lligand alreceptor i que donen lloc a l'activació de les vies de senyalització de les MAPK yPI 3-K/Akt. Se sap que, in vivo, la internalització del receptor i el seu transportretrògrad també juguen un paper important per a l'efecte a llarg termini del NGF ique és un tret distintiu en relació a d'altres receptors de factors de creixement.L'activació del receptor també comporta un augment transitori de Ca2+intracel· lular. Per això ens vam plantejar l'estudi de la relació entre l'activació deTrkA i calmodulina (CaM), com a sensor dels nivells de Ca2+ intracel· lulars.En primer lloc vam observar una interacció directa i dependent de Ca2+ entre CaM ila meitat c-terminal del domini intracel· lular de TrkA. La primera part del treball secentra en caracteritzar aquesta interacció.Per veure l'efecte de la unió sobre Trk, vam utilitzar inhibidors de CaM. Aquestsno impedeixen la fosforilació de TrkA induïda per NGF, però sí comporten laproteòlisi del receptor donant lloc a un fragment amb activitat tirosina kinasaconstitutiva. Donada la ubiqüitat de CaM, i la seva importància en processos vitalsper a la cél· lula, el segon objectiu ha consistit en buscar el lloc d'unió a CaM deTrkA per així poder obtenir una construcció de Trk on es perdés la unió a CaM.Basant-nos en diverses evidències, ens vam centrar en la caracterització d'una regióque conté una Tyr fosforilable (Y701) i que forma part d'un motiud'internalització. L'última part del treball se centra en descriure les característiquesd'aquesta Tyr i la seva funció, que més enllà de la relació amb CaM, pot constituiruna fosforilació inhibitòria per l'activitat de Trk i un lloc de regulació negativa dela internalització. / TrkA se descubrió como un oncogén producto de la fusión de su dominio tirosinakinasa (TK) con la tropomiosina. Posteriormente, aumentó su interés trasdescubrirse que la proteína nativa constituía el receptor del factor de crecimientonervioso (NGF).Se conocen bien los acontecimientos que ocurren tras la unión del ligando alreceptor y que dan lugar a la activación de las vías de señalización de las MAPK yPI 3-K/Akt. Se sabe que, in vivo, la internalización del receptor y su transporteretrógrado también juegan un papel importante para el efecto a largo plazo delNGF y que es una característica distintiva de otros receptores de factores decrecimiento.La activación del receptor también conlleva un aumento transitorio de Ca2+intracelular. Por ello nos planteamos estudiar la relación entre la activación deTrkA y calmodulina (CaM), como sensor de los niveles de Ca2+ intracelulares.En primer lugar observamos una interacción directa y Ca2+ dependiente entre CaMy la mitad c-terminal del dominio intracelular de TrkA. La primera parte del trabajose centra en caracterizar esta interacción.Para ver el efecto de la unión sobre Trk, utilizamos inhibidores de CaM. Éstos noimpiden la fosforilación de TrkA inducida por NGF, pero sí conllevan la proteolisisdel receptor dando lugar a un fragmento con actividad tirosina kinasa constitutiva.Dada la ubicuidad de CaM y su importancia en procesos vitales para la célula, elsegundo objetivo consistió en buscar el sitio de unión a CaM de TrkA, para asípoder obtener una construcción de Trk en que se perdiera la unión a CaM.Basándonos en diversas evidencias, nos centramos en la caracterización de unaregión que contenía una Tyr fosforilable (Y701) y que además forma parte de unmotivo de internalización. La última parte del trabajo se centra en describir lascaracterísticas de dicha Tyr y su función,que más allá de la relación con CaM,puede constituir una fosforilación inhibitoria para la actividad de Trk y un lugar deregulación negativa de su internalización. / TrkA was discovered as an oncogen, product of the fusion of its Tyrosine kinasedomain with Tropomiosin. Later on, it was identified as the receptor for the Nervegrowth factor (NGF).The first steps in Trk signaling after ligand binding are well understood. And alsothe pathways leading to MAPKs and PI3K-Akt activation. But receptorinternalization and retrograde transport are also important for the long termsignaling of TrkA, giving raise to a differential regulation of Trk receptors amongother growth factor receptors.Receptor activation also induces an increase in intracellular calcium concentration.That's why we thought on studying the relationship between TrkA activation andcalmodulin (CaM), as a prototypical calcium sensor.First we described a direct and calcium-dependent interaction between CaM andthe c-terminal part of TrkA. The first part of this work consists on thecharacterization of this interaction.In order to check the effect of CaM binding on TrkA we used CaM inhibitors.NGF-induced TrkA fosforilation was not inhibited upon CaM inhibition, but Trkwas cleaved, leading to constitutively active fragments. CaM is ubiquous andnecessary for many cell processes, so the second objective has been to search forthe CaM binding domain on TrkA in order to generate a TrkA mutant defective inCaM binding.We mutated a region containing a phosphorylatable Tyrosine Y701 that constitutesa trafficking motif, as the putative binding site of CaM. The last part of this projectdeals with the characterization of the mutants, and their effect even regardless ofCaM binding. Its phosphorylation might inhibit Trk function, and the regionconstitutes a negative regulator of internalization.