Peroxinitrito (ONOO- + ONOOH), o produto da rápida reação do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de •NO. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas por mecanismos que contribuímos para esclarecer no decorrer desta tese. Especificamente, estudamos a oxidação de urato e tirosina por peroxinitrito. Demonstramos que o urato é oxidado por peroxinitrito a alantoina, aloxana e ao radical aminocarbonila. Como a reação direta entre urato e peroxinitrito tem uma constante de velocidade relativamente baixa (k= 4,8 x 102 M -1.s-1) em comparação com àquelas de outras biomoléculas, sugerimos que o urato é um potente sequestrador dos radicais derivados do peroxinitrito (•NO2 e CO3•-, na maioria dos ambientes biológicos; a pH ácido, o radical •OH também pode se tornar relevante). No caso da tirosina, confirmamos que ela não reage diretamente com o peroxinitrito mas com os radicais dele derivados. Como antecipado, o rendimento relativo dos produtos (3-nitrotirosina, 3,3-bitirosina e 3-hidroxitirosina (DOPA)) variou com o pH e a presença de CO2. Esses estudos nos levaram a propor a co-localização de proteínas nitradas e hidroxiladas como um possível biomarcador de peroxinitrito. Para testar essa hipótese, um anticorpo monoclonal anti-DOPA foi desenvolvido e utilizado em modelos de infecção por Leishmania amazonenses (macrófagos (J774), e camundongos resistentes (C56Bl/6) e suscetíveis (BALB/c). A co-localização de proteínas hidroxiladas e nitradas ficou evidênciada em todos os modelos testados e ocorreu concomitantemente a máxima produção de •NO. Infelizmente, o anticorpo obtido perdeu a atividade e ainda não pudemos confirmar esses dados. / Peroxynitrite (ONOO- + ONOOH), which is formed by the fast reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of •NO. The compound is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Specifically, we studied the oxidation of urate and tyrosine by peroxynitrite. Urate oxidation produced allantoin, alloxan and the amiocarbonyl radical. Since the rate constant of the direct reaction between urate and peroxynitrite (k= 4,8 x 102 M-1.s-1) is low in comparison with those of other biotargets, we proposed that urate is an efficient scavenger of peroxynitrite-derived radicals (•NO2 and CO3•- in most biological environments; at acid pH, the •OH radical may also become relevant). ln the case of tyrosine, we confirmed that it does not react directly with peroxynitrite but, instead, with the radicals derived form it. As anticipated, the relative yield of the products (3-nitrotyrosine, 3,3-bityrosine and 3-hydroxytyrosine (DOPA)) varied with the pH and CO2 presence. These results led us to propose that co-localization of nitrated and hydroxylated proteins could be a peroxynitrite biomarker. To test this hypothesis, a monoclonal anti-DOPA antibody was developed and tested in Leishamnia amazonensis infection models (macrophages (J774), and resistant (C56Bl/6) and susceptible mice (BALB/c). It was possible to evidence co-localization of hydroxylated and nitrated proteins in all tested models in a time when •NO synthesis was maximum. Unfortunetly, we were unable to confirm these results due to antibody inactvation; new antibody baches are being obtained.

Tropomiosina (Tm) é uma proteína coiled-coil de 284 aminoácidos que interage de uma maneira cabeça-cauda para formar filamentos e liga-se a filamentos de actina. Em músculos esqueléticos Tm interage com Troponina (Tn) e participa na regulação da contração muscular de forma dependente de cálcio. Após a análise da seqüência de isoformas de Tm observamos que os resíduos 258-275 apresentam um padrão de polaridade específico para isoformas de músculos estriados, porém atípico para estruturas coiled-coil. Baseados nessas observações, produzimos versões recombinantes da tropomiosina polimerizável (ASTm) e não polimerizável (nfTm) com 5-hidroxitriptofano (50HW) incorporado em posições específicas na região C-terminal. A caracterização desses mutantes permitiu a identificação de posições em regiões da molécula onde Tm interage com várias proteínas (actina, troponina e outras moléculas de tropomiosina) porém cada sonda apresenta fluorescência especificamente sensível a apenas uma dessas interações. A tropomiosina com 50HW na posição 269 tem sua fluorescência sensível à polimerização. Utilizando esse mutante, obtivemos valores para a constante de afinidade para a polimerização de Tm em várias concentrações de sal, que descrevem a alta dependência entre interação cabeça-cauda e força iônica (Sousa & Farah, J. Biol. Chem., 2002, J. Biol. Chem., 277 (3), 2081-8). Tropomiosinas contendo 50HW nas posições 261 e 263 possuem fluorescência seletivamente sensível à ligação de actina e troponina, respectivamente (Sousa & Farah, 2001, Biophysical J., 80 (1), Part 2, 91ª, abstract). Utilizando fragmentos de TnT, mapeamos a sensibilidade de AS263(50HW) à região T1 da TnT (Oliveira et al., 2000, J. Biol. Chem., 275 (36), 27513-9). Obtivemos valores de afinidade para ligação da troponina à tropomiosina: em ausência de actina -Ca2+ (2, 5 x 106M-1) e em presença de actina +Ca2+ (4, 3 x 107 M-1) e de actina -Ca2+ (5, 3 x 107 M-1). Utilizando os mutantes não polimerizáveis (nfTm) investigamos a influência da interação cabeça-cauda nas interações para as quais cada sonda é sensível (Sousa et al., Biophys. J., 2002, abstract in press). / Tropomyosin (Tm) is a coiled-coil protein that polymerizes by head-totail interactions in an ionic-strength-dependent manner. In skeletal muscle,Tm interacts with troponin (Tn) to modulate muscle contraction via its Ca2+-dependent repositioning on the actin filament. Since residues 258-275 present a striated muscle-specific pattern atypical for a coiled-coil structure, we produced a total of 18 polymerizable (ASTm) and non-polymerizable (nfTm) versions of recombinant Tm with tryptophan analogues probes incorporated at specific positions near their C-termini. We found three mutants whose fluorescence are specifically sensitive to Tn-binding (position 263), actin-binding (261) or Tm polymerization (269). We used these mutants to: i) quantitatively investigate the ASTm monomer - polymer equilibrium and its dependence on ionic strength and determine a minimum number effective charges involved in stabilizing the head-to-tai/ interaction, ii) demonstrate that amino acid residue 263 of Tm interacts with residues 77-157 of TnT and that neighboring amino acid sequences along the primary structure of TnT modulate this interaction, iii) quantitatively analyze the binding of the ASTm mutants to Tn, in the presence and in the absence of actin and Ca2+; and iv) qualitatively investigate the influence of the head-to-tail overlap in Tm binding to actin and/or Tn.

Tropomiosina (Tm) é uma proteína coiled-coil de 284 aminoácidos que interage de uma maneira cabeça-cauda para formar filamentos e liga-se a filamentos de actina. Em músculos esqueléticos Tm interage com Troponina (Tn) e participa na regulação da contração muscular de forma dependente de cálcio. Após a análise da seqüência de isoformas de Tm observamos que os resíduos 258-275 apresentam um padrão de polaridade específico para isoformas de músculos estriados, porém atípico para estruturas coiled-coil. Baseados nessas observações, produzimos versões recombinantes da tropomiosina polimerizável (ASTm) e não polimerizável (nfTm) com 5-hidroxitriptofano (50HW) incorporado em posições específicas na região C-terminal. A caracterização desses mutantes permitiu a identificação de posições em regiões da molécula onde Tm interage com várias proteínas (actina, troponina e outras moléculas de tropomiosina) porém cada sonda apresenta fluorescência especificamente sensível a apenas uma dessas interações. A tropomiosina com 50HW na posição 269 tem sua fluorescência sensível à polimerização. Utilizando esse mutante, obtivemos valores para a constante de afinidade para a polimerização de Tm em várias concentrações de sal, que descrevem a alta dependência entre interação cabeça-cauda e força iônica (Sousa & Farah, J. Biol. Chem., 2002, J. Biol. Chem., 277 (3), 2081-8). Tropomiosinas contendo 50HW nas posições 261 e 263 possuem fluorescência seletivamente sensível à ligação de actina e troponina, respectivamente (Sousa & Farah, 2001, Biophysical J., 80 (1), Part 2, 91ª, abstract). Utilizando fragmentos de TnT, mapeamos a sensibilidade de AS263(50HW) à região T1 da TnT (Oliveira et al., 2000, J. Biol. Chem., 275 (36), 27513-9). Obtivemos valores de afinidade para ligação da troponina à tropomiosina: em ausência de actina -Ca2+ (2, 5 x 106M-1) e em presença de actina +Ca2+ (4, 3 x 107 M-1) e de actina -Ca2+ (5, 3 x 107 M-1). Utilizando os mutantes não polimerizáveis (nfTm) investigamos a influência da interação cabeça-cauda nas interações para as quais cada sonda é sensível (Sousa et al., Biophys. J., 2002, abstract in press). / Tropomyosin (Tm) is a coiled-coil protein that polymerizes by head-totail interactions in an ionic-strength-dependent manner. In skeletal muscle,Tm interacts with troponin (Tn) to modulate muscle contraction via its Ca2+-dependent repositioning on the actin filament. Since residues 258-275 present a striated muscle-specific pattern atypical for a coiled-coil structure, we produced a total of 18 polymerizable (ASTm) and non-polymerizable (nfTm) versions of recombinant Tm with tryptophan analogues probes incorporated at specific positions near their C-termini. We found three mutants whose fluorescence are specifically sensitive to Tn-binding (position 263), actin-binding (261) or Tm polymerization (269). We used these mutants to: i) quantitatively investigate the ASTm monomer - polymer equilibrium and its dependence on ionic strength and determine a minimum number effective charges involved in stabilizing the head-to-tai/ interaction, ii) demonstrate that amino acid residue 263 of Tm interacts with residues 77-157 of TnT and that neighboring amino acid sequences along the primary structure of TnT modulate this interaction, iii) quantitatively analyze the binding of the ASTm mutants to Tn, in the presence and in the absence of actin and Ca2+; and iv) qualitatively investigate the influence of the head-to-tail overlap in Tm binding to actin and/or Tn.

Peroxinitrito (ONOO- + ONOOH), o produto da rápida reação do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de •NO. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas por mecanismos que contribuímos para esclarecer no decorrer desta tese. Especificamente, estudamos a oxidação de urato e tirosina por peroxinitrito. Demonstramos que o urato é oxidado por peroxinitrito a alantoina, aloxana e ao radical aminocarbonila. Como a reação direta entre urato e peroxinitrito tem uma constante de velocidade relativamente baixa (k= 4,8 x 102 M -1.s-1) em comparação com àquelas de outras biomoléculas, sugerimos que o urato é um potente sequestrador dos radicais derivados do peroxinitrito (•NO2 e CO3•-, na maioria dos ambientes biológicos; a pH ácido, o radical •OH também pode se tornar relevante). No caso da tirosina, confirmamos que ela não reage diretamente com o peroxinitrito mas com os radicais dele derivados. Como antecipado, o rendimento relativo dos produtos (3-nitrotirosina, 3,3-bitirosina e 3-hidroxitirosina (DOPA)) variou com o pH e a presença de CO2. Esses estudos nos levaram a propor a co-localização de proteínas nitradas e hidroxiladas como um possível biomarcador de peroxinitrito. Para testar essa hipótese, um anticorpo monoclonal anti-DOPA foi desenvolvido e utilizado em modelos de infecção por Leishmania amazonenses (macrófagos (J774), e camundongos resistentes (C56Bl/6) e suscetíveis (BALB/c). A co-localização de proteínas hidroxiladas e nitradas ficou evidênciada em todos os modelos testados e ocorreu concomitantemente a máxima produção de •NO. Infelizmente, o anticorpo obtido perdeu a atividade e ainda não pudemos confirmar esses dados. / Peroxynitrite (ONOO- + ONOOH), which is formed by the fast reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of •NO. The compound is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Specifically, we studied the oxidation of urate and tyrosine by peroxynitrite. Urate oxidation produced allantoin, alloxan and the amiocarbonyl radical. Since the rate constant of the direct reaction between urate and peroxynitrite (k= 4,8 x 102 M-1.s-1) is low in comparison with those of other biotargets, we proposed that urate is an efficient scavenger of peroxynitrite-derived radicals (•NO2 and CO3•- in most biological environments; at acid pH, the •OH radical may also become relevant). ln the case of tyrosine, we confirmed that it does not react directly with peroxynitrite but, instead, with the radicals derived form it. As anticipated, the relative yield of the products (3-nitrotyrosine, 3,3-bityrosine and 3-hydroxytyrosine (DOPA)) varied with the pH and CO2 presence. These results led us to propose that co-localization of nitrated and hydroxylated proteins could be a peroxynitrite biomarker. To test this hypothesis, a monoclonal anti-DOPA antibody was developed and tested in Leishamnia amazonensis infection models (macrophages (J774), and resistant (C56Bl/6) and susceptible mice (BALB/c). It was possible to evidence co-localization of hydroxylated and nitrated proteins in all tested models in a time when •NO synthesis was maximum. Unfortunetly, we were unable to confirm these results due to antibody inactvation; new antibody baches are being obtained.

Aminoacetona (AA) é um catabólito de Thr e Gly que se acumula nas síndromes cri-du-chat e treoninemia. Atualmente, a oxidação de AA é considerada uma das fontes alternativas de metilglioxal (MG), agente citotóxico e genotóxico, em diabetes mellitus. Em estados de deficiência metabólica, tal como o diabetes, há acúmulo de AA que, por sua vez, sofre oxidação na presença de amino oxidases sensíveis à semicarbazida (SSAO) com a produção de MG, H2O2 e NH4+. As SSAO são enzimas Cu-dependentes, cujo mecanismo de atuação ainda é pouco conhecido e possui como substrato, além de AA, metilamina (endógena) e a benzilamina (xenobiótico). AA possui um grupo amino vicinal à uma carbonila, o que sugere que ela possa sofrer enolização e oxidação catalisada por metal, produzindo espécies reativas de oxigênio (EROs), inclusive radicais HO•. A presente tese tem por objetivo esclarecer o mecanismo pelo qual AA sofre oxidação aeróbica, direta e catalisada por metal, com concomitante produção de EROs. Foi dada ênfase à catalise por ferro por sua implicação em desordens associadas com diabetes. Serão apresentados resultados que implicam AA como promotora de danos a membrana de mitocôndrias isoladas, bem como a estrutura proteica de ferritina e ceruloplasmina (CP). Como ferritina e CP estão envolvidas na homeostase de ferro, os danos causados a estas proteínas por AA possivelmente afetam o estado redox de plasma de diabéticos, contribuindo significantemente para o aumento do estresse oxidativo no diabetes. / Aminoacetone (AA) is a threonine and glycine catabolite long known to accumulate in cri-du-chat and threoninemia syndromes and, more recent1y, implicated as a contributing source of methylglyoxal (MG) in diabetes mellitus. AcetylCoA overproduction in diabetes also leads to AA accumulation. AA as well as many other endogenous (e.g., methylamine) and xenobiotic amines (e.g., benzylamine) are oxidized by dioxygen in the presence of SSAO, a group of poorly understood plasma circulating and membrane bound Cu-dependent enzymes, yielding an aldehyde, H2O2 and NH4+ ions. With AA, SSAO activity paradoxally produces the cytotoxic and genotoxic MG. AA bears an amino group vicinal to the carbonyl function and therefore is expected to undergo phosphate-catalyzed enolization and iron-catalyzed oxidation to yield reactive oxygen species (ROS), including HO• radicals. The present work aims to clarify the mechanisms by which AA undergoes direct and metal-catalyzed aerobic oxidation to yield deleterious ROS, with emphasis on the catalytic role of iron given its well-known implications in diabetes. In the present work we show that ROS generated through the aerobic oxidation of AA are able to induce damage in isolated rat liver mitochondria as well as in horse spleen ferritin (HoSF) and human ceruloplasmin (CP). The current findings of changes in HoSF and CP may contribute to explain intracellular iron-induced oxidative stress during AA accumulation in diabetes mellitus patients.

Aminoacetona (AA) é um catabólito de Thr e Gly que se acumula nas síndromes cri-du-chat e treoninemia. Atualmente, a oxidação de AA é considerada uma das fontes alternativas de metilglioxal (MG), agente citotóxico e genotóxico, em diabetes mellitus. Em estados de deficiência metabólica, tal como o diabetes, há acúmulo de AA que, por sua vez, sofre oxidação na presença de amino oxidases sensíveis à semicarbazida (SSAO) com a produção de MG, H2O2 e NH4+. As SSAO são enzimas Cu-dependentes, cujo mecanismo de atuação ainda é pouco conhecido e possui como substrato, além de AA, metilamina (endógena) e a benzilamina (xenobiótico). AA possui um grupo amino vicinal à uma carbonila, o que sugere que ela possa sofrer enolização e oxidação catalisada por metal, produzindo espécies reativas de oxigênio (EROs), inclusive radicais HO•. A presente tese tem por objetivo esclarecer o mecanismo pelo qual AA sofre oxidação aeróbica, direta e catalisada por metal, com concomitante produção de EROs. Foi dada ênfase à catalise por ferro por sua implicação em desordens associadas com diabetes. Serão apresentados resultados que implicam AA como promotora de danos a membrana de mitocôndrias isoladas, bem como a estrutura proteica de ferritina e ceruloplasmina (CP). Como ferritina e CP estão envolvidas na homeostase de ferro, os danos causados a estas proteínas por AA possivelmente afetam o estado redox de plasma de diabéticos, contribuindo significantemente para o aumento do estresse oxidativo no diabetes. / Aminoacetone (AA) is a threonine and glycine catabolite long known to accumulate in cri-du-chat and threoninemia syndromes and, more recent1y, implicated as a contributing source of methylglyoxal (MG) in diabetes mellitus. AcetylCoA overproduction in diabetes also leads to AA accumulation. AA as well as many other endogenous (e.g., methylamine) and xenobiotic amines (e.g., benzylamine) are oxidized by dioxygen in the presence of SSAO, a group of poorly understood plasma circulating and membrane bound Cu-dependent enzymes, yielding an aldehyde, H2O2 and NH4+ ions. With AA, SSAO activity paradoxally produces the cytotoxic and genotoxic MG. AA bears an amino group vicinal to the carbonyl function and therefore is expected to undergo phosphate-catalyzed enolization and iron-catalyzed oxidation to yield reactive oxygen species (ROS), including HO• radicals. The present work aims to clarify the mechanisms by which AA undergoes direct and metal-catalyzed aerobic oxidation to yield deleterious ROS, with emphasis on the catalytic role of iron given its well-known implications in diabetes. In the present work we show that ROS generated through the aerobic oxidation of AA are able to induce damage in isolated rat liver mitochondria as well as in horse spleen ferritin (HoSF) and human ceruloplasmin (CP). The current findings of changes in HoSF and CP may contribute to explain intracellular iron-induced oxidative stress during AA accumulation in diabetes mellitus patients.