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Imobilização multipontual de invertase e inulinase em suportes sólidos: caracterização físico-cinética dos derivados estabilizadosGoulart, Antonio José [UNESP] 29 June 2007 (has links) (PDF)
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goulart_aj_dr_araiq.pdf: 655423 bytes, checksum: 42bb817e04bb39a55667ebbe452f2ca0 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A utilização de açúcar invertido apresenta uma série de vantagens em relação à acarose diluída e a hidrólise enzimática é superior em rendimento à hidrólise ácida, lém de fornecer um produto de melhor qualidade e não gerar resíduos tóxicos. este sentido, o objetivo deste trabalho foi imobilizar multipontualmente uma nvertase comercial e uma inulinase produzida por uma cepa de Kluyveromyces arxianus em suporte glioxil-agarose, amino-agarose, glutaraldeído-agarose e com uportes epóxidos Sepabeads, Sepabeads-amino e Eupergit C, e determinar as tividades, estabilidades e capacidade de reuso dos derivados. Os derivados foram btidos através de diferentes protocolos e suas propriedades cinéticas Km e Vmax oram determinadas. Os resultados obtidos com os derivados foram comparados com os obtidos com as enzimas solúveis. Quando a invertase foi imobilizada no suportes agarose usando 5mg de enzima/g de suporte, os derivados possibilitaram ao menos duas reutilizações com manutenção da atividade, o que não ocorreu quando alta concentração de enzima foi colocada para reagir com o suporte, tanto usando agarose CL6B como a CL4B. Esta mesma enzima forneceu derivados com alta atividade quando foi realizado crosslinking com glutaraldeído, usando agarose CL6B e CL4B, cujas atividades foram as mais elevadas entre todos os derivados (21,643 e 14,984 U/mg prot, respectivamente). Foram obtidos seis derivados de invertase com estabilidade à temperatura de 50°C po r 1440 min e com atividade relativa acima de 80% nas reutilizações; no entanto, não foram obtidos derivados estabilizados com a enzima inulinase. A partir da análise destes resultados foi possível determinar que os derivados amino+glutaraldeído CL6B e amino+glutaraldeído CL4B foram os melhores derivados ativos estabilizados, apresentando eficiência catalítica (Vmax/Km) 0,59 e 0,52,... / The use of inverted sugar presents a series of advantages in relation to diluted sucrose and the enzymatic hydrolysis have a superior yield over acid hydrolysis, beyond supplying a product of better quality and do not generate toxic residues. In this way, the objective of this work was to immobilize by multipoint linkages a commercial invertase and an inulinase produced by a Kluyveromyces marxianus strain on glyoxyl-agarose, amine-agarose, glutaraldehyde-agarose supports and Sepabeads, Sepabeads-amine and Eupergit C epoxy supports, and to determine the activities, stabilities and the capability of reutilization of the derivatives. The derivatives were obtained through different protocols and kinetic parameters Km and Vmax were determined. The results of the derivatives were compared with the ones obtained with soluble enzymes. When invertase was immobilized on agarose using 5mg of enzyme/g of support, it was possible to reutilize the derivatives at least two times with maintenance of the activity, what it was not possible when high enzyme concentration was placed to react with the support, using agarose CL6B or CL4B. This same enzyme supplied derivatives with high activity when glutaraldehyde was used to crosslink the enzyme and agarose CL6B and CL4B supports, with the higher activity of all (21,643 and 14,984 U/mg prot, respectively). Six invertase derivatives were obtained with stability to the temperature of 50°C and for the period of 1440 min, with relative activity above 80% in the reutilizations, but no one inulinase stabilized derivative was obtained. Analyzing these results, it was possible to conclude that the amine+glutaraldehyde CL6B and amine+glutaraldehyde CL4B were the best active stabilized derivatives, presenting catalytic efficiency (Vmax/Km) of 0,59 and 0,52, respectively, corresponding to 59% and 52% of the soluble enzyme efficiency. Keywords: Enzyme immobilization, ...(Complete abstract click electronic access below)
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Caracterização molecular dos genes PSO2 e PSO4 de Saccharomyces cerevisiae envolvidos na reparação do DNA : análise funcional e identificação de interações proteína-proteínaRevers, Luis Fernando January 2003 (has links)
O alelo mutante termo-condicionalmente letal pso4-1 do gene PRP19, que codifica uma proteína associada ao spliceossoma, permitiu investigar a influência deste gene no processamento de pré-mRNA, reparação do DNA e esporulação. Fenótipos relacionados a genes portadores de introns foram correlacionados à temperatura. Sistemas repórteres para processamento de pré-mRNA e RT-PCR mostraram que eficiência de processamento de mRNA no mutante pso4-1 é inversamente correlacionada com a temperatura de crescimento. Uma mutação pontual, substituindo uma leucina por uma serina foi identificada dentro da região codificadora N-terminal do alelo Pso4-1 e afeta as propriedades bioquímicas de Pso4-1p. Entre 24 clones isolados utilizando o sistema doishíbridos, 7 foram identificados como partes dos genes RAD2, RLF2 e DBR1. RAD2 codifica uma endonuclease indispensável para a via reparação por excisão de nucleotídeos (NER), RLF2 codifica a subunidade maior do fator de montagem da cromatina I, cuja deleção resulta em sinsibilidade à radiação UVC, enquanto que DBR1 codifica uma enzima que atua sobre substratos de RNA na forma lariat, degradando estruturas lariat em introns durante o processamento de mRNA. A caracterização dos fenótipos após tratamentos com mutágenos em linhagens mutantes simples e duplos de rad2∆, rlf2∆ e pso4-1 mostraram sensibilidade aumentada para para mutantes rad2∆/pso4-1 e rlf2∆/pso4-1, sugerindo uma interferência funcional destas proteínas no processo dereparação do DNA em Saccharomyces cerevisiae. O mecanismo exato de reparação de pontes inter-cadeia (ICL) em S. cerevisiae não é ainda totalmente conhecido. Identificando novos fenótipos e isolando proteínas potencialmente capazes de interagir com Pso2p através da técnica do sistema dois-híbridos, foi possível extender a caracterização deste gene específica para reparação de pontes intercadeia. Tratamentos com acetaldeído (ACA), um metabólito natural da via glicolítica, foi mais tóxico a linhagem mutante pso2 em comparação com a linhagem selvagem e também capaz de induzir a expressão da fusão contendo o promotor de PSO2 à lacZ (PSO2-lacZ) por um fator comparável à tratamentos com outros agentes indutores de ICLs, indicando que o metabólito natural ACA pode causar danos do tipo ICL em S. cerevisiae. A utilização do sistema dois-híbridos permitiu isolar partes de proteínas codificadas por nove diferentes genes, entre eles a proteína quinase Pak1p, um supressor de mutações termosensíveis da DNA Polimerase alfa. Pak1p interage com a extremidade C-terminal conservada de Pso2p, uma região da proteína recentemente nomeada β-CASP entre v ortólogos conhecidos do gene PSO2. A integridade do domínio β-CASP é essencial para a reparaçãode DNA proficiente como demonstrado em ensaios de complementação com mutantes pso2 ∆. Comparação da sobrevivência após tratamento com agentes mutagênicos de simples mutantes pso2 ∆ e pak1 ∆ assim com o dulpo mutante pso2 ∆/pak1 ∆ revelaram que o gene PAK1 é necessário para reparação do DNA proficiente como na linhagem selvagem. A interação epistática dos dois alelos mutantes na linhagem duplo mutante sugere que Pak1p atua na mesma via de reparação a qual PSO2 pertence e que PAK1 constitui um novo locus envolvido na reparação do DNA em S. cerevisiae.
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Estudo do processamento das memórias de curta e longa duraçãoQuevedo, João Luciano de January 2002 (has links)
(João Quevedo - Estudo do Processamento das Memórias de Curta e Longa Duração) - Este trabalho apresenta a compilação dos 4 principais experimentos carreados ao longo de 1999-2002: 3 deles envolvem o modelo animal e um quarto utilizase de voluntários humanos. Entretanto, o uso desses diferentes paradigmas não prejudica a unidade do conjunto. O Capítulo 1 apresenta sucintamente o marco teórico dos 4 trabalhos. Inicialmente são discutidos aspectos modulatórios da consolidação da memória. Após, alguns elementos da bioquímica da consolidação da memória são apresentados no intuito de permitir establecer um entendimento das vias da PKA e da MAPK e suas correlações com a via final comum – a síntese protéica. Adicionalmente, a dissociação STM e LTM é discutida a partir do referencial farmacológico. Uma última unidade apresenta conceitos primitivos do papel da amígdala na modulação da memória e das evidências da implicação das emoções, via amígdala, na modulação da memória em humanos. Os experimentos utilizando a esquiva inibitória como paradigma e o rato como sujeito ocupam os Capítulos 2, 3 e 4. No Capítulo 2 é apresentado um corpo de resultados que permite observar uma dissecção farmacológica da STM e LTM. Os dados demonstram um envolvimento de fenômenos dependentes de PKA em ambas STM e LTM, dependentes de MAPK apenas na STM, e dependentes de síntese protéica apenas na LTM. O Capítulo 3 apresenta um trabalho realizado em colaboração com o Prof. Steven P. R. Rose (Open University, UK), que envolve a determinação dos momentos sensíveis à inibição da síntese protéica na consolidação da LTM. Foram observados dois momentos: um inicial, junto ao treino, e um tardio apos 3h. Além disso, foi possível demonstrar que um treino prévio de baixa intensidade, mas não a pré-exposição ao aparato, pode impedir o estabelecimento de amnésia induzida pelo bloqueio da síntese protéica. O Capítulo 4 estende os achados com anisomicina observados no Capítulo 3, estudando também o inibidor da PKA, Rp-cAMPs, e o inibidor da MAPKK, PD 098059. Os dados obtidos confirmam também para essas cascatas a indução em um treino prévio de baixa intensidade de algum fenômeno celular de longa duração que torna o aprendizado de um segundo treino independente de PKA, MAPK ou síntese protéica. O estudo da dissociação da STM e LTM foi ampliado, agora no modelo humano, no experimento descrito no Capítulo 6. Nesse experimento, observamos uma clara influência do conteúdo emocional na LTM, mas a ausência desse efeito na STM. A discussão geral (Capítulo 7) busca integrar esses achados descritos nos capítulos anteriores dentro da nova perspectiva molecular da neurobiologia da memória. Além disso, abre discussão acerca de possíveis novas possibilidades de pesquisa.
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Impacto do estágio de docência sobre o ensino de graduação de bioquímicaD'Ávila, Paulo Gilberto Simões January 2007 (has links)
Durante a análise investigativa, duas temáticas foram ressaltadas: tema e projetos. Ambos, em sua maioria, foram propostos pelos alunos do programa de pós-graduação em Bioquímica. Todos os professores envolvidos nos projetos afirmaram que estes trouxeram benefícios importantes, não só para suas disciplinas, como também para o processo de ensino-aprendizagem. É muito importante ressaltar que dos projetos analisados nove foram incorporados às disciplinas de graduação, sendo que um deles gerou uma nova disciplina. É importante destacar que tanto nas atividades teóricas, práticas, e teórico-práticas, ocorreram alterações de natureza metodológica e de conteúdos. A continuidade da disciplina Prática de Ensino em Bioquímica, é de suma importância para a construção pedagógica e aperfeiçoamento de docentes do ensino superior. Este processo é de importância relevante, uma vez que os alunos do programa de pós-graduação, ao concluírem seus cursos, encontram-se geralmente muito distanciados da realidade de ensino-aprendizagem da graduação. / This investigation showed that post graduation students were the main responsible for the elaboration and implemantation of their teaching projects. All teachers responsible for graduation disciplines where the projects were implemented recognized that all projects brought some benefit to their students and to their disciplines of graduation, mainly in the teaching/learning process. The results obtained with practical and theoretical classes were mainly due to the new methodogy and knowledge by the post graduation students. It is important to emphasize that 30% of the projects were incorporated to the graduation disciplines, and one of them generated a new discipline. These results lead all teachers to emphasize the importance of maintain and improve this sort of probation for post graduation students on disciplines of graduation.
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Antileishmanial Drugs: search for t SIR2 inhibitorsTavares, Joana Alexandra Pinto da Costa 05 December 2008 (has links)
Doutoramento em Bioquímica / PhD Degree - Biochemistry / A leishmaniose é uma doença parasitária causada pelo protozoário do género
Leishmania, que afecta milhões de indivíduos, em particular nas regiões tropicais e
subtropicais, sendo deste modo responsável por uma elevada mortalidade e
morbilidade. Na ausência de vacinas para uso humano, o controlo da doença
baseia-se na terapêutica farmacológica. No entanto, os medicamentos disponíveis
não são satisfatórios principalmente devido ao aparecimento de resistências, aos
efeitos laterais indesejáveis, e sobretudo devido à sua eficácia ser limitada em
situações de exacerbação da doença, como a que ocorre em indivíduos com o
sistema imunológico comprometido.
As proteínas pertencentes à família Silent Information Regulator 2 (SIR2),
também designadas de Sirtuins, são proteínas conservadas ao longo da evolução e
classificadas como histonas desacetilases (HDAC) da class III, uma vez que
dependem do NAD+ como co-factor para desacetilar os resíduos de lisina de
diversos substratos. As proteínas incluídas nesta família têm se revelado envolvidas
na regulação de vários processos biológicos como o silenciamento de genes,
reparação do DNA, longevidade, metabolismo, apoptose e desenvolvimento. No
genoma da Leishmania foi identificada a existência de informação genética para
codificar três proteínas homólogas às da família SIR2. Uma das proteínas,
designada de SIR2RP1, encontra-se localizada no citosol e de acordo com uma
abordagem molecular e biológica indirecta parece estar envolvida na sobrevivência
do parasita. A impossibilidade de conseguir remover os dois alelos que codificam
para esta proteína em Leishmania, sem ter havido suplemento epissomal, sugere
um envolvimento determinante da mesma na sobrevivência do parasita. Para além
do que, a remoção de apenas um alelo que codifica a proteína LiSIR2RP1
compromete virulência do parasita tanto in vitro como in vivo. A caracterização
bioquímica revelou que a proteína LiSIR2RP1 apresenta actividade desacetilase e
ADP-ribosiltransferase dependente do NAD+. Adicionalmente, observamos que esta
proteína se encontra parcialmente associada ao citoesqueleto do parasita
catalizando a desacetilação da tubulina na presença de NAD+. Com base nestes
resultados, consideramos a possibilidade de a proteína LiSIR2RP1 representar um
potencial alvo terapêutico. Com o objectivo de identificar novas moléculas que
inibam a proteína SIR2 do parasita e não a proteína humana correspondente,
SIRT1, procedeu-se posteriormente ao rastreio in silico da livraria de compostos do National Cancer Institute 3D database (NCI-2000) contendo aproximadamente
2x105 compostos. Contudo, esta estratégia não permitiu a identificação de um
inibidor potente, permitindo apenas a identificação do N-(2-fluorfenil)nicotinamida,
que poderá ser posteriormente submetido a modificações químicas. Avaliamos
também a capacidade dos compostos derivados do bisnaftalimidopropil (BNIP)
inibirem a proteína LiSIR2RP1. A realização de um estudo de relação estruturaactividade,
que incluiu 12 derivados do BNIP, a proteína LiSIR2RP1, e a proteína
humana correspondente, permitiu identificar os derivados BNIP como uma nova
classe de inibidores das Sirtuins. O composto BNIPDanonano foi seleccionado como
um inibidor potente e selectivo da enzima LiSIR2RP1. Pela realização de cinéticas
enzimáticas e análise computacional de modelos 3D das proteínas, concluímos
tratar-se de um inibidor que actua por competição com o NAD+. Verificamos
também que todos os compostos derivados do BNIP inibem, em ensaios in vitro, o
crescimento da forma amastigota intracelular de L. infantum (IC50 inferiores a
12 M). Pelo menos o derivado BNIPDaoctano foi eficaz a reduzir a carga parasitária
no fígado e baço de ratinhos infectados. Este estudo abre novas perspectivas ao
desenvolvimento de inibidores da proteína LiSIR2RP1, que interfiram com o
crescimento do parasita. / Leishmaniasis is a parasitic disease, caused by the protozoa of the genus
Leishmania that affects millions of people worldwide, especially in tropical and
subtropical areas, and is responsible for high mortality and morbidity. Disease
control is dependent on drug therapy, since no approved human vaccine is
available. However, the existing therapy is far from satisfactory owing to the
emergence of resistances, toxicity and its limited efficacy due to disease
exacerbation, mainly associated with compromised immune capability.
The proteins belonging to the Silent Information Regulator 2 (SIR2) family, also
known as Sirtuins are conserved throughout evolution and are classified as class III
histone deacetylases (HDAC) due to their dependency on NAD+ to deacetylate
lysine residues of histones and non-histone substrates. Moreover, these proteins
have been involved in the regulation of a number of biological processes such as
gene silencing, DNA repair, longevity, metabolism, apoptosis, and development.
One of the three SIR2 homologues identified in the Leishmania genome, the
SIR2RP1, is localized in the cytosol and, according to indirect molecular as well as
biological approaches, seems to be involved in parasite survival. A genetic approach
through the disruption of the Leishmania SIR2RP1 encoding gene suggested that
this protein was determinant to parasite survival due to the impossibility of
generating null chromosomal mutants without episomal rescue. Furthermore,
disruption of one LiSIR2RP1 gene allele (LiSIR2+/-) led to decreased amastigote
virulence, in vitro as well as in vivo. Biochemical approaches revealed that
LiSIR2RP1 has NAD+-dependent deacetylase and ADP-ribosyltransferase activities.
Moreover, we found that LiSIR2RP1 is partially associated with the parasite s
cytoskeleton and is capable of deacetylating tubulin, either in dimers or, when
present, in taxol-stabilized microtubules or in promastigote and amastigote
extracts, which may have significant implications during the remodelling of the
parasite s morphology and its interaction with the host cell. These findings led us to
consider LiSIR2RP1 as a potential therapeutic target. Therefore, aiming at the
identification of LiSIR2RP1 inhibitors, an in silico screening of the National Cancer
Institute compounds 3D database (NCI-2000) containing approximately 2x105
compounds was conducted, seeking the inhibition of the parasite SIR2 over the
human enzyme, SIRT1. Even though this strategy was effective in identifying N-(2-fluorophenyl) nicotinamide, which can be used for lead designing, it failed to
identify a truly potent and selective lead compound.
The presence of a common structural moiety (naphthalene) in some molecules
identified as Sirtuin inhibitors, led us to discover bisnaphthalimidopropyl (BNIP)
derivatives as a new class of inhibitors. Structure-activity studies were conducted
with 12 BNIP derivatives leading to the identification of BNIPDanonane as a potent
and selective inhibitor of the LiSIR2RP1 versus its human counterpart. Indeed,
based on kinetic studies, its inhibitory effect is due to competition with NAD+, which
is supported by docking analysis of BNIP derivatives in the LiSIR2RP1 and hSIRT1
three-dimensional models. Furthermore all the BNIP derivatives are active in vitro
against Leishmania infantum intracellular amastigotes (IC50 lower than 12 M) and
at least one of them, BNIPDaoctane, was identified to be active in vivo since its
administration reduces the parasite load in the spleen and liver of a visceral
leishmaniasis mice model. Therefore, this work will open new perpectives towards
the development of LiSIR2RP1 inhibitors, which interfere with the parasite
development.
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Análise fisiopatológica das modificações maternas no recém-nascido na gravidez normal e na pré-eclâmpticaCatarino, Rosa Cristina Barreto 01 September 2010 (has links)
Doutoramento em Ciências Farmacêuticas / PhD in Pharmaceutical Sciences
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Biological Aspects Underlying the Clinical Outcome of Hereditary SpherocytosisRocha, Susana Maria Santos 24 November 2010 (has links)
Doutoramento em Ciências Farmacêuticas / PhD in Pharmaceutical Sciences
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Resistencia à Terapêutica com Critropoietina Humana Recombinante em Doentes HemodialisadosCosta, Elísio Manuel de Sousa 13 March 2009 (has links)
Doutoramento em Bioquímica / PhD Degree - Biochemistry
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Heart Rate Variability Analysis During Normal and Hypertensive Pregnancy.Puente, Eduardo Tejera 24 November 2010 (has links)
Doutoramento em Ciências Farmacêuticas / PhD in Pharmaceutical Sciences
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Purificação e caracterização da 5'-nucleotídase citosólica (IMP/GMP específica) de cérebro de rato : papel no metabolismo dos nucleótidos purínicos e efeitos dos dinucleósidos polifosfatosMarques, Agostinho Franklim Pinto January 1997 (has links)
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