Orientadora : Profª Drª Nadia Krieger / Co-orientador : Prof. Dr. Leandro Piovan / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/08/2014 / Inclui referências : fls. 88-99 / Resumo: O sólido fermentado de Rhizopus microsporus CPQBA 312-07 DRM contendo lipases tem sido utilizado no tratamento de efluentes com elevado teor de lipídios e na síntese enzimática do biodiesel. Entretanto, a enantiosseletividade das lipases imobilizadas naturalmente no sólido fermentado ainda é desconhecida e estudos utilizando sólidos fermentados na resolução cinética enzimática de compostos racêmicos são escassos. A obtenção de compostos enantiomericamente puros é considerada essencial na fabricação de diversos produtos de alto valor agregado e a resolução cinética enzimática tem se revelado mais eficiente que outros processos de separação de enantiômeros. Neste contexto, este trabalho almejou estudar a aplicação do sólido fermentado produzido por R. microsporus na resolução cinética de álcoois secundários. Vários parâmetros foram estudados na reação de transesterificação do (R,S)-1-fenil-1-etanol em frascos agitados. O progresso das reações foi avaliado através de cromatografia em fase gasosa em coluna quiral e os parâmetros de excesso enantiomérico (ee), conversão e razão enantiomérica (E) foram calculados. A otimização da reação levou a um aumento de cerca de oito vezes da conversão inicial e embora não tenha sido possível identificar as lipases responsáveis pela transesterificação, a enantiopreferência foi para o isômero S do substrato. Este comportamento também foi observado nas resoluções dos álcoois (R,S)-p-nitro-fenil-1-etanol e (R,S)-p-metoxi-fenil-1-etanol. Este comportamento é diferente do observado para a maioria das lipases, que segue a regra de Kazlauskas, ou seja, possuem enantiopreferência para o isômero R do substrato. Este resultado é relevante, uma vez que lipases cuja enantiopreferência seja anti- Kazlauskas são bastante incomuns. Dessa forma, a utilização do sólido fermentado contendo lipases produzidas por Rhizopus microsporus mostrou potencial para aplicação na resolução de álcoois secundários e a enantiopreferência anti- Kazlauskas torna interessante estudos de identificação e caracterização das lipases contidas no sólido fermentado. Palavras-chave: lipases, fermentação em estado sólido, Rhizopus microsporus, álcoois secundários, resolução cinética enzimática. / Abstract: The fermented solid from Rhizopus microsporus CPQBA 312-07 DRM containing lipases have been previously used in the treatment of effluents with high lipid content and in enzymatic synthesis of biodiesel. However, the enantioselectivity of the lipases naturally immobilized on the fermented solid is still unknown and studies using fermented solids in enzymatic kinetic resolution of racemic compounds are scarce. The synthesis of enantiopure compounds is considered essential in the manufacture of several products with high added value and the enzymatic kinetic resolution has proven to be more effective than others methods of separation of enantiomers. In this context, this work aimed to study the application of the fermented solid produced by R. microsporus in the kinetic resolution of secondary alcohols. Several parameters were studied in transesterification reactions of the (R,S)-1-phenyl-1-ethanol in shake flasks. The progress of the reactions was evaluated by gas chromatography on a chiral column and the parameters enantiomeric excesses (ee), conversion and the enantioselectivity ratio (E) were calculated. The optimization of the reaction led to an increase of about eight times of the initial conversion and, although it has not been possible to identify the lipases responsible for the transesterification, their enantiopreference was for the S isomer of the substrate. This behavior was also observed in the resolution of alcohols (R,S)-pnitro- 1-phenyl-ethanol and (R,S)-p-methoxyphenyl-1-ethanol. This behavior is different from that observed for the majority of lipases, which follow the Kazlauskas's rule, having an enantiopreference for the R isomer of the substrate. This result is relevant since lipases that have enantiopreference anti-Kazlauskas rule are quite unusual. Thus, the use of a fermented solid containing lipases produced by Rhizopus microsporus showed potential for the application in the resolution of secondary alcohols and the anti-Kazlauskas enantiopreference fosters studies on the identification and characterization of the lipases contained in the fermented solid. Keywords: lipases, solid state fermentation, Rhizopus microsporus, secondary alcohols, enzymatic kinetic resolution.

As proteínas S100 são uma família de proteínas ligantes de Ca2+ com ampla distribuição ao longo dos tecidos de vertebrados. O gene da proteína S100B está localizado no cromossomo 21, e ela é expressa principalmente em astrócitos, estando envolvida em uma série de patologias, tanto do sistema nervoso central como em tecidos periféricos. Nesta tese estudamos o papel da proteína S100B na síndrome de Down, patologia genética que se origina da trissomia do cromossomo 21, bem como seu potencial como marcador de dano do sistema nervoso, em pacientes com defeito do tubo neural. Adicionalmente, procuramos demonstrar a presença de fontes extracerebrais de S100B. Observamos um aumento da proteína S100B em líquido amniótico de gestações com fetos com síndrome de Down (1,24 μg/L; controles 0,69 μg/L), e mostramos que este aumento está associado com a idade gestacional. Também relatamos um aumento da atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) nas gestações de fetos com síndrome de Down (16,16 U/mg/prot; controles 10,78 U/mg/prot) ; este efeito não foi correlacionado com a idade gestacional. Sugerimos que a S100B e a SOD podem ser utilizadas como parâmetros adicionais na triagem pré-natal para síndrome de Down. Em relação aos níveis da S100B em soro de pacientes com síndrome de Down (1,35 μg/L), confirmamos um aumento desta proteína em relação aos indivíduos controle (0,38 μg/L). Este efeito, entretanto não é dependente da idade, como nos indivíduos normais. Determinamos, pela primeira vez, o perfil ontogenético desta proteína no soro destes pacientes. Este achado pode ser associado com as lesões neurodegenerativas presentes nos pacientes com síndrome de Down. O estudo da S100B como marcador de dano em pacientes com defeito do tubo neural (DTN; 0,860 μg/L) não revelou diferenças em relação aos indivíduos normais (0,580 μg/L). Ainda, pacientes com DTN não apresentaram variação dos níveis da proteína dependente da idade, como acontece nos indivíduos controle. Por fim, estudamos o tecido adiposo como provável fonte extracerebral de S100B, correlacionando os níveis séricos com aqueles encontrados em LCR de ratos submetidos a jejum, e sugerimos que a S100B tenha um papel no transporte de ácidos graxos.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2006. / Submitted by Alexandre Marinho Pimenta (alexmpsin@hotmail.com) on 2009-11-20T19:38:43Z No. of bitstreams: 1 2006_MariaAparecidadaSilvaPrado.pdf: 1309633 bytes, checksum: fb83770e3380a466ff78fc3640d30357 (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2009-11-20T20:19:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_MariaAparecidadaSilvaPrado.pdf: 1309633 bytes, checksum: fb83770e3380a466ff78fc3640d30357 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-20T20:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_MariaAparecidadaSilvaPrado.pdf: 1309633 bytes, checksum: fb83770e3380a466ff78fc3640d30357 (MD5) Previous issue date: 2006 / Neste trabalho, estudamos as formas de interação e as energias de complexação em sistemas compostos de bases nucleotídicas, íons Mg2+ e H2O, utilizando-se cálculos ab initio. A partir dos resultados obtidos, fizemos uma avaliação da aplicabilidade de campos de força e métodos semi-empíricos para estudar estes sistemas. Os cálculos ab initio de alto nível foram realizados com o objetivo de indicar, em primeiro lugar, os efeitos importantes e que devem ser considerados no estudo de tais sistemas. Nesta etapa, analisamos os efeitos de correlação eletrônica, o efeito de muitos corpos e o efeito BSSE (basis set superposition error). Os efeitos de correlação eletrônica foram importantes no estudo das energias de interação dos complexos; o efeito de muitos corpos, por sua vez, se mostrou importante no estudo das energias de interação dos complexos formados, e deve ser considerado ao se utilizar metodologias baseadas em soma de interações individuais. Além disso, foi feita uma avaliação de métodos e funções de bases, com o intuito de se estabelecer uma metodologia adequada para o estudo das interações nucleobases-[Mg(H2O)n]2+ e nucleobases-(H2O)n. Definiu-se, então, a partir dos resultados obtidos, métodos e conjuntos de base que pudessem representar os sistemas analisados mais adequadamente. Os resultados de cálculos utilizando campos de força e métodos semi-empíricos, quando comparados aos resultados ab initio, se mostraram altamente limitados para o estudo destes sistemas. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In this work, we analyzed the forms of interaction and energetic behavior of systems composed of nucleic bases, magnesium ions, and water with ab initio methods. Based on the obtained results we evaluated the possible use of force fields and semi empirical methods on these systems. High-level ab initio calculations were performed aimed at revealing the important effects which should be considered in our study. Electronic correlation and many-body effects were shown to be important to the study of the interaction energy of the complexes. Many-body effects on interaction energies must be considered when accurate energies are pursued. We also evaluated different basis functions and ab initio methods in order to establish a proper methodology to the study of the systems nucleic bases-[Mg(H2O)n]2+ e nucleic bases- (H2O)n. Force fields and semi empirical methods, on the other hand, were shown to be severely limited to this study.

A hematopoiese representa uma cascata de eventos de proliferação e diferenciação celular precisamente regulada, onde uma população de células tronco pluripotentes indiferenciadas origina todas as células sangüíneas. Durante o período embrionário o principal órgão hematopoiético é o fígado. A partir do desenvolvimento dos ossos longos, a hematopoiese é deslocada para a medula óssea, sendo este, na vida adulta, o sítio de produção das células sangüíneas. O microambiente da medula óssea, composto pelas células estromais, componentes de matriz extracelular e fatores de crescimento ou citocinas, desempenha importância fundamental na proliferação e diferenciação das células progenitoras hematopoiéticas. Em algumas condições patológicas, na vida adulta, a hematopoiese pode ser observada em sítios extramedulares, especialmente no fígado, que demonstra assim preservar um potencial hematopoiético. Este fenômeno é descrito como hematopoiese extramedular e pode estar associado a reações fibrogranulomatosas, como a esquistossomose mansônica. No presente estudo avaliou-se a hipótese de que os gangliosídios possam participar do microambiente carregado negativamente necessário para o suporte da hematopoiese. Para isso, analisou-se o conteúdo, síntese e liberação (shedding) de gangliosídios de dois estromas extramedulares, GRWT e GR(IFN-Ro/o), que expressam GM-CSF de maneira semelhante, mas têm capacidades diferentes de suporte da mielopoiese in vitro. A capacidade de suporte da hematopoiese pelos dois estromas foi monitorada através da proliferação das células FDC-P1, uma linhagem precursora mielóide. Observamos que os dois estromas sintetizam e liberam os mesmos gangliosídios, embora em proporções diferentes. Também verificamos que a inibição da síntese de gangliosídios diminui a proliferação mielopoiética em ambos os estromas extramedulares.

As proteínas S100 são uma família de proteínas ligantes de Ca2+ com ampla distribuição ao longo dos tecidos de vertebrados. O gene da proteína S100B está localizado no cromossomo 21, e ela é expressa principalmente em astrócitos, estando envolvida em uma série de patologias, tanto do sistema nervoso central como em tecidos periféricos. Nesta tese estudamos o papel da proteína S100B na síndrome de Down, patologia genética que se origina da trissomia do cromossomo 21, bem como seu potencial como marcador de dano do sistema nervoso, em pacientes com defeito do tubo neural. Adicionalmente, procuramos demonstrar a presença de fontes extracerebrais de S100B. Observamos um aumento da proteína S100B em líquido amniótico de gestações com fetos com síndrome de Down (1,24 μg/L; controles 0,69 μg/L), e mostramos que este aumento está associado com a idade gestacional. Também relatamos um aumento da atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) nas gestações de fetos com síndrome de Down (16,16 U/mg/prot; controles 10,78 U/mg/prot) ; este efeito não foi correlacionado com a idade gestacional. Sugerimos que a S100B e a SOD podem ser utilizadas como parâmetros adicionais na triagem pré-natal para síndrome de Down. Em relação aos níveis da S100B em soro de pacientes com síndrome de Down (1,35 μg/L), confirmamos um aumento desta proteína em relação aos indivíduos controle (0,38 μg/L). Este efeito, entretanto não é dependente da idade, como nos indivíduos normais. Determinamos, pela primeira vez, o perfil ontogenético desta proteína no soro destes pacientes. Este achado pode ser associado com as lesões neurodegenerativas presentes nos pacientes com síndrome de Down. O estudo da S100B como marcador de dano em pacientes com defeito do tubo neural (DTN; 0,860 μg/L) não revelou diferenças em relação aos indivíduos normais (0,580 μg/L). Ainda, pacientes com DTN não apresentaram variação dos níveis da proteína dependente da idade, como acontece nos indivíduos controle. Por fim, estudamos o tecido adiposo como provável fonte extracerebral de S100B, correlacionando os níveis séricos com aqueles encontrados em LCR de ratos submetidos a jejum, e sugerimos que a S100B tenha um papel no transporte de ácidos graxos.

A proteína S100β pertence a uma família de proteínas ligantes de cálcio ácidas e de baixo peso molecular, e tem sido implicada no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Esta proteína tem atividade neurotrófica e gliotrófica e está localizada principalmente no Sistema Nervoso Central em astrócitos e células de Schawnn, mas pode ser detectada em menores concentrações em outras células, como melanócitos e adipócitos. Relatos sugerem que a S100β está envolvida nos mecanismos da neuropatologia principalmente na doença de Alzheimer e Síndrome de Down, onde astrócitos reativos expressam altos níveis desta proteína. Neste trabalho foi padronizado uma técnica imunoluminométrica muito sensível (0,02 µg/L) que utiliza um anticorpo marcado com o isoluminol como molécula “tracer”. A emissão de luz na fase final da reação é diretamente proporcional a concentração de proteína S100β das amostras. Na fase inicial do trabalho utilizamos amostras biológicas (soro, LCR e tecido cerebral) de ratos e também realizamos alguns ensaios metodológicos para se avaliar a sensibilidade, especificidade e a reprodutibilidade do imunoensaio. Demonstramos que o método empregado para se coletar sangue e LCR de ratos influencia na quantificação da proteína S100β. Finalmente, utilizamos este imunoensaio em investigações clínicas. Observamos que níveis desta proteína em pacientes diagnosticados com mielopatia associada ao vírus HTLV-I estava aumentada no soro, mas não em LCR. Também quantificamos a proteína em fluído amniótico, sendo que nas gestantes com fetos diagnosticados com Síndrome de Down os níveis foram mais elevados.

O dinâmico processo de polimerização e despolimerização dos filamentos intermediários de astrócitos é modulado principalmente por fosforilação da proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Os sítios de fosforilação da GFAP estão localizados na porção N-terminal, onde atuam proteínas quinases dependentes de AMPc e Ca2+. Este processo vem sendo investigado em fatias cerebrais, culturas de astrócitos, frações citoesqueléticas ou sistemas purificados. Neste trabalho estamos descrevendo uma nova técnica para o estudo do sistema fosforilante da GFAP que consiste na permeabilização de astrócitos em cultura com digitonina, Este modelo permite o acesso aos sítios intracelulares mantendo preservada, ainda que parcialmente, a compartimentalização celular. As condições de permeabilização foram estebelecidas com base na exclusão ao azul de Tripan. A incubação das células com AMPc e Ca2+ promoveram o aumento da fosforilação da GFAP, enquanto imunocitoquímica com anti-GFAP mostrou que em condições basais astrócitos permeabilizados mantém sua morfologia protoplasmática típica e apresenta a estrutura dos filamentos intermediários preservada. Ao incubar os astrócitos permeabilizados com AMPc estes filamentos aparentemente condensaram formando longos processos. Estes resultados sugerem que esta técnica tem potencial considerável para o estudo de alterações estruturais nos filamentos gliais em paralelo com a fosforilação de proteínas por permitir o uso de moduladores específicos de proteínas quinases e fosfatases.

O estresse oxidativo tem um papel importante no desenvolvimento da falência orgânica múltipla e choque séptico. O presente estudo foi realizado para determinar diferentes parâmetros de dano oxidativo a biomoléculas, produção de superóxido mitocondrial, atividades da superóxido dismutase e catalase e suas relações com a mortalidade por sepse em um modelo animal. Além disso, nós avaliamos os efeitos da combinação de antioxidantes (N-acetilcisteína e deferoxamina) em um modelo murino de sepse polimicrobiana induzida por ligação cecal e punção (CLP). Ratos Wistar machos (250-300 g) foram randomicamente divididos em quatro grupos: sham-operated, CLP ressuscitado com solução salina (50 ml/Kg imediatamente e 12h após CLP), CLP ressuscitado com solução salina e antibioticoterapia (solução salina 50 ml/ Kg imediatamente e 12h após CLP + ceftriaxone 30 mg/Kg e clindamicina 25 mg/Kg de 6/6h), e CLP com N-acetilcisteína (20 mg/kg subcutâneo, 3h, 6h, 12h, 18h e 24h após CLP) + deferoxamina (20mg/kg, subcutâneo, 3h e 24h após CLP). A peroxidação lipídica, a carbonilação protéica e a atividade da superóxido dismutase se apresentaram significativamente aumentadas nos animais não-sobreviventes podendo predizer a mortalidade. Nós demonstramos que existe uma modulação diferente da superóxido dismutase e da catalase nos animais não-sobreviventes Existe um grande aumento da atividade da superóxido dismutase sem um aumento proporcional da atividade da catalase nos não-sobreviventes. Os ratos tratados com antioxidantes apresentaram uma redução significante da atividade da mieloperoxidase e da peroxidação lipídica em todos os órgãos estudados. A produção de superóxido mitocondrial apresentou uma redução significante nos animais tratados com antioxidantes. Além disto, o tratamento com antioxidantes melhorou o equilíbrio entre a atividade da catalase e superóxido dismutase. A sobrevivências nos ratos sépticos não tratados foi de 10%. A sobrevivência aumentou para 40% com a ressuscitação volêmica e antibióticos. Ratos tratados apenas con N-acetilcisteína e desferoxamina apresentaram uma sobrevivência de 47%, similar aos ratos que receberam suporte básico. Este estudo demonstrou pela primeira vez que a atividade da superóxido dismutase deve ser um marcador precoce de mortalidade em sepse. Nossos resultados auxiliam o entendimento de aspectos importantes da resposta oxidativa na sepse; um aumento na atividade da superóxido dismutase sem um aumento proporcional na atividade da catalase. Além disto, nossos resultados demonstraram que o tratamento combinado com N-acetilcisteína e desferoxamina reduzem as conseqüências da sepse, reduzindo o estresse oxidativo, limitando a ativação de neutrófilos e a disfunçào mitocondrial, levando a uma melhor sobrevida.

Ratos machos Long-Evans e Wistar foram submetidos a uma tarefa de alternância de escolhas num labirinto em Y (delayed two-alternative-choice task). Esta tarefa requer orientação espacial egocêntrica (baseada na localização do animal dentro do aparelho) e, ao mesmo tempo, exclui a orientação espacial alocêntrica (baseada na detecção de elementos visuais externos ao aparelho). Os animais foram expostos a 10 sessões de treino para cada animal, os quais eram submetidos a injeção de salina (controles), ou dos antipsicóticos clozapina (0,5 ,g/kg i.m.), olanzapina (0,5 mg/kg i.p.) e risperidona (0,5 mg/kg i.p.) uma hora antes do início de cada tarefa. Na primeira sessão, os ratos eram recompensados por seguir até o final de cada braço, onde achavam comida. Nas seguintes nove corridas, os animais eram recompensados somente se eles entrassem no braço que não tinha sido previamente escolhido. Mediu-se também o tempo de corrida até o final de cada braço, com o consumo da comida. Um tempo limite foi estabelecido para esse tempo: se em 180 segundos o animal não consumasse a tarefa, o mesmo era retirado do aparelho e colocado no braço inicial. Com o objetivo de excluir orientação espacial alocêntrica (ou seja, utilizando sinais externos ao aparelho), a orientação do Y-maze foi modificada dia após dia, em uma ordem pseudo-randomizada A tarefa foi desenvolvida em dias consecutivos, sem pausa. Os resultados dos experimentos demonstraram que os antipsicóticos clozapina e olanzapina prejudicaram a orientação espacial egocêntrica no labirinto em Y. Em contrapartida, risperidona prejudicou a orientação espacial egocêntrica somente nos primeiros quatro dias; nos seguintes quatro dias não teve nenhum efeito. O tempo de corrida não foi alterado pela clozapina e foi prolongado pela olanzapina e pela risperidona. Não se observou catalepsia ou redução do comportamento cognitivo; nos animais tratados com olanzapina observou-se uma leve sedação.

A hiperargininemia é um erro inato do ciclo da uréia causado pela deficiência na atividade da arginase hepática. Esta doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual de arginina (Arg). Retardo mental e outras alterações neurológicas, cujos mecanismos são ainda desconhecidos, são sintomas comuns em pacientes hiperargininêmicos. O óxido nítrico (NO) é gerado em todas as células do sistema nervoso central (SNC) pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), a qual, na presença de oxigênio molecular, tetraidrobiopterina e outros cofatores, catalisa a conversão de Arg em NO e citrulina. Em condições normais, o NO desempenha importante papel fisiológico no SNC, como por exemplo, na liberação de neurotransmissores e expressão gênica. Quando há formação excessiva, o NO torna-se um importante mediador de neurotoxicidade Trabalhos realizados em nosso laboratório mostraram que a administração aguda de Arg em ratos diminui a atividade da Na+,K+-ATPase e aumenta o estresse oxidativo cerebral. Outros estudos mostraram que a administração de Arg prejudica a memória em ratos. Estes resultados foram prevenidos pelo Nϖ-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), um inibidor competitivo da NOS, sugerindo que a administração de Arg altera estes parâmetros através do NO e/ou estresse oxidativo. Considerando que a administração de Arg aumenta o estresse oxidativo e que estudos mostram que o NO inibe a cadeia de transporte de elétrons provavelmente comprometendo a produção de energia, no presente trabalho, nós investigamos o efeito da administração aguda de Arg sobre alguns parâmetros do metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividades da succinato desidrogenase, complexo II e IV da cadeia respiratória) em hipocampo de ratos. Também testamos o efeito do L-NAME sobre os efeitos produzidos pela Arg Ratos adultos de 60 dias foram tratados com uma única injeção intraperitoneal de Arg, de acordo com o protocolo estabelecido por Buchmann e colaboradores (1996). A dose de Arg (0,8 g/Kg) usada atinge níveis plasmáticos semelhantes àqueles encontrados em pacientes hiperargininêmicos (1,5 mM). Os resultados do presente trabalho mostraram que a administração de Arg aumentou significativamente a produção de lactato e diminuiu a produção de CO2 e a captação de glicose, bem como as atividades da succinato desidrogenase e do complexo II, e que a injeção simultânea de L-NAME preveniu estes efeitos, exceto a produção de CO2 e a produção de lactato. No entanto, não houve alteração na atividade da citocromo c oxidase (complexo IV). Se estes achados também ocorrerem em humanos, pode-se presumir que a Arg prejudica o metabolismo energético, possivelmente através da geração de radicais livres induzida pela formação de NO e/ou da formação de poliaminas, contribuindo assim para a disfunção cerebral observada na hiperargininemia.