La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative dont la physiopathologie fait intervenir des causes génétiques qui contribuent non seulement aux formes familiales mais aussi au développement des formes sporadiques, les plus fréquentes, en interagissant sans doute alors avec des facteurs environnementaux. La découverte des déterminants génétiques a permis d’identifier plusieurs mécanismes moléculaires contribuant au développement de la maladie. Ils en ont démontré le caractère complexe. Pour mieux comprendre l’étendue des perturbations moléculaires liées à la maladie, nous avons entrepris des analyses globales du transcriptome par le biais de puces ou de séquençage des ARNs (RNAseq) à partir de cellules mononuclées périphériques sanguines de patients présentant des formes génétiques et sporadiques de la maladie ainsi que de sujets sains.Nous avons identifiés la dérégulation de nombreux gènes dans les cellules mononuclées périphériques sanguines de sujets porteurs de la mutation G2019S de LRRK2 et de sujets sporadiques par rapport à des sujets sains appariés. L’analyse des voies et des processus cellulaires associés à ces gènes met en exergue une altération de la voie de signalisation EIF2 commune aux sujets porteurs de la mutation G2019S de LRRK2 et aux sujets sporadiques. Cette voie fait écho à la régulation de la traduction et de l’épissage, deux processus faisant partie du métabolisme des ARNs. Ces altérations sont retrouvées dans les cellules mononuclées périphériques sanguines de sujets parkinsoniens porteurs de mutations du gène ATXN2, essentiellement connu pour son rôle dans la stabilité, l’épissage et la traduction des ARNm. Cette perturbation des ARNs semble être une altération commune à l’ensemble des formes de maladie de Parkinson étudiées et pourrait donc être un mécanisme sous-tendant la maladie.Les résultats du séquençage des ARNs obtenus chez des parkinsoniens présentant une forme sporadique ou porteurs de mutations délétères ainsi que chez des sujets sains corroborent cette hypothèse en montrant d’une part des différences quantitatives et qualitatives de variants d’épissage au sein d’ARNm eux-mêmes impliqués dans le métabolisme des ARNs et d’autres part des variations de l’épissage de gènes impliqués dans des mécanismes moléculaires connus de la maladie.Ainsi, nos données s’inscrivent dans la dynamique physiopathologique actuelle qui fait état de nombreuses perturbations du métabolisme des ARNs dans les maladies neurodégénératives. Dans la maladie de Parkinson, ces défauts impliqueraient des variations quantitatives et qualitatives de variants d’épissage au sein de gènes liés à l’épissage mais aussi dans des mécanismes connus pour contribuer à la maladie. Une analyse approfondie de ces dérèglements devraient permettre de déterminer leur spécificité et d’évaluer leur potentiel en tant que marqueurs de la maladie et cibles thérapeutiques. / Parkinson’s disease is a neurodegenerative disorder with genetic determinants not only contributing to rare familial forms of the disease but also involved in prevalent sporadic forms by interacting with environmental factors. Thanks to the identification of these determinants, several molecular mechanisms contributing to the disease have been found highlighting also its complexity. In order to better understand the molecular perturbations underlying the disease, we performed whole transcriptome analyses using microarrays and RNA sequencing (RNAseq) from peripheral blood mononuclear cells of Parkinson’s disease patients with genetic and sporadic forms of the disease as well as healthy controls.We identified several dysregulated genes in the cells of Parkinson’s disease patients with a G2019S LRRK2 mutation and sporadic patients compared to healthy controls. Pathways and cellular processes related to those genes mainly display disturbances of EIF2 signaling common to G2019S LRRK2 mutation carriers and sporadic patients. These data pinpoint potential perturbations of translation and RNA splicing both related to RNA metabolism. Involvement of RNA metabolism is also observed in peripheral blood mononuclear cells of Parkinson’s disease patients carrying mutations of ATXN2 gene encoding for ataxin-2 protein. It is mainly known as a regulator of the stability, the splicing and the translation of mRNA. Such RNA-mediated perturbations seem to be a common to all forms of Parkinson’s disease and might be a physiological mechanism of the disease. RNAseq data from Parkinson’s disease patients having or not deleterious mutations are in agreement with this hypothesis showing quantitative and qualitative discrepancies of splicing variants inside genes involved in RNA metabolism but also in known molecular pathways of the disease.As a conclusion, our results support the current view of RNA metabolism association with neurodegenerative disorders. In Parkinson’s disease, those alterations could involve quantitative and qualitative variations of splicing variants inside genes involved in RNA metabolism but also in known perturbed molecular pathways of the disease. Further analyses of these dysregulations should be helpful to determine their specificity and evaluate their potential as biomarkers and therapeutic targets.

Les peptides et les protéines jouent un rôle central dans les processus biologiques. Les méthodes de production de ces molécules se sont fortement développées dans le but de déterminer leur structure, comprendre leurs fonctions et développer de nouvelles thérapies. En particulier, la synthèse chimique des protéines s’est fortement développée dans les années 1960 avec l’introduction de la chimie peptidique en phase solide (SPPS) par B. Merrifield. Depuis les années 1990, la combinaison de méthodes de ligation chimique natives et de stratégies d’assemblage séquentielles et convergentes ont permis la synthèse de nombreuses protéines. Cependant, la synthèse de protéines de haut poids moléculaires reste un défi synthétique. Il est donc important de développer de nouveaux systèmes de ligation chimique et des stratégies d’assemblage plus performantes. Une nouvelle méthode de ligation native, la ligation SEA, repose sur la capacité des segments bis(2-sulfanylethyl)amido (SEA) à réagir en milieu aqueux avec des cystéinyl peptides. Différents outils chimiques basés sur l’utilisation du groupement SEA ont été développés dans cette thèse. La première partie de ce manuscrit présente une méthode d’assemblage séquentiel de segments peptidiques en solution s’effectuant du N-terminal vers le C-terminal. Cette méthode a permis la synthèse du domaine N-terminal du facteur de croissance des hépatocytes (HGF). Afin de surmonter les limitations de l’assemblage en solution, la seconde partie de cette thèse porte sur le développement d’un procédé de synthèse de protéines par ligation native séquentielle en phase solide du N-terminal vers le C-terminal. Enfin, une dernière partie exploite la réactivité des segments bis(2-selanylethyl)amido (SeEA) et leur potentiel pour la synthèse de nouveaux échafaudages peptidiques. / Peptides and proteins play a crucial role in all fundamental biological processes. Chemical methods have been developed for the production of peptide and proteins which allows understanding their structures, functions and the development of novel therapies. In particular, the introduction of the Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) by Merrifield in the 60s, followed by the emergence of peptide ligation methods in the 90s have opened the way to the preparation of synthetic proteins. Recently, the developments of sequential and convergent assembly methods give access to large synthetic proteins. However, the synthesis of high molecular weight proteins remains a challenging task. Therefore, it is necessary to develop novel peptide ligation methods and assembly scheme strategies. Central to this PhD work is the recently developed bis(2-sulfanylethyl)amido (SEA) native peptide ligation method. The first part of this manuscript describes an efficient sequential assembly method in the N-to-C direction for protein synthesis in solution which was used for producing a functional N domain of Hepatocyte Growth Factor‎ (HGF). We next examined also a solid phase method for the sequential native ligation of unprotected peptide segments in the N-to-C direction to overcome the limitations in solution. The last part of the manuscript reports the chemicals properties of bis(2-selanylethyl)amido (SeEA) peptide segments and their usefulness for building novel peptide scaffolds.

Les protéines jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement des organismes vivants et sont au cœur de nombreux mécanismes biologiques. La synthèse totale chimique des protéines permet un contrôle précis de leur composition et constitue donc un outil puissant d’investigation des processus biologiques impliquant ces molécules. La synthèse peptidique en phase solide (SPPS) décrite par B. Merrifield en 1963 a révolutionné le domaine. Quelques années plus tard, les méthodes de ligations chimiques et le développement de stratégies d’assemblage de segments peptidiques ont permis la synthèse de nombreuses protéines par voie chimique. Cependant, la difficulté des chimistes à produire de grandes protéines traduit l’absence de méthodes robustes pour la synthèse en routine de tels macromolécules.De nouvelles méthodologies de synthèse totale basées sur la Native Chemical Ligation et les ligations SEA et SeEA ont été développées dans le cadre de cette thèse. En particulier, l’utilisation de sélénoesters latents ou formés in situ a été étudiée pour faciliter l’accès à des protéines de grande taille.La première partie de cette thèse porte sur le potentiel du groupement bis(2-sélényléthyl)amido SeEA, à savoir l’analogue sélénié du groupement bis(2-sulfanyléthyl)amido SEA, pour accélérer la formation de liaisons peptidiques par formation d’intermédiaires sélénoesters. Cette méthode a permis la synthèse de la protéine NK1 (variant naturel du facteur de croissance des hépatocytes HGF) constituée de 180 acides aminés.La seconde partie décrit la formation in situ de sélénoesters à partir de segments peptidiques SEA grâce à la conception de nouveaux catalyseurs à base de sélénium. Ces catalyseurs ont été utilisés pour accélérer deux réactions essentielles dans les procédés de synthèse totale développés dans cette thèse, à savoir la ligation SEA ainsi que la synthèse de peptides thioesters à partir de peptides SEA. L’efficacité de l’un de ces catalyseurs a été illustrée par la synthèse totale de la granulysine.La dernière partie de cette thèse décrit une stratégie d’assemblage séquentielle de segments peptidiques en phase solide, qui constitue une alternative aux méthodes d’assemblage en phase liquide. Ce procédé a été automatisé et présente un grand potentiel pour la synthèse automatisée de protéines par voie chimique. / Proteins play a crucial role in living organisms and in almost all biological mechanisms. The total chemical synthesis of proteins allows an atom by atom control of their structure and thus constitutes a powerful tool of investigation of biological processes involving these molecules. The solid phase peptide synthesis (SPPS) introduced by B. Merrifield in 1963 has revolutionized the field. Few years later, the discovery of chemical ligation methods and the development of peptide segment assembling strategies has been applied to the synthesis of many proteins. However, the difficulty in accessing large proteins reflects the absence of robust methods for the routine synthesis of such macromolecules.Novel synthetic methods based on Native Chemical Ligation and SEA/SeEA ligations have been developed in the frame of this thesis. In particular, I explored the interest of latent or in situ formed selenesters for facilitating the access to large proteins.The first part of this thesis describes the chemical properties of the bis(2-selenylethyl)amido (SeEA) group, i.e. the selenium analog of the bis(2-sulfanylethyl)amido (SEA) group, and its usefulness for accelerating peptide bond formation. This method was used for the synthesis of the NK1 protein (natural variant of the hepatocyte growth factor, HGF) constituted of 180 amino acids.The second part describes the in situ formation of selenesters through the design of novel selenium catalysts. These catalysts were used to accelerate the SEA ligation as well as the synthesis of thioester peptides from SEA peptides. Both reactions are central in the total synthesis processes developed in this thesis. Their usefulness is illustrated by the total synthesis of granulysin.The last part describes a method for the sequential ligation of peptide segments on a water compatible solid support which is complementary to the solution methods discussed above. This process has been automated and has a great potential for the automated chemical synthesis of proteins.