Les peptides et les protéines jouent un rôle central dans les processus biologiques. Les méthodes de production de ces molécules se sont fortement développées dans le but de déterminer leur structure, comprendre leurs fonctions et développer de nouvelles thérapies. En particulier, la synthèse chimique des protéines s’est fortement développée dans les années 1960 avec l’introduction de la chimie peptidique en phase solide (SPPS) par B. Merrifield. Depuis les années 1990, la combinaison de méthodes de ligation chimique natives et de stratégies d’assemblage séquentielles et convergentes ont permis la synthèse de nombreuses protéines. Cependant, la synthèse de protéines de haut poids moléculaires reste un défi synthétique. Il est donc important de développer de nouveaux systèmes de ligation chimique et des stratégies d’assemblage plus performantes. Une nouvelle méthode de ligation native, la ligation SEA, repose sur la capacité des segments bis(2-sulfanylethyl)amido (SEA) à réagir en milieu aqueux avec des cystéinyl peptides. Différents outils chimiques basés sur l’utilisation du groupement SEA ont été développés dans cette thèse. La première partie de ce manuscrit présente une méthode d’assemblage séquentiel de segments peptidiques en solution s’effectuant du N-terminal vers le C-terminal. Cette méthode a permis la synthèse du domaine N-terminal du facteur de croissance des hépatocytes (HGF). Afin de surmonter les limitations de l’assemblage en solution, la seconde partie de cette thèse porte sur le développement d’un procédé de synthèse de protéines par ligation native séquentielle en phase solide du N-terminal vers le C-terminal. Enfin, une dernière partie exploite la réactivité des segments bis(2-selanylethyl)amido (SeEA) et leur potentiel pour la synthèse de nouveaux échafaudages peptidiques. / Peptides and proteins play a crucial role in all fundamental biological processes. Chemical methods have been developed for the production of peptide and proteins which allows understanding their structures, functions and the development of novel therapies. In particular, the introduction of the Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) by Merrifield in the 60s, followed by the emergence of peptide ligation methods in the 90s have opened the way to the preparation of synthetic proteins. Recently, the developments of sequential and convergent assembly methods give access to large synthetic proteins. However, the synthesis of high molecular weight proteins remains a challenging task. Therefore, it is necessary to develop novel peptide ligation methods and assembly scheme strategies. Central to this PhD work is the recently developed bis(2-sulfanylethyl)amido (SEA) native peptide ligation method. The first part of this manuscript describes an efficient sequential assembly method in the N-to-C direction for protein synthesis in solution which was used for producing a functional N domain of Hepatocyte Growth Factor‎ (HGF). We next examined also a solid phase method for the sequential native ligation of unprotected peptide segments in the N-to-C direction to overcome the limitations in solution. The last part of the manuscript reports the chemicals properties of bis(2-selanylethyl)amido (SeEA) peptide segments and their usefulness for building novel peptide scaffolds.

Les protéines jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement des organismes vivants et sont au cœur de nombreux mécanismes biologiques. La synthèse totale chimique des protéines permet un contrôle précis de leur composition et constitue donc un outil puissant d’investigation des processus biologiques impliquant ces molécules. La synthèse peptidique en phase solide (SPPS) décrite par B. Merrifield en 1963 a révolutionné le domaine. Quelques années plus tard, les méthodes de ligations chimiques et le développement de stratégies d’assemblage de segments peptidiques ont permis la synthèse de nombreuses protéines par voie chimique. Cependant, la difficulté des chimistes à produire de grandes protéines traduit l’absence de méthodes robustes pour la synthèse en routine de tels macromolécules.De nouvelles méthodologies de synthèse totale basées sur la Native Chemical Ligation et les ligations SEA et SeEA ont été développées dans le cadre de cette thèse. En particulier, l’utilisation de sélénoesters latents ou formés in situ a été étudiée pour faciliter l’accès à des protéines de grande taille.La première partie de cette thèse porte sur le potentiel du groupement bis(2-sélényléthyl)amido SeEA, à savoir l’analogue sélénié du groupement bis(2-sulfanyléthyl)amido SEA, pour accélérer la formation de liaisons peptidiques par formation d’intermédiaires sélénoesters. Cette méthode a permis la synthèse de la protéine NK1 (variant naturel du facteur de croissance des hépatocytes HGF) constituée de 180 acides aminés.La seconde partie décrit la formation in situ de sélénoesters à partir de segments peptidiques SEA grâce à la conception de nouveaux catalyseurs à base de sélénium. Ces catalyseurs ont été utilisés pour accélérer deux réactions essentielles dans les procédés de synthèse totale développés dans cette thèse, à savoir la ligation SEA ainsi que la synthèse de peptides thioesters à partir de peptides SEA. L’efficacité de l’un de ces catalyseurs a été illustrée par la synthèse totale de la granulysine.La dernière partie de cette thèse décrit une stratégie d’assemblage séquentielle de segments peptidiques en phase solide, qui constitue une alternative aux méthodes d’assemblage en phase liquide. Ce procédé a été automatisé et présente un grand potentiel pour la synthèse automatisée de protéines par voie chimique. / Proteins play a crucial role in living organisms and in almost all biological mechanisms. The total chemical synthesis of proteins allows an atom by atom control of their structure and thus constitutes a powerful tool of investigation of biological processes involving these molecules. The solid phase peptide synthesis (SPPS) introduced by B. Merrifield in 1963 has revolutionized the field. Few years later, the discovery of chemical ligation methods and the development of peptide segment assembling strategies has been applied to the synthesis of many proteins. However, the difficulty in accessing large proteins reflects the absence of robust methods for the routine synthesis of such macromolecules.Novel synthetic methods based on Native Chemical Ligation and SEA/SeEA ligations have been developed in the frame of this thesis. In particular, I explored the interest of latent or in situ formed selenesters for facilitating the access to large proteins.The first part of this thesis describes the chemical properties of the bis(2-selenylethyl)amido (SeEA) group, i.e. the selenium analog of the bis(2-sulfanylethyl)amido (SEA) group, and its usefulness for accelerating peptide bond formation. This method was used for the synthesis of the NK1 protein (natural variant of the hepatocyte growth factor, HGF) constituted of 180 amino acids.The second part describes the in situ formation of selenesters through the design of novel selenium catalysts. These catalysts were used to accelerate the SEA ligation as well as the synthesis of thioester peptides from SEA peptides. Both reactions are central in the total synthesis processes developed in this thesis. Their usefulness is illustrated by the total synthesis of granulysin.The last part describes a method for the sequential ligation of peptide segments on a water compatible solid support which is complementary to the solution methods discussed above. This process has been automated and has a great potential for the automated chemical synthesis of proteins.

L’HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor) est le ligand du Récepteur Tyrosine Kinase (RTK) MET. Ce couple ligand-récepteur joue un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques tels que l’embryogenèse, la régénération tissulaire et l’angiogenèse. Comme pour de nombreux RTK, la dérégulation de l’activité de MET est associée à la progression et l’invasion tumorales. Bien que le récepteur MET ait été intensivement étudié au cours de ces dernières décennies, les processus moléculaires conduisant à son activation par l’HGF/SF restent encore mal connus et controversés.NK1, un variant naturel de l’HGF/SF, comprenant la partie N-terminale (N) et le premier domaine kringle (K1) de l’HGF/SF, possède une activité agoniste. En effet, NK1 dimérise spontanément en position « tête-bêche » et est considéré aujourd’hui comme la structure minimale permettant la dimérisation de MET et son activation. Afin de déterminer leur contribution respective, les domaines N et K1 isolés ont été produits par voie recombinante et ne montrent aucune ou qu’une très faible activité agoniste respectivement. Une présentation monovalente de ces domaines au récepteur MET ne semble donc pas pertinente pour déterminer leur fonction.Par conséquent, nous avons souhaité générer des complexes multivalents mimant le positionnement des domaines N et K1 au sein du dimère naturel. En tirant partie de la « One-Pot SEA ligation » développée au laboratoire, ces domaines ont été synthétisés par voie chimique et fonctionnalisés avec une extrémité C-terminale biotinylée (NB et K1B). En utilisant la streptavidine (S) comme plateforme de multimérisation, nous avons généré des complexes semi-synthétiques NB/S et K1B/S et déterminé les propriétés biologiques de ces nouvelles constructions multivalentes.L’ensemble des analyses de signalisations cellulaires et phénotypiques démontre sans équivoque que le complexe K1B/S est capable de mimer les réponses biologiques induites par l’HGF/SF et son variant NK1. De plus, le complexe K1B/S, injecté dans la circulation systémique, déclenche la signalisation de MET dans le foie. L’utilisation de ce complexe K1B/S nous a permis de démontrer que deux domaines K1, correctement assemblés et orientés, constituent l'interface minimale et suffisante requise pour déclencher une pleine activation de MET. A l’inverse, les premières données fonctionnelles ont démontré que le complexe NB/S ne lie pas directement MET mais utilise les héparanes sulfates comme pont moléculaire.Ces études utilisant de nouvelles configurations structurales pourraient donc servir de modèle de base au développement de nouveaux agonistes de MET dans le cadre de thérapies régénératives ou préservatrices, mais aussi d’antagonistes dans le cadre de thérapies anticancéreuses ciblées. / Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor (HGF/SF) and its receptor tyrosine kinase (RTK) MET play an essential role in embryogenesis, tissue regeneration and angiogenesis. As observed for many others RTK, MET is also strongly involved in tumor progression and invasion mechanisms. Although numerous biological and structural approaches have been focused on the molecular processes leading to MET activation by HGF/SF, the HGF/SF-MET interaction framework remains only partially understood due to the complexity of the multivalent ligand-receptor binding events.NK1, a naturally occurring splice variant of HGF/SF, comprising the N-terminal part and the first kringle domain (K1) of HGF/SF, exhibits a partial agonistic activity toward MET. Indeed, in presence of heparan sulfates, NK1 self-associates into a “head-to-tail” dimer and is considered as the minimal structural module able to trigger MET dimerization and activation. Nevertheless, the individual role of N and K1 domains in the dimerization/activation of MET remain elusive.Stimulated by the conviction that monomeric N and K1 domains are not suitable for studying the functioning of HGF/SF-MET, we produced, by total chemical synthesis, biotinylated analogs of the N and K1 domains (NB and K1B). By combining with streptavidin (S), we engineered the semisynthetic constructs NB/S and K1B/S in order to determine the biological properties of these new multivalent architectures of N and K1 domains.In vitro, as observed with HGF/SF or NK1, we show that the K1B/S complex is able to fully activate MET signaling cascades to promote scattering, morphogenesis and survival phenotypes in various cell types. Even more, the K1B/S complex stimulates angiogenesis in vivo and, when injected systemically, triggers MET signaling in the liver. The use of this K1B/S complex allows us to demonstrate that two K1 domains, correctly assembled and oriented, constitute the minimal unit for sufficient MET activation. In contrast, first in vitro data have demonstrated that NB/S complex does not bind directly MET as previously thought, but rather, uses heparan sulfates as a molecular bridge.We envision these new structural configurations serving as a template for both the rational design of potent MET agonists (e.g. using K1B/S for regenerative therapies) and antagonists (e.g. using NB/S for targeted cancer therapies).