Orientador: Maysa Furlan / Coorientador: Silvia Noelí López / Banca: Isabele Rodrigues Nascimento / Banca: Carlos Alberto Labate / Banca: Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva / Banca: Luciana Gonzaga de Oliveira / Resumo: Três espécies de Piper foram escolhidas como modelos para estudos biossintéticos, transcriptômicos e proteômicos: P. tuberculatum, P. nigrum e P. crassinervium. As duas primeiras espécies acumulam principalmente metabólitos secundários da classe das amidas e essas substâncias foram alvo de experimentos biossintéticos. Foram monitoradas as atividades de diversas enzimas envolvidas na via fenilpropanoídica, dentre elas a fenilalanina amônia liase (PAL) e a cinamato 4-hidroxilase (C4H). Observou-se também atividade de uma enzima que catalisa a conversão do ácido ferúlico ao ácido 3,4-metilenodioxicinâmico, denominada 3,4- metilenodioxicinâmico sintase. Esta é provavelmente uma enzima monooxigenase-dependente do citocromo P450. A principal questão biossintética está centrada na sequência na qual as reações ocorrem: o grupo metilenodioxílico pode ser formado antes ou depois da porção amídica. Para elucidar esta questão, sintetizou-se dois possíveis precursores contendo o grupo 4-hidróxi-3- metóxifenílico: o ácido ferupérico e a feruperina. No entanto, experimentos de atividade enzimática in vitro utilizando estes dois precursores não foram esclarecedores, devido a existência de piperina endógena no extrato enzimático proveniente de folhas de P. nigrum, o que impediu observar a formação de produto. Foi avaliado também a participação de ácido malônico e L-valina na biossintese destas amidas: incorporou-se precursores isotopicamente marcados em plântulas de P. tuberculatum: ácido 2-[13C]-malônico, ácido malônico-U-2H e 15N-L-valina). Após análise por CLAEEM, conclui-se que o ácido malônico participa da reação de condensação com fenilpropanóides, gerando os derivados C6-C5 e L-valina é precursor do grupo isobutilamina. Considerando todos as evidências... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Three Piper species were chosen as a models for biosynthetic, transcriptomic and proteomics studies: P. tuberculatum, P. nigrum and P. crassinervium. The first two species accumulate mainly amides as secondary metabolites. This class of compounds was targeted by biosynthetic experiments. It was monitored the enzymatic activities of several enzymes involved in the phenylpropanoid pathway, including phenylalanine ammonia-lyase and cinnamate 4-hydroxylase. It was also observed the activity of an enzyme that catalyzes the conversion of ferulic acid to 3,4- methylenedioxycinnamic acid, named 3,4 methylenedioxycinnamic acid synthase. The main question was centered on the biosynthetic sequence: whether the methylenedioxy group can be formed before or after the amide portion. In order to elucidate this question, two possible precursors containing the group 4-hydroxy-3-methoxyphenyl were synthesized: feruperic acid and feruperine. However, experiments of in vitro enzymatic activity using these two precursors were not enlightening, due to the existence of piperine as endogenous in the enzymatic extract from leaves of P. nigrum, which prevented observe the formation of product. It was also evaluate the participation of malonic acid and L-valine in the biosynthesis of these amides, by incorporating isotopically labeled precursors in plants of P. tuberculatum: 2-[13C]-malonic acid, malonic-U-2H acid and 15N-Lvaline. After analysis by HPLC-MS, it was concluded that the malonic acid participates in the condensation reaction with phenylpropanoids, generating the C6-C5 derivatives and L-valine is the putative precursor of the isobutylamine group. Considering all the experimental evidence, the biosynthetic pathway proposed was that in which the methylenedioxy group is formed before the amide. In the second step, it carried out the ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo o estudo das vias biossintéticas dos alcalóides piperidínicos presentes em Senna spectabilis, motivado pela potente atividade anticolinesterásica e baixa toxicidade observada no derivado (-)-3-O-acetil-espectalina (15), eleito como composto líder para o desenvolvimento de fármacos anti-Alzheimer que estão em fase de estudos pré-clínicos. Por outro lado, o interesse acadêmico no conhecimento das vias metabólicas, pode levar a estudos futuros de engenharia genética para potencializar a produção desses metabólitos uma vez que a síntese é extremamente complexa em função da presença de três centros estereogênicos. Tendo isso em vista, foram selecionadas seis espécies de Senna e Cassia para avaliar a presença dos alcalóides e selecionar aquela que os produz em maior quantidade. Foram estudadas as flores de S. spectabilis, S. multijuga, S. macranthera, S. velutina, C. fistula, C. leptophylla, sendo que só foram detectados alcalóides piperidínicos e piridínicos em S. spectabilis e S. multijuga, respectivamente, utilizando a espectrometria de massas tandem. Embora sejam de classes diferentes, esses metabólitos têm padrão de substituição similar, porém, apresentaram atividade anticolinesterásica diferenciada. De S. spectabilis foram isolados os alcalóides piperidínicos: (-)-cassina (1), (-)-espectalina (9), (-)-3-O-acetil-espectalina (15), (-)-3-O-acetil-cassina (16) e identificados 7-hidroxi-carnavalina (71), 7-hidroxi-cassina (18) e/ou espicigerina (42) utilizando a EM. De S. multijuga foram isolados os alcalóides piridínicos: 7'-multijuguinona (67) e 12'-hidroxi-7'-multijuguinona (69) e identificados 7'-multijuguinol (68) e 12'-hidroxi-7'- multijuguinol (70). Para os estudos biossintéticos dos alcalóides piperidínicos foi inicialmente proposta a biogênese onde lisina e acetato foram eleitos potenciais... (resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The following work encompass as main goal the study of biosynthetic pathways to produce piperidine alkaloids using Senna spectabilis as natural matrix. Such research was instigated due to the high acetylcholinesterase activity and low toxicity showed by the derivative (-)-3-O-acetyl-spectaline (15), selected as a lead compound against Alzheimer's disease and currently under pre-clinical trials. Still yet, the academic interest on researching metabolic pathways that may lead to further genetic engineering studies to enhance the production of these metabolites is of extremely importance, due to the inability of producing any commercially viable synthetic strategy for their stereogenic centers. We selected six Senna and Cassia species to evaluate the presence of these metabolites aiming to select which matrix will produce them the most. We studied flowers from S. spectabilis, S. multijuga, S. macranthera, S. velutina, C. fistula and C. leptophylla. From those, we were able to detect piperidine and pyridine alkaloids only in S. spectabilis and S. multijuga, respectively, using tandem mass spectrometry. Regardless of the different structural nature towards 15, those metabolites have similar substitution patterns and showed differential acetylcholinesterase activity. From S. spectabilis were isolated the piperidine alkaloids: (-)-cassine (1), (-)-spectaline (9), (-)-3-O-acetyl-spectaline (15), (-)-3-O-acetyl-cassine (16), and identified 7-hidroxy- carnavaline (71), 7-hidroxy-cassine (18) and/or spicigerine (42) by tandem mass spectrometry and from S. multijuga were isolated the pyridine alkaloids: 7'-multijuguinone (67), 12'-hydroxy-7'-multijuguinone (69) and, identified by MS: 7'-multijuguinol (68) and 12'-hydroxy-7'-multijuguinol (70). We initially proposed the incorporation of lysine and acetate as main precursors of the piperidine alkaloids biosynthetic pathway and thus... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Vanderlan da Silva Bolzani / Coorientador: Maysa Furlan / Banca: Ian Castro-Gamboa / Banca: Frederico Guaré Cruz / Banca: Márcia Nasser Lopes / Banca: Maria Claudia Marx Young / Doutor