Thesis (Ph. D.)--University of Missouri-Columbia, 1997. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 225-231). Also available on the Internet.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2002.

Th.--Sci. nat.--Nancy--I.N.P.L., 1984.

The scientific literature indicates that the biotransformation of xenobiotics in man is more similar to that observed in the non-human primate than to other laboratory animal species. The main objective of the current investigation was to compare the ability of 3 species of non-human primate, the rhesus monkey (Macaca mulatta), the cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) and the baboon (Papio species), to conjugate xenobiotics with glutathione since such information is lacking in the literature. The metabolism and pharmacokinetics of ethacrynic acid, a diuretic known to be extensively metabolised by glutathione conjugation in several other animal species, was studied in the non-human primates. The results indicate that the overall capacity for glutathione conjugation in the non-human primate is large, and demonstrate that various organs and tissues can simultaneously contribute to the detoxication and elimination of various xenobiotics by this pathway. In common with other laboratory animal species, the non-human primate excreted the major proportion of radioactivity, following administration of [14]C-ethacrynic acid, in the bile. The radioactivity in the bile was mainly associated with metabolites which had resulted from the initial conjugation of ethacrynic acid with glutathione, and the subsequent metabolism of this conjugate via the mercapturic acid pathway. There were notable species differences, between the non-human primates and other laboratory animals, in the proportions of the various metabolites which were excreted in the bile. Although the concentrations of glutathione in the various tissues of the non-human primate were similar to those reported for other mammals, species differences occurred in the rates of glutathione conjugation and the subsequent metabolism of the glutathione conjugate. A significant finding concerned the extent to which various aB-unsaturated xenobiotics were conjugated with glutathione. There were marked species differences between the non-human primate and the rat in this respect. The rhesus monkey, cynomolgus monkey and the baboon are similar as regards ethacrynic acid metabolism, tissue glutathione concentrations, tissue glutathione S-transferase activities, and the specific activities of the glutathione S-transferase isoenzymes. The rhesus monkey more closely resembles man in these respects, but both other species of non-human primate would appear to be suitable for use in metabolism and toxicological studies of compounds likely to be conjugated with glutathione.

1,1,2-trifluoroethene (HFO-1123) is intended for use as a refrigerant. Inhalation studies on HFO-1123 in rats suggested a low potential for toxicity, with no-observed-adverse-effect levels greater then 20,000 ppm. However, single inhalation exposure of Goettingen Minipigs and New Zealand White Rabbits resulted in mortality. It was assumed that conjugation of HFO-1123 with glutathione, via glutathione S-transferase, gives rise to S-(1,1,2-trifluoroethyl)-L-glutathione (1123-GSH), which is then transformed to the corresponding cysteine S-conjugate (S-(1,1,2-trifluoroethyl)-L-cysteine, 1123-CYS). Subsequent beta-lyase mediated cleavage of 1123-CYS may result in monofluoroacetic acid, a potent inhibitor of aconitase. Species-differences in 1123-GSH formation and 1123-CYS cleavage to MFA may explain species-differences in HFO-1123 toxicity. This study was designed to test the hypothesis, that GSH-dependent biotransformation and subsequent beta-lyase mediated formation of monofluoroacetic acid, a potent inhibitor of aconitase in the citric acid cycle, may play a key role in HFO-1123 toxicity and to evaluate if species-differences in the extent of MFA formation may account for the species-differences in HFO-1123 toxicity. The overall objective was to determine species-differences in HFO-1123 biotransformation in susceptible vs. less susceptible species and humans as a basis for human risk assessment. To this end, in vitro biotransformation of HFO-1123 and 1123-CYS was investigated in renal and hepatic subcellular fractions of mice, rats, humans, Goettingen Minipigs and NZW Rabbits. Furthermore, cytotoxicity and metabolism of 1123-CYS was assessed in cultured renal epithelial cells. Enzyme kinetic parameters for beta-lyase mediated cleavage of 1123-CYS in renal and hepatic cytosolic fractions were determined, and 19F-NMR was used to identify fluorine containing metabolites arising from 1123-CYS cleavage. Quantification of 1123-GSH formation in hepatic S9 fractions after incubation with HFO-1123 was performed by LC-MS/MS and hepatic metabolism of HFO-1123 was monitored by 19F-NMR. Rates of 1123-GSH formation were increased in rat, mouse and NZW Rabbit compared to human and Goettingen hepatic S9, indicating increased GSH dependent biotransformation in rats, mouse and NZW Rabbits. NZW Rabbit hepatic S9 exhibited increased 1123-GSH formation in the presence compared to the absence of acivicin, a specific gamma-GT inhibitor. This indicates increased gamma-GT mediated cleavage of 1123-GSH in NZW Rabbit hepatic S9 compared to the other species. 19F-NMR confirmed formation of 1123-GSH as the main metabolite of GSH mediated biotransformation of HFO-1123 in hepatic S9 fractions next to F-. Increased F- formation was detected in NZW Rabbit and Goettingen Minipig hepatic S9 in the presence of an NADPH regenerating system, indicating a higher rate of CYP-450 mediated metabolism in these species. Based on these findings, it is possible that CYP-450 mediated metabolism may contribute to HFO-1123 toxicity. In contrast to the increased formation of 1123-GSH in rat, mouse and NZW Rabbit hepatic S9 (compared to human and Goettingen Minipig), enzyme kinetic studies revealed a significantly higher beta-lyase activity towards 1123-CYS in renal cytosol of Goettingen Minipigs compared to cytosol from rats, mice, humans and NZW Rabbits. However, beta-lyase cleavage in renal NZW Rabbit cytosol was slightly increased compared to rat, mouse and human renal cytosols. 19F-NMR analysis confirmed increased time-dependent formation of MFA in renal Goettingen Minipig cytosol and NZW Rabbit (compared to human and rat cytosolic fractions). Three structurally not defined MFA-derivatives were detected exclusively in NZW Rabbit and Goettingen Minipig cytosols. Also, porcine kidney cells were more sensitive to cytotoxicity of 1123-CYS compared to rat and human kidney cells. Overall, increased beta-lyase mediate cleavage of 1123-CYS to MFA in Goettingen Minipig and NZW Rabbit kidney (compared to human and rat) may support the hypothesis that enzymatic cleavage by beta-lyases may account for the species-differences in HFO-1123 toxicity. However, the extent of GST mediated biotransformation in the liver as the initial step in HFO-1123 metabolism does not fully agree with this hypothesis, since 1123-GSH formation occurs at higher rates in rat, mouse and NZW Rabbit S9 as compared to the Goettingen Minipig. Based on the inconsistencies between the extent of GST and beta-lyase mediated biotransformation of HFO-1123 obtained by this study, a decisive statement about an increased biotransformation of HFO-1123 in susceptible species with a direct linkage to the species-specific toxicity cannot be drawn. Resulting from this, a clear and reliable conclusion regarding the risk for human health originating from HFO-1123 cannot be made. However, considering the death of Goettingen Minipigs and NZW Rabbits after inhalation exposure of HFO-1123 at concentrations great than 500 ppm and greater than 1250 ppm, respectively, this indicates a health concern for humans under peak exposure conditions. For a successful registration of HFO-1123 and its use as a refrigerant, further in vitro and in vivo investigations addressing uncertainties in the species-specific toxicity of HFO-1123 are urgently needed. / 1,1,2-Trifluorethen (HFO-1123) besitzt hervorragende klimatische und thermische Eigenschaften für den Einsatz als Kühlmittel. In Inhalationsstudien an Ratten, Kaninchen und Schweinen, die im Rahmen der regulatorischen Toxizitätsprüfung durchgeführt wurden, konnten ausgeprägte Speziesunterschiede in der Toxizität von HFO-1123 nachgewiesen werden. In Ratten zeigte HFO-1123 ein geringes Potential für akute und chronische Toxizität, mit NOAELs („No-Observed-Adverse-Effect Level“) größer als 20.000 ppm. Im Gegensatz dazu führte die einmalige HFO-1123 Exposition von Goettingen Minischweinen und Weißen Neuseeländer Kaninchen zum Tod von Versuchstieren. Bereits die niedrigste verwendete Raumkonzentrationen von 65 ppm führten bei Goettingen Minischweinen zu ausgeprägter Toxizität (Kardiotoxizität, Neurotoxizität). Auf Grundlage der inhalativen Toxizität, sowie detaillierter Kenntnis der Biotransformation strukturverwandten Substanzen wurde vermutet, dass Speziesunterschiede in der Toxizität auf einer speziesspezifischen Biotransformation von HFO-1123 beruhen. Der erste Schritt in der vermuteten Bioaktivierung von HFO-1123 könnte demnach eine Glutathion S-transferase abhänge Konjugation mit Glutathion beinhalten und zur Bildung von S-(1,1,2-trifluoroethyl)-L-Glutathion (1123-GSH) führen. Das gebildete Glutathion-Konjugat könnte gamma-Glutamyltransferase, sowie Dipeptidase und Aminotransferase abhängig zu seinem korrespondierenden Cystein S-Konjugat, S-(1,1,2-trifluoroethyl)-L-Cysteine (1123-CYS) abgebaut werden. Wie andere Cystein S-Konjugate mit elektronegativen Substituenten am Schwefelatom, könnte dieses mittels Cysteinkonjugat-beta-Lyasen (beta-Lyasen) zu einem Thionoacylfluorid- Intermediat umgewandelt werden. Nach Hydrolyse entsteht voraussichtlich Monofluoressigsäure (MFA) als stabiler Metabolit. MFA greift in den Zitronensäurezyklus ein, indem das Enzym Aconitase irreversible gehemmt wird. Die Hemmung der Aconitase führt zu einem Abbruch des Zitronensäurezyklus und somit zu einem erheblichen Eingriff in die Energiegewinnung des Organismus. Speziesunterschiede in der Bildung von 1123-GSH sowie der Spaltung von 1123-CYS zu MFA könnten die speziespezifische Toxizität von HFO-1123 erklären. Ziel dieser Arbeit war es die im vorherigen Absatz aufgestellte Arbeitshypothese, einer Glutathion-abhängigen Biotransformation von HFO-1123, gefolgt von einer beta-Lyase vermittelten Bildung von MFA zu überprüfen um deren Beitrag in der speziesspezifischen Toxizität von HFO-1123 einzuschätzen. Unterschiede im Ausmaß der Bildung von MFA könnten ursächlich für die Speziesunterschiede in der Toxizität von HFO-1123 sein. Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen als Grundlage für die Risikobewertung von HFO-1123 im Menschen dienen. Im Rahmen dieser Arbeit, wurde die in vitro Biotransformation von HFO-1123 und 1123-CYS in subzellulären Fraktionen von Leber und Niere der Spezies Ratte, Maus, Goettingen Minischwein, Kaninchen und Mensch untersucht. Zusätzlich wurde die Zytotoxizität und der Metabolismus von 1123-CYS in Nierenepithelzellen überprüft. Die Bildung von 1123-GSH wurde mittel LC-MS/MS in hepatischen S9 Fraktionen quantitativ bestimmt und die Entstehung weiterer Metabolite mittels 19F-NMR analysiert. Weiterhin wurde die Enzymkinetik der beta-Lyase vermittelten Spaltung von 1123-CYS in cytosolischen Leberfraktionen bestimmt und fluorhaltige Metabolite dieser Spaltung mittels 19F-NMR aufgezeichnet. In Leber S9 Fraktionen von Ratten, Mäusen und WN Kaninchen wurde eine gesteigerte Bildung von 1123-GSH im Vergleich zu S9 Fraktionen von Goettingen Minischweinen und Menschen beobachtet. Dies deutet auf eine gesteigerte Glutathion-abhängige Biotransformation in Ratten, Mäusen und WN Kaninchen hin. Zusätzlich zeigten Leber S9 Fraktionen von WN Kaninchen eine erhöhte Bildung von 1123-GSH in Anwesenheit von Acivicin, einem spezifischen gamma-GT Inhibitor. Dies deutet auf eine gesteigerte gamma-GT abhängige Spaltung von 1123-GSH in hepatischen S9 Fraktionen von WN Kaninchen hin. Zusätzlich bestätigten 19F-NMR Untersuchungen - neben anorganischem Fluorid (F-) - 1123-GSH als Hauptmetaboliten der Glutathion-abhängigen Biotransformation von HFO-1123. Die erhöhte Bildung von F- in Leber S9 Fraktionen von Goettingen Minischweinen und WN Kaninchen in Anwesenheit eines NADPH regenerierenden Systems, deutet weiterhin auf eine gesteigerte CYP-450 vermittelte Biotransformation in diesen Spezies hin. Jedoch ist der Beitrag der CYP-450 vermittelten Biotransformation von HFO-1123 zur speziesspezifischen Toxizität nicht geklärt. Im Gegensatz zur gesteigerten Bildung von 1123-GSH in Leber S9 Fraktionen von Ratten, Mäusen und Kaninchen (verglichen mit Leber S9 Fraktionen von Goettingen Minischweinen und Menschen), wurde in enzymkinetischen Untersuchungen eine erhöhte beta-Lyase Aktivität gegenüber 1123-CYS in Nierenzytosol von Goettingen Minischweinen im Vergleich zu zytosolischen Fraktionen von Ratten, Mäusen, Menschen und WN Kaninchen beobachtet. Trotz der niedrigeren beta-Lyase Aktivität in WN Kaninchen (verglichen mit Goettingen Minischwein), zeigte diese zytosolische Fraktion eine leicht erhöhte Aktivität im Vergleich zu Nierenzytosol von Ratten, Mäusen und Menschen. Im Einklang damit wurde eine erhöhte Bildung von MFA in Nierenzytosol von Goettingen Minischweinen und WN Kaninchen (im Vergleich zu zytosolischen Fraktionen von Menschen und Ratten) mittels 19F-NMR beobachtet. Interessanterweise wurde ausschließlich im Zytosol von Goettingen Minischweinen und WN Kaninchen die Bildung von drei strukturell nicht charakterisierten MFA-Derivaten nachgewiesen. Unterstützt wird die erhöhte beta-Lyase Aktivität in Nierenzytosol von Goettingen Minischweinen durch eine erhöhte Zytotoxizität von 1123-CYS in Nierenepithelzellen von Schweinen (Verglichen mit humanen und Ratten Nierenzellen). Grundsätzlich bestätigt die erhöhte beta-Lyase abhängige Spaltung von 1123-CYS zu MFA in Goettingen Minischweinen und WN Kaninchen die Annahme, dass eine beta-Lyase vermittelte Spaltung von 1123-CYS einen wichtigen Beitrag zur Toxizität von HFO-1123 leistet. Jedoch steht dem eine verminderte GST vermittelte Bildung von 1123-GSH in Goettingen Minischwein Leber S9 Fraktionen im Vergleich zu Ratten, Maus und WN Kaninchen entgegen. Auf Basis der bisher erhobenen Daten ist der Beitrag der Glutathion-abhängigen und beta-Lyase vermittelten Biotransformation zur Toxizität von HFO-1123 nicht abschließend geklärt und lässt eine eindeutige Aussage über eine vermehrte Biotransformation von HFO-1123 zu toxischen Metaboliten in empfindlichen Spezies im Zusammenhang mit der speziesspezifischen Toxizität nicht zu. Diese Unsicherheiten lassen keine Rückschlüsse über das Ausmaß der Biotransformation und Toxizität im Menschen zu. Für die Registrierung von HFO-1123 und seiner zukünftigen Verwendung als Kühlmittel sind weiter in vitro und in vivo Untersuchungen nötig, um die Sicherheit bei der Verwendung von HFO-1123 für die menschliche Gesundheit zu gewährleisten.

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