La "cryopolymérisation" permet d'obtenir des gels de polymère macroporeux ou "cryogels". Cette méthode a été utilisée pour la synthèse d'hydrogels thermosensibles à base de pNIPA. La température critique TC correspondant à la transition de volume a été déterminée par des mesures de taux de gonflement et par DSC. La macroporosité (distribution de la taille des pores et épaisseur des parois) et son évolution en fonction de T ont été étudiées par la microscopie biphotonique donnant des informations à l'échelle du µm à plusieurs dizaines de µm. La diffusion de rayons X (SAXS et WAXS) a été utilisée pour caractériser la structure multi-échelle (de quelques dixièmes à quelques dizaines de nm) du gel constituant les parois des macropores. Les courbes de diffusion ont été décrites analytiquement. L'évolution des dix paramètres contenus dans l'équation a été étudiée en fonction de T et discutée. Enfin, des expériences utilisant les phonons hyperfréquences générés par la technique des réseaux transitoires avec détection hétérodyne (HD-TG) ont été réalisées. Ces mesures ont permis de déterminer la vitesse de propagation de l'onde ultra-sonore (à 340 MHz), son atténuation, et la constante de diffusion thermique à différentes températures.

L'ostéoporose est une maladie du squelette caractérisée par une perte de la qualité osseuse qui entraîne un risque de fracture accru, notamment au niveau vertébral. Des modèles en éléments finis basés sur la tomodensitométrie permettent d'estimer la résistance vertébrale, et donc le risque de fracture, mais leur utilisation en routine clinique est limitée par le coût et l'irradiation engendrée par la tomodensitométrie. L'estimation la résistance vertébrale à partir d'un modèle en éléments finis basés sur l'imagerie basse dose, telle que l'absorptiométrie biphotonique à rayons X, ou la stéréo-radiographie EOS en double énergie, permettrait une utilisation en routine clinique. Cette thèse contribue au développement de la modélisation à partir de l'imagerie basse dose pour la prédiction du risque de fracture. Un modèle en éléments finis de résistance vertébrale y est évalué par rapport à un modèle basé sur la tomodensitométrie, et une étude de sensibilité identifie les facteurs importants du modèle sont analysés. Des méthodes de maillage hexaédrique morpho-réalistes à partir de la reconstruction 3D, et d'estimation de la distribution de densité à partir d'image 2D de densité y sont développées. De plus, profitant des possibilités du système EOS qui permet de radiographier le patient de la tête aux pieds, une méthode préliminaire est proposée pour estimer l'effort exercé sur les vertèbres in vivo. Nous espérons que nos méthodes pourront être utilisées très prochainement in vivo, et contribuer à l'estimation du risque de fracture ostéoporotique, et à la prise en charge des patients à risque de fracture. / Osteoporosis is a bone disease which decreases bone quantity and quality, and increases fracture risk, notably at the vertebral level. CT-scan-based finite element models allow predicting vertebral strength, and thus fracture risk, but their use in routine clinical practice is limited by the cost and accessibility of CT-scan. However, vertebral strength prediction from a finite element model based on low dose images, such as dual X-ray absorptiometry or EOS stereo-radiography in dual energy, would allow a wider use. This PhD thesis contributes to develop fracture risk estimation by such a model. The low dose approach is evaluated in comparison to CT-based finite element model, and a sensitivity study is performed to identify the most important parameters of the model. Hexahedral morpho-realistic meshing techniques from 3D reconstruction and estimation methods for the 3D bone mineral density distribution from low dose images are developed and evaluated. Moreover, taking advantage of EOS system's possibility to take full body radiographs in standing position, a preliminary method is proposed to estimate the load applied to vertebra in vivo. We hope those methods will be used soon in vivo, and will contribute to estimating osteoporotic fracture risk estimation in clinical situations.

La nanomédecine activée à deux-photon est devenue l'un des principaux candidats à l'accomplissement de la sélectivité spatiotemporelle nécessaire pour la nanomédecine. En effet, la raison d'être de l'application médicale de nanotechnologie dans le domaine du traitement du cancer est de diminuer et supprimer les effets secondaires causés par les techniques actuelles telles que la chimiothérapie et la radiothérapie, à cause de leur manque de sélectivité. Parmi diverses nanoparticules (NPs), les nanoparticules de silice mésoporeuse (MSN) ont attiré une attention croissante dans la dernière décennie pour leur faible cytotoxicité, leur internalisation cellulaire et excrétion, et leur capacité de combiner de nombreuses fonctions à la fois pour le diagnostique et la thérapie de cancers via un seul nanovéhicule : l'ainsi appelée nanomédecine théranostique.Dans cette thèse, des MSN pour l'activation à un et deux-photon d'imagerie par fluorescence, de délivrance de principe actifs et d'acides nucléiques, et de photothérapie dynamique (PTD), seront présentées. Premièrement, le relargage contrôlé de molécules encapsulées dans des MSN fonctionnalisées avec des nanovalves est considéré par effet plasmonique. La photodégradation contrôlée de la silice soumise à l'effet photothermique de NPs d'or est ensuite étudiée. Deuxièmement, l'activation biphotonique est considérée pour la délivrance contrôlée de molécules anticancéreuses in-vitro par avec des nano-rotor et des nano-valves, ainsi que la fonctionnalisation de surface des NPs par des dérivés d'ammonium- azobenzene pour la délivrance d'acides nucléiques. Troisièmement, des MSN multifonctionnelles incorporant des photosensibilisateurs à deux-photon sont systématiquement étudiées en termes de leurs propriétés optiques et photophysiques; la sélection du meilleur matériau est suivie d'applications biomédicales in-vitro.De plus, deux types de nanomatériaux émergeant sont également élaborés pour la nanomédecine activée à deux-photon, des NPs de polysilsesquioxane pontés (BS) et d'organosilice mésoporeuse périodiques (PMO). Ces matériaux furent élaborés sans précurseur de silice (tétraéthoxysilane par exemple), et seulement à partir de bis- ou multi-organoalkoxysilane, afin d'obtenir le plus haut pourcentage de matière organique pour l'application ciblée. En conséquence, des NPs de BS et de PMO hybrides à base de disulfures se révélèrent être des outils biodégradables, et les NPs à base de photosensibilisateurs furent appliquées pour la PTD à deux-photon. Des NPs de BS et de cœur-coquille d'or-BS sont synthétisées pour d'efficaces imagerie et PTD à deux-photon, tandis que des NPs de PMO servirent de nano-plateformes théranostiques. En outre, diverse NPs de PMO multipodes à surface spécifique très élevées sont présentées pour la construction de structuration complexe à l'échelle nanométrique.Enfin, des nano-conteneurs d'MSN composées de cœur d'oxyde de fer (Fe3O4@MSN) sont décrites pour de multiples applications. D'une part, l'élaboration de NPs MSN (et PMO) magnétiques sensibles à deux-photon est étudiée en tant que perspective pour la délivrance de gène combinant l'imagerie par résonance magnétique. D'autre part, les conteneurs de Fe3O4@MSN sont misent en œuvre et appliqués pour la dépollution de métaux lourds via la fonctionnalisation d'un ligand de type acide diéthylène triamine penta acétique. L'augmentation de l'efficacité de la dépollution est étudiée par la fonctionnalisation de la surface extérieure et/ou des pores des Fe3O4@MSN. / Two-photon actuated nanomedicine has become one of the main proponents for the achievement of the spatiotemporal selectivity needed for nanomedicine. Indeed, the raison d'être of the medical application of nanotechnology in the field of cancer treatment is to lower and suppress the side effects caused by current techniques such as chemotherapy and radiotherapy, due to their lack of selectivity. Among various nanoparticles (NPs), mesoporous silica nanoparticles (MSN) have attracted increasing attention over the past decade for their low cytotoxicity, cellular internalization and excretion, and the ability to carry multiple features for both the diagnosis and therapy of cancers in a single nanovehicle: the so-called theranostic nanomedicine.In this dissertation, I will describe MSN for one and/or two-photon-actuated fluorescence imaging, drug-delivery, gene delivery and photodynamic therapy (PDT). First, plasmonically-triggered cargo delivery via MSN nanovalves and designed mesoporous silica photodegradation is presented. Then, in-vitro two-photon-triggered drug delivery with azobenzene-functionalized MSN such as nanoimpellers and fluorescent nanovalves, along with preliminary studies of gene delivery via ammonium-functionalized nanoimpellers are discussed. Multifunctional MSN incorporating a two-photon photosensitizer are systematically studied in terms of the resulting optical and photophysical properties of the NPs, and then used for in-vitro biomedical applications.Furthermore, two kinds of emerging nanomaterials are also designed for two-photon actuated nanomedicine, bridged silsesquioxane (BS) and periodic mesoporous organosilica (PMO) NPs. These nanomaterials are elaborated without silica precursor (e.g. tetraethoxysilane) and solely with bis- or tetra-organoalkoxysilanes, thus providing materials with the highest organic content for the targeted applications. Consequently, disulfide-based hybrid BS and PMO NPs were elaborated as biodegradable nanomedical tools, and photosensitizer-based BS and PMO NPs were used for efficient in-vitro PDT. BS and gold-BS core-shells NPs are constructed for ultrabright two-photon imaging and efficient PDT, while two-photon functionalized PMO NPs serve as theranostic nanocarriers. Besides, versatile multipodal ethylene-benzene PMO NPs with very high surface areas are presented as a promising strategy for the design of structural complexities at the nanoscale.Finally, iron oxide core MSN shell (Fe3O4@MSN) nanocontainers are described for versatile applications. The design of two-photon-sensitive magnetic MSN and PMO core-shell nanovehicles is presented as a perspective for gene delivery and magnetic resonance imaging. Furthermore, Fe3O4@MSN containers are constructed for heavy metal removal of twelve of the most toxic metal ions through the diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA) ligand. The enhancement of the pollutant removal efficiency is studied by selective surface and/or porous DTPA functionalizations.

Ce travail de thèse s’inscrit dans le domaine émergent du « théranostique » qui associe le diagnostic par l’imagerie à la thérapie au sein d’un même système. De nouveaux photosensibilisateurs (PS) pour la thérapie photodynamique (PDT) activables par un processus d’excitation biphotonique ont été synthétisés. Ils sont composés de porphyrines reliées à des unités dicétopyrrolopyrroles. Ces systèmes présentent d’importantes valeurs de sections efficaces d’absorption biphotonique dans le proche infra-rouge ainsi que de bons rendements quantiques de formation d’oxygène singulet. Deux PS ont ensuite été reliés à des complexes de Gd(III) permettant d’apporter la fonction d’imagerie par résonance magnétique (IRM). En plus de conserver de bonnes propriétés d’absorption biphotonique, ces systèmes présentent également de remarquables valeurs de relaxivité. Enfin, des études de phototoxicité in cellulo ont démontré l’activité d’un des agents théranostiques sous irradiation biphotonique. Ces résultats permettent de valider pour la première fois le concept d’un agent moléculaire unique pour la PDT par absorption biphotonique et pour l’IRM. / The work presented in this thesis belongs to the emerging field of « theranostic » whose aim is to combine a diagnostic and a therapeutic agent within the same system. New photosensitizers (PS) activated by a two-photon absorption process for Photodynamic Therapy (PDT) have been synthesised. These systems consist of porphyrins conjuguated to diketopyrrolopyrrole units. These compounds have significant high two-photon absorption cross-sections in the near infrared and good singlet oxygen quantum yields. Two PS have been linked to Gd(III) complexes in order to bring the magnetic resonance imaging (MRI) function. These systems still have good two-photon absorption properties and also show remarkable high relaxivity values. Finally, in cellulo phototoxicity studies have been performed for one of the theranostic agent and the two-photon PDT activity has been retained. These results validate, for the first time, a proof of concept of a single molecular agent for two-photon PDT and for MRI.

Le glioblastome (GB) est une tumeur hétérogène, agressive devant laquelle les possibilités thérapeutiques disponibles restent limitées. L’étude de la zone péritumorale macroscopiquement normale (ZMN) des GB est essentielle à la compréhension de ses mécanismes de progression et de récidive. Le premier objectif de ce travail de Thèse a été de comparer les données de transcriptomique et de protéomique issues de l’analyse de la zone tumorale des GB dans le cadre du Projet Gliome Grand Ouest. Le taux de concordance entre les 2 modalités est faible, retrouvant toutefois comme point commun une dysrégulation de la protéine légère des neurofilaments qui pourrait servir de biomarqueur potentiel des GB. Le deuxième objectif de ce travail de Thèse a été la caractérisation de la ZMN des GB. Nous avons mis en évidence que cette zone, dont l’aspect est similaire à première vue à celui du tissu cérébral sain, n’est pas une simple zone de transition entre le GB et le tissu cérébral sain. En effet, la ZMN est une entité spécifique possédant des caractéristiques qui lui sont propres, comme la présence d’un phénotype particulier de cellules tumorales infiltrantes et de cellules stromales et une sur’expression des protéines CRYAB et H3F3A. Ce travail de Thèse a aussi été l’occasion de développer de nouvelles techniques d’imagerie per-opératoire de la ZMN, afin d’évaluer la présence d’un contingent tumoral et ainsi optimiser la qualité de la résection chirurgicale. La caractérisation de cette ZMN nous permet de mieux appréhender son implication dans la tumorogenèse et la présence de caractéristiques spécifiques de cette zone ouvre la porte à la détection de biomarqueurs spécifiques, ainsi qu’au développement de thérapies ciblées. Ce travail de Thèse a été valorisé par 2 publications, 2 articles soumis et un brevet est en cours de dépôt et d’évaluation par un cabinet de brevet. / Glioblastoma (GB) is a heterogeneous andaggressive tumor, before which therapeutic options arelimited. The study of the macroscopically normalperitumoral brain zone (PBZ) of GB is essential tounderstand its mechanisms of progression andrecurrence.The first objective of this thesis work was tocompare the transcriptomic and proteomic data from theGB tumor area obtained through the “Grand Ouest”glioma Project. The concordance rate between the 2modalities is low. However, one of the common featureis the dysregulation of neurofilament light polypeptide,which could serve as a biomarker potential of GB.The second objective of this thesis was thecharacterization of the PBZ. We have shown that thisarea, similar at first glance to that of healthy braintissue, is not a simple transition area between the GBand healthy brain tissue but a specific entity withcharacteristics of its own. For example, the ZMNpresents a particular phenotype of infiltrating GB cellsand stromal cells and a surexpression of CRYAB andH3F3A proteins.This thesis work was also an opportunity todevelop new intraoperative imaging techniques of thePBZ, with the aim to assess the presence of a tumoralinfiltration and optimize the quality of the surgicalresection.The characterization of this PBZ allows us tobetter understand its involvement in tumorigenesis andthe presence of specific characteristics of this areaopens the door for the detection of specific biomarkersand the development of targeted therapies.This thesis work was led to 2 publications, 2articles submitted and a patent being evaluated andredacted by a patent office.

Les opérations de hernies abdominales sont l’une des chirurgies les plus répandues dans le monde. Pourtant, malgré des progrès considérables en particulier dans le développement des textiles prosthétiques pour consolider la paroi abdominale, le taux de récurrence reste très élevé. Il apparaît donc nécessaire de développer des modèles numériques patient-spécifiques de la paroi abdominale afin de mesurer puis améliorer l’impact des solutions de soins. Les tissus assurant la cohésion et la stabilité de la paroi abdominale sont les gaines rectusiennes antérieure et postérieure et la ligne blanche, qui sont des tissus conjonctifs. Leur structure particulière, composée d’un entremêlement de fibres de collagène et d’élastine sont au cœur de cette étude.Ce mémoire a permis de mettre en évidence la relation entre architecture microscopique et comportement macroscopique des tissus fibreux. Grâce à des campagnes expérimentales combinant essais mécaniques et observations microscopiques, la structure des tissus a pu être identifiée et corrélée aux paramètres mécaniques. Des outils d’analyse d’images tridimensionnelles ont été développés afin d’estimer automatiquement l’anisotropie d’une texture. Les informations recueillies ont alors menées au développement d’un modèle constitutif anisotrope hypo-paramétré. Basé sur une description tridimensionnelle du réseau fibrillaire, le modèle a été écrit de manière à décorréler les paramètres liés à la structure et ceux relatifs à la nature même du matériau. En considérant les paramètres matériau similaires pour tous les individus, le modèle a démontré sa capacité à prédire le comportement mécanique à partir d’informations texturales / Abdominal hernia operations are one of the most common surgeries in the world. However, despite considerable progress, particularly in the development of prosthetic textiles to strengthen the abdominal wall, the recurrence rate remains very high. It therefore appears necessary to develop patient-specific numerical models of the abdominal wall in order to measure and improve the impact of care solutions. The tissues that ensure the cohesion and stability of the abdominal wall are the anterior and posterior rectus sheaths and the linea alba, which are connective tissues. Their particular structure, composed of an intertwining of collagen and elastin fibers, is at the heart of this study. This thesis highlighted the relationship between microscopic architecture and macroscopic behaviour of fibrous tissues. Thanks to experimental campaigns combining mechanical tests and microscopic observations, the structure of tissues has been identified and correlated to mechanical parameters. Three-dimensional image analysis tools have been developed to automatically estimate the anisotropy of a texture. The collected information then led to the development of a hypo-parameterized anisotropic constitutive model. Based on a three-dimensional description of the fibrillary network, the model was written in such a way as to uncorrelate the parameters related to the structure and those related to the nature of the material. By considering similar material parameters for every individual, the model demonstrated its ability to predict mechanical behaviour based on textural information

Les astrocytes protoplasmiques de la matière grise corticale sont des cellules gliales dont les prolongements très fins et ramifiés sont en contact avec les éléments neuronaux pré- et post-synaptiques d’une part, et les vaisseaux sanguins d’autre part. Ils expriment plusieurs récepteurs des neurotransmetteurs, entre autres des récepteurs purinergiques dont l'activation facilite l’activité calcique astrocytaire et la libération de gliotransmitters (par exemple, le glutamate, le GABA, l'ATP, et la D sérine) qui régulent l’activité des neurones et des cellules gliales situées au voisinage. L’objectif de ma thèse était d’étudier in situ l’activité calcique des astrocytes et de leurs prolongements en réponse à l’application des agonistes purinergiques. Lors de ma thèse, j’ai tout d'abord testé la possibilité d’induire l’expression spécifique de gènes d’intérêt par les astrocytes corticaux de souris adultes par la technique de recombinaison Cre-LoxP. J’ai comparé les performances d’un virus adeno-associé de type 5 (AAV5) flexé (AAV5.FLEX.EGFP) et d’une souris qui exprime un indicateur calcique (GCaMP3) sous contrôle de la recombinase (souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3). L’injection d’AAV5.FLEX.EGFP dans le cortex d’une souris hGFAPcre n’a pas permis l’expression spécifique d’EGFP. La combinaison des souris exprimant le cre recombinase sous contrôle d’un promoteur sélectif des astrocytes (GLAST-CreERT2 et Cx30-CreERT2) avec le AAV5.FLEX.EGFP ou avec une lignée des souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3 permet l’expression spécifique des gènes d’intérêt (EGFP et GCaMP3) par les astrocytes corticaux. J’ai ensuite analysé l’activité calcique des astrocytes qui expriment GCaMP3. J’ai utilisé la microscopie biphotonique et enregistré l’activité calcique spontanée et évoquée par application d’agonistes purinergiques sur des tranches de cortex somatosensoriel primaire de souris adultes GLAST-CreERT2. L’activité calcique spontanée est complexe, généralement locale et désynchronisée, répartie dans les prolongements et la région somatique. Les régions actives ont été identifiées à partir d’une carte de corrélation temporale calculée en MATLAB, et leurs caractéristiques (amplitude, durée, position, fréquence) mesurées grâce à des routines établies sous IGOR. La fréquence et l’amplitude de l’activité calcique paraissent augmenter lors de l’enregistrement, ce qui suggère une sensibilité significative et une photoactivation des astrocytes, en imagerie biphotonique. La durée des impulsions laser modulerait ce phénomène. En présence d'adénosine (1-100 µM) et d’ATP (100 µM), et de façon marginale en présence d’un agoniste P2X7 non sélectif (BzATP 50-100 µM), une activité calcique synchronisée accrue est visible dans le soma et les prolongements astrocytaires en présence de tétrodotoxine qui bloque les potentiels d'action et minimise l’activité synaptique. Le mécanisme de ces réponses synchronisées reste à étudier. Aucun effet significatif n’a été observé en présence d’un agoniste spécifique P2Y1 (MRS2365 50 uM). Mon travail a permis le développement : i) de modèles murins pour l’adressage sélectif de protéines d’intérêt au niveau des astrocytes protoplasmiques ; ii) d’outils d’analyse des signaux calciques astrocytaires au niveau sub-cellulaire. Il a mis en évidence des limites possibles des protocoles standards d'enregistrement de l’activité calcique des astrocytes en imagerie biphotonique. Il confirme l’importance de l’ATP et de l’adénosine pour la signalisation astrocytaire. / Grey matter protoplasmic astrocytes are compact glial cells with highly branched processes, enwrapping synapses, and one or two endfeet contacting the blood vessels. Several neurotransmitter receptors are expressed by astrocytes, among them purinergic receptors. Upon activation of these receptors, intracellular calcium (Ca2+) transients can be induced, that, in turn, trigger gliotransmitter release (e.g. glutamate, GABA, ATP, D-serine) and participate in astrocyte-to-astrocyte signaling as well as in the communication between astrocytes and neurons or other glia. During my PhD work, I first implemented and validated several approaches for targeting transgene expression specifically to cortical astrocytes and employed them to study purinergic signaling in astrocytes. To achieve astrocyte-specific transgene expression, I used either floxed adeno-associated viral (AAV) vectors or a Cre-dependent mouse line and several mouse lines expressing the Cre recombinase under astrocyte-specific promoters. Intracerebral injections of a Cre-dependent AAV serotype 5 containing the ubiquitous CAG promoter and an enhanced green fluorescent protein (AAV5.CAG.flex.EGFP) in adult mice expressing Cre recombinase under the human glial fibrillary protein (hGFAP) promoter resulted in a non-astrocyte specific expression in the cortex. Combining inducible mouse lines expressing Cre recombinase under the glutamate aspartate transporter (GLAST) promoter with the same AAV vector resulted in a virtually astrocyte-specific expression of the reporter gene. As an alternative approach for astrocyte-specific transgene expression, we used a Cre-dependent mouse line expressing the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Crossing this mouse line with the above described GLAST-CreERT2 mouse line or a Connexin30 (Cx30)-CreERT2 line led to selective GCaMP3 expression in cortical astrocytes. Second, I investigated both spontaneous and agonist-evoked Ca2+ transients in astrocytic processes, the investigation of which has presented a major challenge in earlier studies, due to the unspecific and weak labeling by membrane-permeable chemical Ca2+ indicators. Using the strategy developed in the first part of my work allowing an astrocyte-specific expression of the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Using two-photon excitation fluorescence (2PEF) imaging in acute slices of the primary somatosensory cortex, I recorded Ca2+ transients in the astrocytic soma and processes. By aid of a custom-made MATLAB routine based on a temporal Pearson correlation coefficient, active regions could be identified in an unbiased manner. Evoked Ca2+ transients were quantified using custom IGOR routines. Spontaneous desynchronized Ca2+ transients occurred in the processes and rarely in the soma. Ca2+ signals appeared localized in distinct microdomains. Their frequency appeared to increase during long recordings of several hundred images, suggesting that fine astrocytes are vulnerable to photodamage under imaging conditions routine in 2PEF microscopy. The possibility to minimize photodamage, by varying the length of the femtosecond laser pulses is under investigation. Bath application of adenosine (1-100 µM) and adenosine-triphosphate (ATP, 100 µM), as well as the application of the non-selective P2X7 receptor agonist (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine-5'-triphosphate, BzATP, 50-100 µM), in the presence of tetrodotoxin to block neuronal action potentials, evoked synchronized Ca2+ rises in the soma and the processes of astrocytes. The effect of adenosine was dose-dependent. No significant effect of the specific P2Y1 agonist (MRS2365, 50 µM) was seen. Altogether, my work sets up a powerful and versatile toolbox for studying astrocytic Ca2+ signaling at the sub-cellular level. It also pinpoints possible limits of standard two-photon recording protocols to investigate the local Ca2+ signals in fine astrocytic processes.

Les astrocytes protoplasmiques de la matière grise corticale sont des cellules gliales dont les prolongements très fins et ramifiés sont en contact avec les éléments neuronaux pré- et post-synaptiques d’une part, et les vaisseaux sanguins d’autre part. Ils expriment plusieurs récepteurs des neurotransmetteurs, entre autres des récepteurs purinergiques dont l'activation facilite l’activité calcique astrocytaire et la libération de gliotransmitters (par exemple, le glutamate, le GABA, l'ATP, et la D sérine) qui régulent l’activité des neurones et des cellules gliales situées au voisinage. L’objectif de ma thèse était d’étudier in situ l’activité calcique des astrocytes et de leurs prolongements en réponse à l’application des agonistes purinergiques. Lors de ma thèse, j’ai tout d'abord testé la possibilité d’induire l’expression spécifique de gènes d’intérêt par les astrocytes corticaux de souris adultes par la technique de recombinaison Cre-LoxP. J’ai comparé les performances d’un virus adeno-associé de type 5 (AAV5) flexé (AAV5.FLEX.EGFP) et d’une souris qui exprime un indicateur calcique (GCaMP3) sous contrôle de la recombinase (souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3). L’injection d’AAV5.FLEX.EGFP dans le cortex d’une souris hGFAPcre n’a pas permis l’expression spécifique d’EGFP. La combinaison des souris exprimant le cre recombinase sous contrôle d’un promoteur sélectif des astrocytes (GLAST-CreERT2 et Cx30-CreERT2) avec le AAV5.FLEX.EGFP ou avec une lignée des souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3 permet l’expression spécifique des gènes d’intérêt (EGFP et GCaMP3) par les astrocytes corticaux. J’ai ensuite analysé l’activité calcique des astrocytes qui expriment GCaMP3. J’ai utilisé la microscopie biphotonique et enregistré l’activité calcique spontanée et évoquée par application d’agonistes purinergiques sur des tranches de cortex somatosensoriel primaire de souris adultes GLAST-CreERT2. L’activité calcique spontanée est complexe, généralement locale et désynchronisée, répartie dans les prolongements et la région somatique. Les régions actives ont été identifiées à partir d’une carte de corrélation temporale calculée en MATLAB, et leurs caractéristiques (amplitude, durée, position, fréquence) mesurées grâce à des routines établies sous IGOR. La fréquence et l’amplitude de l’activité calcique paraissent augmenter lors de l’enregistrement, ce qui suggère une sensibilité significative et une photoactivation des astrocytes, en imagerie biphotonique. La durée des impulsions laser modulerait ce phénomène. En présence d'adénosine (1-100 µM) et d’ATP (100 µM), et de façon marginale en présence d’un agoniste P2X7 non sélectif (BzATP 50-100 µM), une activité calcique synchronisée accrue est visible dans le soma et les prolongements astrocytaires en présence de tétrodotoxine qui bloque les potentiels d'action et minimise l’activité synaptique. Le mécanisme de ces réponses synchronisées reste à étudier. Aucun effet significatif n’a été observé en présence d’un agoniste spécifique P2Y1 (MRS2365 50 uM). Mon travail a permis le développement : i) de modèles murins pour l’adressage sélectif de protéines d’intérêt au niveau des astrocytes protoplasmiques ; ii) d’outils d’analyse des signaux calciques astrocytaires au niveau sub-cellulaire. Il a mis en évidence des limites possibles des protocoles standards d'enregistrement de l’activité calcique des astrocytes en imagerie biphotonique. Il confirme l’importance de l’ATP et de l’adénosine pour la signalisation astrocytaire. / Grey matter protoplasmic astrocytes are compact glial cells with highly branched processes, enwrapping synapses, and one or two endfeet contacting the blood vessels. Several neurotransmitter receptors are expressed by astrocytes, among them purinergic receptors. Upon activation of these receptors, intracellular calcium (Ca2+) transients can be induced, that, in turn, trigger gliotransmitter release (e.g. glutamate, GABA, ATP, D-serine) and participate in astrocyte-to-astrocyte signaling as well as in the communication between astrocytes and neurons or other glia. During my PhD work, I first implemented and validated several approaches for targeting transgene expression specifically to cortical astrocytes and employed them to study purinergic signaling in astrocytes. To achieve astrocyte-specific transgene expression, I used either floxed adeno-associated viral (AAV) vectors or a Cre-dependent mouse line and several mouse lines expressing the Cre recombinase under astrocyte-specific promoters. Intracerebral injections of a Cre-dependent AAV serotype 5 containing the ubiquitous CAG promoter and an enhanced green fluorescent protein (AAV5.CAG.flex.EGFP) in adult mice expressing Cre recombinase under the human glial fibrillary protein (hGFAP) promoter resulted in a non-astrocyte specific expression in the cortex. Combining inducible mouse lines expressing Cre recombinase under the glutamate aspartate transporter (GLAST) promoter with the same AAV vector resulted in a virtually astrocyte-specific expression of the reporter gene. As an alternative approach for astrocyte-specific transgene expression, we used a Cre-dependent mouse line expressing the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Crossing this mouse line with the above described GLAST-CreERT2 mouse line or a Connexin30 (Cx30)-CreERT2 line led to selective GCaMP3 expression in cortical astrocytes. Second, I investigated both spontaneous and agonist-evoked Ca2+ transients in astrocytic processes, the investigation of which has presented a major challenge in earlier studies, due to the unspecific and weak labeling by membrane-permeable chemical Ca2+ indicators. Using the strategy developed in the first part of my work allowing an astrocyte-specific expression of the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Using two-photon excitation fluorescence (2PEF) imaging in acute slices of the primary somatosensory cortex, I recorded Ca2+ transients in the astrocytic soma and processes. By aid of a custom-made MATLAB routine based on a temporal Pearson correlation coefficient, active regions could be identified in an unbiased manner. Evoked Ca2+ transients were quantified using custom IGOR routines. Spontaneous desynchronized Ca2+ transients occurred in the processes and rarely in the soma. Ca2+ signals appeared localized in distinct microdomains. Their frequency appeared to increase during long recordings of several hundred images, suggesting that fine astrocytes are vulnerable to photodamage under imaging conditions routine in 2PEF microscopy. The possibility to minimize photodamage, by varying the length of the femtosecond laser pulses is under investigation. Bath application of adenosine (1-100 µM) and adenosine-triphosphate (ATP, 100 µM), as well as the application of the non-selective P2X7 receptor agonist (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine-5'-triphosphate, BzATP, 50-100 µM), in the presence of tetrodotoxin to block neuronal action potentials, evoked synchronized Ca2+ rises in the soma and the processes of astrocytes. The effect of adenosine was dose-dependent. No significant effect of the specific P2Y1 agonist (MRS2365, 50 µM) was seen. Altogether, my work sets up a powerful and versatile toolbox for studying astrocytic Ca2+ signaling at the sub-cellular level. It also pinpoints possible limits of standard two-photon recording protocols to investigate the local Ca2+ signals in fine astrocytic processes.

Les biofilms sont des communautés microbiennes se développant sur des interfaces, en particulier solide-liquide, où les micro-organismes sont enrobés dans une matrice polymérique auto-sécrétée. Le mode de vie sous forme de biofilm est prédominant dans les milieux naturels (par e.g. la texture glissante des fonds de rivières, les dépôts visqueux des canalisations et la plaque dentaire) et confère aux micro-organismes un environnement propice à leur développement. Ceci est particulièrement vrai dans des milieux poreux qui, de part leur important ratio surface/volume, constituent des substrats favorables à la colonisation. Le cadre des biofilms en milieux poreux forme une complexité multi-physique d’ordre élevée dans laquelle interagissent des mécanismes physiques, chimiques et biologiques multi-échelles encore mal compris et très partiellement maîtrisés. La rétroaction entre l’écoulement, la distribution spatiale des microorganismes et le transport de nutriments (par diffusion et advection) en est un exemple. Le développement de biofilms en milieux poreux est au centre de multiples procédés d’ingénierie, tel que les bio-filtres, la bio-remédiation des sols, le stockage de CO2, et de problèmes médicaux comme les infections. Un verrou significatif à l’avancée des connaissances est la limitation des techniques exploratoires en métrologie et imagerie dans des milieux opaques. L’objectif principal de cette thèse est la proposition de méthodologies expérimentales reproductibles et robustes permettant l’étude de biofilms en milieux poreux. Un dispositif expérimental en conditions physiques et biologiques contrôlées est proposé. De plus, un protocole d’imagerie 3D basé sur la micro-tomographie à rayons X (MT RX) associé à l’utilisation d’un nouvel agent de contraste (sulfate de baryum et gel d’agarose), est validé afin de quantifier la distribution spatiale du biofilm. Dans un premier temps, la méthodologie MT RX est comparée à une des méthodes les plus utilisées pour la visualisation de biofilms : la microscopie photonique par fluorescence, ici biphotonique (MBP). Cette comparaison est réalisée pour des biofilms de Pseudomonas Aeruginosa développés dans des capillaires transparents en verre, ce qui facilite l’application des deux modalités. Dans un second temps, une étude des incertitudes liées à l’imagerie est réalisée à travers l’évaluation de différentes métriques (volume, surfaces 3D, épaisseurs) pour un fantôme d’imagerie et trois algorithmes de segmentation différents. Les analyses quantitatives montrent que le protocole de MT RX permet une visualisation du biofilm avec une incertitude d’environ 17%, ce qui est comparable à la MBP (14%). La reproductibilité et la robustesse de la méthodologie MT RX est démontrée. La troisième étape du travail de recherche permet d’aboutir au développement d’un bioréacteur innovant élaboré par fabrication additive et contrôlé par un système micro-fluidique de haute précision. Le dispositif expérimental que nous avons conçu permet de suivre en temps réel l’évolution des propriétés de transport (perméabilité effective), les concentrations en O2 et le détachement de biofilm par spectrophotométrie ; ceci pour des conditions hydrodynamiques contrôlées. Notre méthodologie permet d’étudier l’influence de paramètres biophysiques sur la colonisation du milieu poreux, par exemple l’influence du débit ou de la concentration de nutriments sur le développement temporel du biofilm. En conclusion, ce travail de thèse propose une méthodologie expérimentale reproductible et robuste pour la croissance contrôlée et l’imagerie 3D de biofilms en milieux poreux en apportant la versatilité du contrôle de la micro-architecture du milieu, de l’écoulement et des conditions biochimiques de culture. A notre connaissance, l’approche scientifique suivie et les dispositifs expérimentaux associés constitue la méthodologie la plus complète à ce jour, pour l’étude de biofilms en milieu poreux. / Biofilms are microbial communities developing at the interface between two phases, usually solidliquid, where the micro-organisms are nested in a self-secreted polymer matrix. The biofilm mode of growth is predominant in nature (for e.g. the slimy matter forming on rocks at river bottoms, the viscous deposit in water pipes or even dental plaque) and confers a suitable environment for the development of the micro-organisms. This is particularly the case for porous media which provide favourable substrates given their significant surface to volume ratio. The multi-physical framework of biofilms in porous media is highly complex where the mechanical, chemical and biological aspects interacting at different scales are poorly understood and very partially controlled. An example is the feedback mechanism between flow, spatial distribution of the micro-organisms and the transport of nutrient (by diffusion and advection). Biofilms developing in porous media are a key process of many engineering applications, for example biofilters, soil bio-remediation, CO2 storage and medical issues like infections. Progress in this domain is substantially hindered by the limitations of experimental techniques in metrology and imaging in opaques structures. The main objective of this thesis is to propose robust and reproducible experimental methodologies for the investigation of biofilms in porous media. An experimental workbench under controlled physical and biological conditions is proposed along with a validated 3D imaging protocol based on X-ray micro-tomography (XR MT) using a novel contrast agent (barium sulfate and agarose gel) to quantify the spatial distribution of the biofilm. At first, the XR MT-based methodology is compared to a commonly used techniques for biofilm observation: one or multiple photon excitation fluorescence microscopy, here two-photon laser scanning microscopy (TPLSM). This comparison is performed on Pseudomonas Aeruginosa biofilms grown in transparent glass capillaries which allows for the use of both imaging modalities. Then, the study of uncertainty associated to different metrics namely volume, 3D surface area and thickness, is achieved via an imaging phantom and three different segmentation algorithms. The quantitative analysis show that the protocol enables a visualisation of the biofilm with an uncertainty of approximately 17% which is comparable to TPLSM (14%). The reproducibility and robustness of the XR MT-based methodology is demonstrated. The last step of this work is the achievement of a novel bioreactor elaborated by additive manufacturing and controlled by a high-performance micro-fluidic system. The experimental workbench that we have designed enables to monitor in real-time the evolution of transport properties (effective permeability), O2 concentrations and biofilm detachment by spectrophotometry, all under controlled hydrodynamical conditions. Our methodology allows to investigate the influence of biophysical parameters on the colonisation of the porous medium, for example, the influence of flow rate or nutrient concentration on the temporal development of the biofilm. In conclusion, the thesis work proposes a robust and reproducible experimental methodology for the controlled growth and 3D imaging of biofilms in porous media; while providing versatility in the control of the substrate’s micro-architecture as well as on the flow and biochemical culture conditions. To our knowledge, the scientific approach followed, along with the experimental apparatus, form the most complete methodology, at this time, for the study of biofilms in porous media.

Les tumeurs intracrâniennes font partie des pathologies les plus fréquentes en neurologie après les accidents vasculaires cérébraux et les démences. On estime leur incidence à 10 nouveaux cas par an pour 100000 personnes. Les glioblastomes en sont la forme la plus virulente et malgré les avancées médicales des dernières années leur pronostic demeure très pessimiste. En effet, la médiane de survie est de l'ordre de 12 mois et le taux de survie à 5 ans est seulement de 2%.<br />L'un des enjeux actuels de la recherche en neuro-oncologie est de mettre au point de nouveaux traitements à visée curative. C'est le cas de la thérapie de photoactivation du platine par irradiation synchrotron (PAT-Plat), technique qui a été développée au cours des dernières années et qui a montré des effets curatifs chez des rats porteurs du gliome F98.<br />Dans ce travail de thèse, nous avons cherché à mieux caractériser les effets de la PAT-Plat et de ses différentes modalités (chimiothérapie à base de cisplatine et radiothérapie synchrotron) sur les tissus et la vascularisation cérébrale saine ainsi que sur le gliome F98. La microscopie biphotonique intravitale a été utilisée comme méthode d'observation et notre étude a donné lieu au développement de plusieurs méthodes (observation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), imagerie de la vascularisation tumorale, marquage des astrocytes et des fibres élastiques en intravital).<br />Nous avons ainsi démontré qu'une irradiation synchrotron (15Gy/79keV) n'entraînait pas d'effets secondaires à court terme (rupture de la BHE, diminution de la perfusion, gliose, ...) dans le cortex pariétal de souris nude. Nous avons également mis en évidence qu'un effet de synergie entre le cisplatine et l'irradiation était à l'origine des effets spectaculaires de la PAT-Plat. Enfin, nous avons souligné qu'outre son action sur les cellules tumorales, la thérapie entraînait une diminution de la perfusion des vaisseaux angiogéniques.