A qualidade do oócito é um fator limitante na fertilidade das fêmeas e reflete seu intrínseco potencial ao desenvolvimento embrionário subsequente. As alterações moleculares e bioquímicas no processo de maturação dos oócitos são necessárias para permitir a fecundação destes. Sob influência das gonadotrofinas, uma cascata de eventos é desencadeada, alterando a expressão gênica e a estrutura dos folículos. A maturação ocorre pelo intercâmbio entre o oócito e as células do cumulus que irão fornecer fatores para o desenvolvimento do oócito e criar o microambiente necessário para garantir o sucesso na maturação. A ação do FSH sobre a retomada da meiose ocorre, possivelmente, por ativação da proteína quinase C (PKC). A via de sinalização desta proteína parece estar envolvida na ativação da quinase ativada por mitógeno (MAPK) em oócitos e células do cumulus, na maturação induzida por FSH e LH, além de regular a síntese do Fator de Crescimento Epidermal (EGF). Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação da PKC na maturação de oócitos bovinos e se esta ativação envolve o EGF. Para tal foram realizados dois experimentos. Em ambos, a progressão do ciclo celular foi avaliada utilizando a sonda fluorescente Hoechst 33342. A expansão das células do cumulus foi avaliada utilizando-se o software Image Pro Plus 5.1 para análise das imagens dos oócitos geradas em microscópio Olympus IX81. O maior diâmetro de cada complexo cumulus oócito foi adotado como parâmetro de mensuração da expansão. A dosagem de progesterona do meio de cultivo foi realizada pela técnica de RIA. A ativação da PKC e da MAPK foi avaliada pela técnica de Western blot. Os dados foram avaliados pelo software SigmaPlot versão 12.2 e submetidos ao teste de normalidade (Shapiro-Wilk). Quando necessário, os dados foram transformados. Para comparação entre dois tratamentos, utilizou-se o teste t-student. Para mais de dois tratamentos foi realizada análise de variância e teste de comparação de médias (TUKEY), considerando-se 0,05 para rejeitar a hipótese de nulidade. No experimento 1 foi avaliado se a ativação da PKC foi estimulada por gonadotrofinas. Os oócitos foram maturados in vitro tratados com gonadotrofinas, na presença ou ausência do inibidor de PKC. A presença do inibidor de PKC diminuiu as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão das células do cumulus, sem alterar a esteroidogênese. Estes resultados demonstram que a PKC participa da via de sinalização da retomada da meiose. No experimento 2 foi avaliado se o EGF está envolvido na via regulada pela PKC. Os oócitos foram maturados in vitro, na presença ou ausência de LH e FSH, do inibidor de PKC e do EGF. O EGF foi capaz de reverter os efeitos do inibidor de PKC, aumentando as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão de células do cumulus. Não foi possível detectar, nas condições deste experimento, a ativação das proteínas PKC e MAPK através do Western Blot. Este trabalho permite concluir que a via de sinalização da maturação de oócitos bovinos envolve a PKC e sugere a participação do EGF nesta via. / Oocyte quality is a limiting factor in female fertility and reflects its potential to the subsequent embryonic development. Molecular and biochemical alterations during the oocyte maturation process are needed to allow fecundation. Under gonadotropin influence, cascade of events occurs changing gene expression and follicle structure. Maturation depends on the interaction between oocyte and cumulus cells interaction, which provides factors for oocyte development and create the ideal microenvironment for the success of the maturation process. The FSH stimulation of meiosis resumption probably occurs through PKC activation. The signaling pathway of PKC might be involved by the mitogen activated protein kinase (MAPK) in oocytes and cumulus cells during FSH-LH induced maturation. Furthermore, MAPK regulates the epidermal growth factor (EGF) synthesis. The aim of the present study was to evaluate PKC function during bovine oocyte maturation and if its activity involves EGF. Two experiments were performed. In both experiments, the cell cycle progression was analyzed by Hoechst 33342 fluorescent dye. The cumulus cells expansion was performed using software Image Pro Plus 5.1 by the analysis of oocyte images taken in Olympus IX81 microscope. The highest diameter of each cumulus oocyte complex was recorded as the expansion value. The RIA and Western Blot techniques were used to measure progesterone concentration in the culture media and the PKC and MAPK activity, respectively. Data was analyzed by SigmaPlot software, version 12.2. The Shapiro-Wilk test was used to assess for normality and, when needed, the data was transformed. Student t tests were carried out to compare two treatments. Differences between more than two means were assessed by analysis of variance followed by Tukey test, considering P-value lower than 0.05 as statistically significant. Experiment 1 studied whether PKC function was stimulated by gonadotropins. FSH and LH were used for oocyte maturation in vitro, with or without PKC inhibitor. The presence of PKC inhibitor decreased germinal vesicle breakdown and the cumulus cells expansion, but did not alter the steroidogenesis. These results show that PKC participates in the signaling pathway of meiosis resumption. The Experiment 2 evaluated whether EGF influences PKC signaling pathway. The oocytes were matured in vitro, in the presence or absence of LH and FSH, PKC inhibitor and EGF. Epidermal Growth Factor was able to reverse PKC inhibitor effects, increasing germinal vesicle breakdown rates and cumulus cells expansion. The Western Blot technique was not able to detect PKC and MAPK activity, considering the conditions of this study. In conclusion, PKC is involved in the signaling pathway of bovine oocytes maturation and its pathway is mediated by EGF.

A qualidade do oócito é um fator limitante na fertilidade das fêmeas e reflete seu intrínseco potencial ao desenvolvimento embrionário subsequente. As alterações moleculares e bioquímicas no processo de maturação dos oócitos são necessárias para permitir a fecundação destes. Sob influência das gonadotrofinas, uma cascata de eventos é desencadeada, alterando a expressão gênica e a estrutura dos folículos. A maturação ocorre pelo intercâmbio entre o oócito e as células do cumulus que irão fornecer fatores para o desenvolvimento do oócito e criar o microambiente necessário para garantir o sucesso na maturação. A ação do FSH sobre a retomada da meiose ocorre, possivelmente, por ativação da proteína quinase C (PKC). A via de sinalização desta proteína parece estar envolvida na ativação da quinase ativada por mitógeno (MAPK) em oócitos e células do cumulus, na maturação induzida por FSH e LH, além de regular a síntese do Fator de Crescimento Epidermal (EGF). Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação da PKC na maturação de oócitos bovinos e se esta ativação envolve o EGF. Para tal foram realizados dois experimentos. Em ambos, a progressão do ciclo celular foi avaliada utilizando a sonda fluorescente Hoechst 33342. A expansão das células do cumulus foi avaliada utilizando-se o software Image Pro Plus 5.1 para análise das imagens dos oócitos geradas em microscópio Olympus IX81. O maior diâmetro de cada complexo cumulus oócito foi adotado como parâmetro de mensuração da expansão. A dosagem de progesterona do meio de cultivo foi realizada pela técnica de RIA. A ativação da PKC e da MAPK foi avaliada pela técnica de Western blot. Os dados foram avaliados pelo software SigmaPlot versão 12.2 e submetidos ao teste de normalidade (Shapiro-Wilk). Quando necessário, os dados foram transformados. Para comparação entre dois tratamentos, utilizou-se o teste t-student. Para mais de dois tratamentos foi realizada análise de variância e teste de comparação de médias (TUKEY), considerando-se 0,05 para rejeitar a hipótese de nulidade. No experimento 1 foi avaliado se a ativação da PKC foi estimulada por gonadotrofinas. Os oócitos foram maturados in vitro tratados com gonadotrofinas, na presença ou ausência do inibidor de PKC. A presença do inibidor de PKC diminuiu as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão das células do cumulus, sem alterar a esteroidogênese. Estes resultados demonstram que a PKC participa da via de sinalização da retomada da meiose. No experimento 2 foi avaliado se o EGF está envolvido na via regulada pela PKC. Os oócitos foram maturados in vitro, na presença ou ausência de LH e FSH, do inibidor de PKC e do EGF. O EGF foi capaz de reverter os efeitos do inibidor de PKC, aumentando as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão de células do cumulus. Não foi possível detectar, nas condições deste experimento, a ativação das proteínas PKC e MAPK através do Western Blot. Este trabalho permite concluir que a via de sinalização da maturação de oócitos bovinos envolve a PKC e sugere a participação do EGF nesta via. / Oocyte quality is a limiting factor in female fertility and reflects its potential to the subsequent embryonic development. Molecular and biochemical alterations during the oocyte maturation process are needed to allow fecundation. Under gonadotropin influence, cascade of events occurs changing gene expression and follicle structure. Maturation depends on the interaction between oocyte and cumulus cells interaction, which provides factors for oocyte development and create the ideal microenvironment for the success of the maturation process. The FSH stimulation of meiosis resumption probably occurs through PKC activation. The signaling pathway of PKC might be involved by the mitogen activated protein kinase (MAPK) in oocytes and cumulus cells during FSH-LH induced maturation. Furthermore, MAPK regulates the epidermal growth factor (EGF) synthesis. The aim of the present study was to evaluate PKC function during bovine oocyte maturation and if its activity involves EGF. Two experiments were performed. In both experiments, the cell cycle progression was analyzed by Hoechst 33342 fluorescent dye. The cumulus cells expansion was performed using software Image Pro Plus 5.1 by the analysis of oocyte images taken in Olympus IX81 microscope. The highest diameter of each cumulus oocyte complex was recorded as the expansion value. The RIA and Western Blot techniques were used to measure progesterone concentration in the culture media and the PKC and MAPK activity, respectively. Data was analyzed by SigmaPlot software, version 12.2. The Shapiro-Wilk test was used to assess for normality and, when needed, the data was transformed. Student t tests were carried out to compare two treatments. Differences between more than two means were assessed by analysis of variance followed by Tukey test, considering P-value lower than 0.05 as statistically significant. Experiment 1 studied whether PKC function was stimulated by gonadotropins. FSH and LH were used for oocyte maturation in vitro, with or without PKC inhibitor. The presence of PKC inhibitor decreased germinal vesicle breakdown and the cumulus cells expansion, but did not alter the steroidogenesis. These results show that PKC participates in the signaling pathway of meiosis resumption. The Experiment 2 evaluated whether EGF influences PKC signaling pathway. The oocytes were matured in vitro, in the presence or absence of LH and FSH, PKC inhibitor and EGF. Epidermal Growth Factor was able to reverse PKC inhibitor effects, increasing germinal vesicle breakdown rates and cumulus cells expansion. The Western Blot technique was not able to detect PKC and MAPK activity, considering the conditions of this study. In conclusion, PKC is involved in the signaling pathway of bovine oocytes maturation and its pathway is mediated by EGF.

Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-12T15:28:06Z No. of bitstreams: 1 GBN VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO P IMPRESSÃO.pdf: 1111649 bytes, checksum: f77c4c688d28fc8ca13182c8832085f8 (MD5) / Rejected by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: No arquivo submetido ao repositório deve estar inserido o certificado de aprovação (documento obrigatório). A informação sobre a lombada não precisa conter no arquivo pdf inserido. Favor inserir o certificado de aprovação e submeter novamente a sua dissertação no repositório. Agradecemos a compreensão on 2018-04-13T11:25:20Z (GMT) / Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-13T14:08:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação GIOVANA BARROS NUNES VERSÃO DEFINITIVA Repositório.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito do precursor do peptídeo natriurético tipo C (NPPC) durante o cultivo de pré-maturação in vitro (pré-MIV) de oócitos bovinos sobre: 1) a progressão da maturação nuclear; 2) a expressão gênica das células do cumulus e 3) a aquisição da competência do oócito para o desenvolvimento embrionário in vitro. Os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram pré-MIV com 100 nM NPPC por 8 horas (grupo NPPC) e, ao final do período, foram lavados para completa remoção do NPPC e submetidos à MIV por 22h. Após 8h de pré-MIV e após 8h de pré-MIV seguidas de 22h de MIV (duração total do cultivo = 30h) foram avaliadas a progressão da maturação nuclear e a expressão relativa de mRNA nas células do cumulus. O grupo controle (C) foi maturado na ausência de NPPC por até 30h, e as mesmas avaliações anteriores foram realizadas imediatamente após a remoção do ambiente folicular (C0), após 8h de cultivo (C8), após 22h de cultivo (C22) e após 30h de cultivo (C30). Em outro experimento, cujos tratamentos foram idênticos aos supramencionados, os oócitos foram fecundados ao término da MIV e foi avaliado o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos. Após 8h de cultivo de pré-MIV, a análise da progressão da meiose demonstrou que o grupo C0 apresentou 58,9% de estruturas com configuração de GV1, enquanto que o grupo C8 apresentou apenas 13,9% de estruturas nesta configuração (P<0,05). A proporção de GV1 no grupo NPPC foi semelhante a ambos estes grupos (22,8%; P>0,05). Por outro lado, o grupo C8 apresentou maior taxa de GV3 em relação ao C0 (53,1% vs. 3,62%; P<0,05), sem diferenças com o grupo NPPC (38,7%; P>0,05). Ao final do cultivo de MIV, não foi observada diferença entre os grupos (C22 vs. NPPC vs. C30) com relação à maturação nuclear, todavia, houve maior taxa de oócitos degenerados no C30 em comparação com C22 (11,4% vs. 2,8%; P<0,05). A análise da expressão relativa de genes das células do cumulus após 8h de pré-MIV com NPPC evidenciou aumento (P<0,05) na expressão de genes relacionados à expansão destas células (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 e VCAN), à maturação oocitária (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) e ao desenvolvimento embrionário (IGF1R, KRT8 e LUM). Ao final do cultivo de MIV, observou-se no grupo NPPC que o gene PTX3, relacionado à expansão das células do cumulus, além dos genes AREG e BDNF, relacionados à maturação oocitária, e o gene LUM, relacionado ao desenvolvimento embrionário estavam mais expressos em comparação com o grupo C30 (P<0,05). Com relação ao desenvolvimento embrionário, os grupos experimentais não apresentaram diferença (P>0,05) quanto à taxa de clivagem (média de 73,22%). Embora o grupo NPPC não tenha diferido (P>0,05) de C22 e C30 quanto à taxa de blastocistos, houve diferença entre C22 e C30 (69,3 vs. 37,4; P<0,05). Todavia, não houve diferença entre os grupos com relação ao número de células totais (blastômeros) e apoptóticas (P>0,05). Em conclusão, o cultivo de pré-MIV de oócitos bovinos por 8h com 100nM NPPC não bloqueou a retomada da meiose, mas a progressão da meiose ocorreu de forma mais lenta e impediu o envelhecimento e degeneração dos oócitos. O cultivo de oócitos por tempo prolongado (30h) na ausência de NPPC foi prejudicial para o desenvolvimento embrionário, mas o tratamento com NPPC (8h pré-MIV+22h MIV = duração total de 30h) reverteu parcialmente este índice. / The aim of this study was to evaluate the effect of the C-type natriuretic peptide precursor (NPPC) during pre in vitro maturation culture (pre-IVM) of bovine oocytes on: 1) nuclear maturation progress; 2) gene expression in cumulus cells and 3) acquisition of competence for in vitro embryo development. Cumulus oocyte complexes (COCs) were pre-IVM with 100 nM NPPC for 8 hours (NPPC group) and then were washed for the complete removal of NPPC and submitted to IVM for 22h. After 8h pre-IVM followed by 22h IVM (total culture time = 30h) oocytes were evaluated for nuclear maturation progress and cumulus cells for relative mRNA expression. Control group (C) was IVM in the absence of NPPC for up to 30h and the same evaluations were made immediately after follicle removal (C0) and after 8h (C8), 22h (C22) and after 30h of culture (C30). In another experiment with the same treatment, the oocytes were fertilized at the end of IVM and embryo development to the blastocyst stage was evaluated. After 8 hours of pre-IVM culture, meiosis progression analysis showed 58.9% of oocytes in GV1 configuration in C0, while C8 had only 13.9% (P<0.05). The GV1 rates in NPPC did not differ from any group (22.8%; P>0.05). On the other hand, C8 showed higher rates of GV3 in comparison with C0 (53.1% vs. 3.62%; p<0.05) and no differences compared to NPPC (38.7%; P<0.05). At the end of IVM culture, no differences between groups (C22 vs. NPPC vs. C30) were observed in nuclear maturation, however, higher rates of degenerated oocytes were observed in C30 in comparison with C22 (11.4% vs. 2.8%; P<0.05). The relative gene expression analysis in cumulus cells after 8h pre-IVM with NPPC showed an up-regulation in genes related to cumulus cells expansion (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 and VCAN), oocyte maturation (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) and embryo development (IGF1R, KRT8 and LUM). At the end of IVM culture, the cumulus cells expansion related gene, PTX3, the oocyte maturation genes, AREG and BDNF, and the embryo development gene, LUM, were up-regulated in NPPC in comparison with C30 (p<0.05). Regarding embryo development, the cleavage rates did not differ in experimental groups (mean around 73,22%). Besides, blastocyst rates did not differ between NPPC (P>0.05) and the other groups, but there was a difference between C22 and C30 (69.3 vs. 37.4%; P<0.05). There was no difference between the groups in total cell number (blastomeres) and apoptotic cells (P<0.05). In conclusion, the pre-IVM culture of bovine oocytes for 8h with 100nM NPPC did not block meiosis resumption, but meiosis progression occurred more slowly and prevented aging and degeneration of the oocytes. The prolonged time of oocyte culture (30h) in the absence of NPPC was detrimental to embryo development, but NPPC treatment (8h pre-IVM + 22h IVM = total duration of 30h) partially reversed this effect.