TORQUATO, José Pedro Pires. Estudo de mecanismos de regulação do sódio citoplasmático em cultivares de Vigna unguiculata (L.) WALP. submetidas à salinidade. 2014. 139 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-23T20:58:55Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_jpptorquato.pdf: 3572903 bytes, checksum: be55e53ccae4d0b5e66f15e6780ce1c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-23T21:20:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_jpptorquato.pdf: 3572903 bytes, checksum: be55e53ccae4d0b5e66f15e6780ce1c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T21:20:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_jpptorquato.pdf: 3572903 bytes, checksum: be55e53ccae4d0b5e66f15e6780ce1c8 (MD5) Previous issue date: 2014 / In the Northeast of Brazil, there are some salinized areas and others in the process of salinization, what drastically reduces plant productivity. Many studies have been done regarding the effect of saline stress on plant growth and development. However, there is little knowledge about the mechanisms of acclimatization to salinity in the different plant organs, particularly in the maintenance mechanisms of sodium ion homeostasis in Vigna unguiculata, involving: enzymes, channels and transporters. For this, two cultivars with different degrees of susceptibility to saline stress were used: Pitiúba (tolerant) and Setentão (sensitive). The objective of the present work was to understand the interrelationships between the H+-ATPases and the SOS1 transporter, as well as the interrelationships between the vacuolar NHX transporter and the vacuolar proton pumps and their roles on regulating the Na+ cytoplasmic concentration in Vigna unguiculata, in response to saline stress. For this, morphological parameters were evaluated: roots, stems and leaves length, root, stems and leaves dry mass, ratio Root/Aerial, and biochemical parameters: proline, malondialdehyde, Na+ and K+ ions and the ratio Na+/K+, at 5 different concentrations (0, 25, 50, 75 and 100 mM) of NaCl. Molecular parameters in the two cultivars Pitiúba and Setentão were also analyzed in plants with 10 days after sowing, submitted to NaCl (100 mM) for 120 hours. SOS1, H+-ATPase type P and type V, pyrophosphatases and NHX encoding genes were identified through searches in Vigna unguiculata databases. The gene expression was evaluated in plants with 10 days after sowing, submitted to 100 mM NaCl, at the times: 0, 6, 12, 24 and 48 hours after stress application, using PCR technique in real-time (qPCR). The entirely evaluation of the data allowed to establish the differences in the form of acclimatization to the saline stress between the two cultivars. The parameters such as visual aspects, dry mass, leaf area and Na+/K+ ratio gave support for Pitiúba to be classified as a salt tolerant cultivar in relation to the Setentão. The parameters, growth and percentage of water were not conclusive. The Pitiúba cultivar, presented a constitutive proline concentration in the leaves greater than the Setentão cultivar and being, therefore, better pre-acclimatized to tolerate saline stress. The highest lipid peroxidation in the leaves was observed in Pitiúba. The database searches revealed that V. unguiculata presents at least 1 SOS1 gene, 13 H+-ATPase type P genes, 7 NHX genes, 2 PPase genes and 1 V-ATPase subA gene. Of these genes, SOS1, H+-ATPase 06 and 48, NHX1, NHX2, PPase1 and V-ATPase subA were induced in response to saline stress in a differentiated way in relation to organ and cultivar analyzed. From these data it was possible to infer that the exclusion of Na+ in Pitiúba occurs mainly in the roots, while in the Setentão it occurs more intensely in the leaves. Vacuolar compartmentalization of Na+ is higher in the roots of both cultivars. However, while Pitiúba increased expression of NHX1, Setentão increased expression of NHX2. NHX induction was accompanied by the mRNA increase of PPase1 in both cultivars and V-ATPase in Pitiúba. In leaves, the SOS1 gene was most expressed in the Setentão, revealing a co-expression with two H+-ATPase genes (H+-ATPase 06 and 48), whereas NHX1 expression increased only in Pitiúba. In general, the data suggest that the cultivars of Vigna unguiculata (Pitiúba and Setentão) used different strategies to minimize the deleterious effects of saline stress. / No Nordeste brasileiro existem algumas áreas salinizadas e outras em processo de salinização, o que reduz drasticamente a produtividade das plantas. Muitos estudos tem sido feitos em relação ao efeito do estresse salino no crescimento e desenvolvimento das plantas. Contudo, pouco se sabe sobre os mecanismos de aclimatação à salinidade nos diferentes órgãos vegetais, particularmente nos mecanismos de manutenção da homeostase iônica do sódio em Vigna unguiculata, envolvendo: enzimas, canais e transportadores. Para tal, foram utilizados dois cultivares com diferentes graus de suscetibilidade ao estresse salino: Pitiúba (tolerante) e Setentão (sensível). O objetivo do presente trabalho foi compreender as inter-relações entre as H+-ATPases e o transportador SOS1, bem como, as inter-relações entre o transportador vacuolar NHX e as bombas de prótons vacuolares e seus papéis na regulação da concentração citoplasmática de Na+ em Vigna unguiculata, em resposta ao estresse salino. Para tal, foram avaliados parâmetros morfológicos: comprimento de raízes, caules e folhas, massa seca de raízes, caules e folhas, razão Raiz/Parte Aérea, e parâmetros bioquímicos: concentrações de prolina, malondialdeído, dos íons Na+ e K+ e a razão Na+/K+, em 5 diferentes concentrações (0, 25, 50, 75 e 100 mM) de NaCl. Também foram analisados parâmetros moleculares nos dois cultivares Pitiúba e Setentão em plantas com 10 dias após a semeadura, submetidas ao NaCl (100 mM) por 120 horas. Genes codificadores da SOS1, H+-ATPase tipo P e tipo V, pirofosfatases e NHX foram identificados através de buscas em bancos de dados de V. unguiculata. A expressão gênica foi avaliada em plantas com 10 dias após a semeadura, submetidas a NaCl 100 mM, nos tempos: 0, 6, 12, 24 e 48 horas após aplicação do estresse, através da técnica PCR em tempo real (qPCR). A avaliação conjunta dos dados possibilitou estabelecer as diferenças na forma de aclimatação ao estresse salino entre os dois cultivares. Os parâmetros tais como: aspectos visuais, massa seca, área foliar e razão Na+/K+ deram suporte para que Pitiúba sejá classificada como um cultivar mais tolerante ao estresse salino em relação a Setentão. Os parâmetros, crescimento e percentual de água não foram conclusivos. O cultivar Pitiúba, apresentou uma concentração constitutiva de prolina maior do que Setentão nas folhas estando, portanto, melhor pré-aclimatado para tolerância ao estresse salino. A maior peroxidação lipídica nas folhas foi observada em Pitiúba. As buscas em bancos de dados revelaram que V. unguiculata apresenta pelo menos 1 gene SOS1, 13 genes H+-ATPase tipo P, 7 genes NHX, 2 genes PPase e 1 gene V-ATPase subA. Desses genes, SOS1, H+-ATPase 06 e 48, NHX1, NHX2, PPase1 e V-ATPase subA foram induzidos em resposta ao estresse salino de maneira diferenciada em relação ao órgão e cultivar analisado. A partir desses dados foi possível inferir que a exclusão de Na+ em Pitiúba ocorre principalmente nas raízes, enquanto que em Setentão ocorre mais intensamente nas folhas. A compartimentalização vacuolar do Na+ é maior nas raízes de ambos os cultivares. Contudo, enquanto Pitiúba aumentou a expressão de NHX1, Setentão aumentou a expressão de NHX2. A indução de NHX foi acompanhada pelo aumento do mRNA da PPase1 em ambos os cultivares e da V-ATPase em Pitiúba. Em folhas, o gene SOS1 foi mais expresso em Setentão revelando uma co-expressão com dois genes da H+-ATPase (H+-ATPase 06 e 48), enquanto a expressão de NHX1 aumentou apenas em Pitiúba. Em geral, os dados sugerem que os cultivares de V. unguiculata (Pitiúba e Setentão) utilizaram diferentes estratégias para minimizar os efeitos deletérios do estresse salino.

SOBREIRA, Alana Cecília de Menezes. Estudo da expressão dos genes das bombas de prótons (V-ATPase e V-PPase) e dos contra-transportadores vacuolares (NHX) de Vigna unguiculata (L.) Walp submetidos a estresses abióticos.2009 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by JOANA BEZERRA (joanabib@yahoo.com.br) on 2012-11-09T21:07:31Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_acmsobreira.pdf: 1938746 bytes, checksum: 064fea08dd8578e2f6b67de140140d86 (MD5) / Approved for entry into archive by Érica Barros(ericabarros@ufc.br) on 2012-11-12T22:49:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_acmsobreira.pdf: 1938746 bytes, checksum: 064fea08dd8578e2f6b67de140140d86 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-12T22:49:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_acmsobreira.pdf: 1938746 bytes, checksum: 064fea08dd8578e2f6b67de140140d86 (MD5) / The acummulation of Na+ in the central vacuole represents an important mechanism for plants to cope with salt stress. The vacuolar content and the regulations of their volumes in vegetable cells depend on the activity of transporters and channels located in the tonoplast (vacuolar membrane). The vacuolar membrane possesses two different proton pumps (V-ATPase and V-PPase), aquoporine, and systems of primary and secondary transporters like the vacuolar Na+/H+ antiporter (NHX). The two transmembrane proton pumps work as systems of primary transport in vegetable cells and both enzymes generate a difference of proton electrochemical potential through the vacuolar membrane which can provide energy to antiport system, H+/substrate. The vacuolar Na+/H+ antiporter, uses the electrochemical gradient generated by the primary transporters to pump Na+ ions inward the vacuole. In the present work were first determined the Na+ and K+ content followed by the gene expression of the vacuolar proton pumps (VHA-A, VHA-E and HVP) and the vacuolar antiporters (NHX2 and NHX6) from seedlings of Vigna unguiculata subjected to salt and osmotic stress. The seedlings were grown on nutritive medium in the absence of NaCl and PEG (control condition), presence of NaCl 100 mM (salt stress) or in the presence of PEG 6000 200,67g.L-1 (osmotic stress). The ion Na+ content essay showed an increase in all plant tissues when submitted to salt stress, while the K+ ions decreased in the same condition. The gene expression of the vacuolar proton pumps and the Na+ antiporter from roots and leaves showed an increase in all studied conditions being more expressive to V-PPase, NHX2 and NHX6 suggesting a coordinated regulation of these genes. The results from leaves showed that VHA-A and VHA-E were increased, while the others genes tend to remain constant in the osmotic stress. These results suggest that salt and osmotic stress induced a differential regulation of all studied genes, being the vacuolar Na+ antiporters an important part on keep the cellular homeostasis when the plants were submitted to salt stress. / O acúmulo de Na+ no vacúolo central representa um importante mecanismo de defesa de plantas contra o estresse salino. A regulação dos volumes e conteúdos dos vacúolos de células vegetais depende da atividade de transportadores e canais localizados no tonoplasto (membrana vacuolar). A membrana vacuolar possui duas distintas bombas de prótons (V-ATPase e V-PPase), aquoporinas e vários sistemas de transportes ativos e/ou secundários, como os contra-transportadores Na+/H+ vacuolares. As duas bombas de prótons transmembranares funcionam como sistemas de transporte primário nas células vegetais e ambas as enzimas geram uma diferença de potencial eletroquímico de prótons através da membrana vacuolar. Os contra-transportadores vacuolares Na+/H+ utilizam o gradiente eletroquímico de prótons gerado pelos transportadores primários para transportar Na+ para dentro do vacúolo. No presente trabalho inicialmente foram determinados os conteúdos de íons Na+ e K+ em raízes, hipocótilos e folhas e em seguida a análise da expressão dos genes das bombas de prótons (VHA-A, VHA-E e HVP) e dos contra-transportadores vacuolares (NHX2 e NHX6) em plântulas de Vigna unguiculata (L.) Walp cv. Vita 5 submetidas a estresse salino e osmótico. As plântulas foram crescidas em meio nutritivo na ausência de NaCl e PEG (controle), na presença de 100 mM de NaCl (estresse salino) ou na presença de 200,67 g/L de PEG (estresse osmótico). O conteúdo de íons Na+ aumentou em todos os tecidos da planta quando submetidos ao estresse salino (NaCl 100 mM) enquanto que o conteúdo de íons K+ diminuiu na mesma condição. A expressão dos genes das bombas de prótons e dos contra-transportadores vacuolares de folhas e de raízes no estresse salino aumentou em todas as condições estudadas, porém o aumento foi mais expressivo para os genes da V-PPase, NHX2 e NHX6 sugerindo uma regulação paralela entre esses genes. Já no estresse osmótico, os resultados para as folhas mostraram que a expressão dos genes VHA-A e VHA-E aumentaram enquanto que os outros genes não sofreram mudanças significativas. Nossos resultados sugerem que o estresse salino e o estresse osmótico induziram uma regulação diferenciada em todos os genes sendo o contra-transportador Na+/H+ importante na homeostase celular quando as plantas foram submetidas ao estresse salino e osmótico.