Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The Keap1-Nrf2 pathway regulates a wide range of cytoprotective genes, and has been found to serve a protective and beneficial role in many body systems. There is limited information available, however, about its role in bone homeostasis. While Nrf2 activation has been suggested as an effective method of increasing bone mass and quality, there have been conflicting reports which associate Keap1 deficiency with detrimental phenotypes. As Keap1 deletion is a common method of Nrf2 activation, further study should address the impacts of various methods of regulating Nrf2 expression. Also, little research has been conducted on the specific pathways by which Nrf2 activation improves bone quality. In this study, the effects of alterations to Nrf2 activation levels were explored in two specific and varied scenarios. In the first experiment, moderate Nrf2 activation was achieved via partial deletion of its sequestering protein, Keap1, in an aging mouse model. The hypothesis tested here is that moderate Nrf2 activation improves bone quality by affecting bone metabolism and response to mechanical loading. The results of this first experiment suggest a subtle, sex-specific effect of moderate Nrf2 activation in aging mice which improves specific indices of bone quality to varying degrees, but does not affect loading-induced bone formation. It is likely that the overwhelming phenotypic impacts associated with aging or the systemic effects of global Keap1 deficiency may increase the difficulty in parsing out significant effects that can be attributed solely to Nrf2 activation. In the second experiment, a cell-specific knockout of Nrf2 in the osteocytes was achieved using a Cre/Lox breeding system. The hypothesis tested here is that osteocyte-specific deletion of Nrf2 impairs bone quality by affecting bone metabolism and response to mechanical loading. The results of this experiment suggest an important role of Nrf2 in osteocyte function which improves certain indices of bone quality, which impacts male and female bones in different 7 ways, but did not significantly impact loading-induced bone formation. Further studies should modify the method of Nrf2 activation in an effort to refine the animal model, allowing the effects of Nrf2 to be isolated from the potential systemic effects of Keap1 deletion. Future studies should also utilize other conditional knockout models to elucidate the effects of Nrf2 in other specific cell types.

Evolutionär konservierte, kleine offene Leserahmen (upstream open reading frames, uORFs) sind translational aktive Kontrollelemente, die bevorzugt in Boten-Ribonukleinsäuren von Schlüsselgenen zur Regulation von Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung vorkommen. In dieser Arbeit wurden Mäuse analysiert, die defizient für das uORF Initiationscodon des Transkriptionsfaktors CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBPbeta-Delta-uORF) sind. Proteinanalysen verschiedener Gewebe zeigten, dass C/EBPbeta-Delta-uORF Mäuse im Gegensatz zu Wildtyptieren nicht in der Lage sind, die kurze, auto-antagonistische C/EBPbeta LIP Isoform zu induzieren. Die verminderte LIP Expression verursachte eine gestörte Differenzierung knochenabbauender Osteoklasten und ging mit einer Zunahme von mineralisiertem Knochengewebe in C/EBPbeta-Delta-uORF Mäusen einher. Nach partieller Hepatektomie führte der Verlust der uORF-vermittelten Induktion von LIP in regenerierenden C/EBPbeta-Delta-uORF Lebern zu einer Überaktivierung C/EBPbeta-regulierter Akute Phase Gene. Im Vergleich zum Wildtyp wiesen Hepatozyten von C/EBPbeta-Delta-uORF Tieren einen verzögerten und abgeschwächten Wiedereintritt in die S-Phase des Zellzyklus auf. Genomweite Genexpressionsanalysen zeigten, dass die verminderte S-Phase Aktivität in regenerierenden C/EBPbeta-Delta-uORF Lebern mit einer persistierenden Repression von Zellzyklusgenen korrelierte, wobei insbesondere die verminderte Expression zahlreicher E2F-regulierter Gene auffällig wurde. Chromatinimmunpräzipitations- und Reportergenexperimente führten zur Entwicklung eines mechanistischen Modells, das eine isoformspezifische C/EBPbeta-Koregulation E2F-kontrollierter Zellzyklusgene vorschlägt. Die Analyse der C/EBPbeta-Delta-uORF Mäuse belegt erstmals die Funktionalität der uORF-gesteuerten translationalen Kontrolle im Säugetier und weist auf eine entscheidende Bedeutung dieses Kontrollmechanismus bei zahlreichen physiologischen und pathopysiologischen Prozessen hin. / Evolutionary conserved small upstream open reading frames (uORFs) are translational control elements predominantly prevalent in the 5'' mRNA regions of key regulatory genes of growth, proliferation, and differentiation. This thesis comprises the evaluation of mice deficient for the uORF initiation codon of the transcription factor CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBPbeta-Delta-uORF). Protein analysis of various tissues demonstrated that C/EBPbeta-Delta-uORF mice, in contrast to wildtype control animals (C/EBPbeta-WT), fail to induce translation of the truncated, auto-antagonistic C/EBPbeta LIP isoform. The reduced expression of LIP was associated with impaired differentiation of bone resorbing osteclasts and resulted in an increased bone volume of C/EBPbeta-Delta-uORF mice. After partial hepatectomy the loss of uORF-mediated LIP induction resulted in super activation of acute phase response genes in regenerating livers. Furthermore, C/EBPbeta-Delta-uORF hepatocytes showed a delayed and blunted re-entry into the cell cycle after partial hepatectomy as compared to C/EBPbeta-WT animals. Genome-wide transcript expression analyses revealed that the reduced S-phase activity in regenerating C/EBPbeta-Delta-uORF livers correlated with a persistent repression of cell cycle regulatory genes and showed a remarkable underrepresentation of genes regulated by the E2F family of transcription factors. Chromatinimmunoprecipitations and luciferase reporter gene assays allowed the development of a mechanistic model that suggests C/EBPbeta isoform-specific co-regulation of E2F-controled cell cycle genes. The analysis of C/EBPbeta-Delta-uORF mice validates the functionality of uORF-mediated translational control in vertebrates and suggests a comprehensive role of uORF regulation in physiology and the etiology of disease.

L’irradiation (IR) est utilisée dans le traitement de plusieurs cancers et désordres hématologiques, en particulier dans les protocoles de conditionnement précédents les transplantations de moelle osseuse. L’emploi de doses réduites d’IR semble favoriser le succès de la prise de greffe. Cette observation soulève un point de plus en plus discuté dans la littérature, soit l’importance de l’intégrité du microenvironnement pour la transplantation et le bon fonctionnement de l’hématopoïèse. L’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse in vitro. Ce mécanisme de défense cellulaire entraînant un arrêt de prolifération permanent est également observé in vivo dans différents systèmes, mais n’a pas encore été étudié dans le contexte de la niche hématopoïétique. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour objectif de déterminer si l’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse et si une telle induction altère les fonctions hématopoïétiques. Nos résultats ont permis de démontrer pour la première fois qu’une IR corporelle totale induit effectivement la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse. En outre, cette altération du microenvironnement affecte la lymphopoïèse B de façon Ink4a/Arf-dépendante (1er article). De plus, les modifications systémiques qui résultent de l’IR compromettent l’homéostasie osseuse en augmentant la résorption de l’os, sans toutefois diminuer la formation de celui-ci (2e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les effets de la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques. Par ailleurs, elles suggèrent que l’emploi de drogues et/ou de procédés n’induisant pas la sénescence des cellules stromales de l’os offrirait un meilleur pronostic à long terme pour les patients. / Ionizing radiation (IR) is used in the treatment of several cancers and hematological disorders, especially in conditioning regimens for bone marrow transplantation. Reduced doses of IR seem to favor the success of engraftment. This observation supports the growing evidences suggesting the importance of the microenvironment integrity for the success of bone marrow transplantation and hematopoiesis maintenance. IR induces senescence of bone marrow stromal cells in vitro. This defense mechanism which leads to a permanent cell growth arrest is also observed in different organs in vivo but has not yet been studied in the hematopoietic niche. The objectives of this doctoral thesis are to determine whether IR induces senescence of bone marrow stromal cells and whether such induction alters hematopoietic functions. Our results have demonstrated for the first time that total body IR actually induces the senescence of bone marrow stromal cells. Furthermore, this alteration of the microenvironment affects B lymphopoiesis in an Ink4a/Arf-dependent manner (paper #1). In addition, the systemic changes associated with IR compromise bone homeostasis by increasing bone resorption without reducing bone formation (paper #2). All together, these data enhance our knowledge related to the effects of IR-induced senescent bone marrow stromal cells on hematopoietic function. Moreover, our results suggest that using drugs and/or procedures inducing no senescent bone marrow stromal cells would provide a better long-term prognosis for patients.

L’irradiation (IR) est utilisée dans le traitement de plusieurs cancers et désordres hématologiques, en particulier dans les protocoles de conditionnement précédents les transplantations de moelle osseuse. L’emploi de doses réduites d’IR semble favoriser le succès de la prise de greffe. Cette observation soulève un point de plus en plus discuté dans la littérature, soit l’importance de l’intégrité du microenvironnement pour la transplantation et le bon fonctionnement de l’hématopoïèse. L’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse in vitro. Ce mécanisme de défense cellulaire entraînant un arrêt de prolifération permanent est également observé in vivo dans différents systèmes, mais n’a pas encore été étudié dans le contexte de la niche hématopoïétique. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour objectif de déterminer si l’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse et si une telle induction altère les fonctions hématopoïétiques. Nos résultats ont permis de démontrer pour la première fois qu’une IR corporelle totale induit effectivement la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse. En outre, cette altération du microenvironnement affecte la lymphopoïèse B de façon Ink4a/Arf-dépendante (1er article). De plus, les modifications systémiques qui résultent de l’IR compromettent l’homéostasie osseuse en augmentant la résorption de l’os, sans toutefois diminuer la formation de celui-ci (2e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les effets de la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques. Par ailleurs, elles suggèrent que l’emploi de drogues et/ou de procédés n’induisant pas la sénescence des cellules stromales de l’os offrirait un meilleur pronostic à long terme pour les patients. / Ionizing radiation (IR) is used in the treatment of several cancers and hematological disorders, especially in conditioning regimens for bone marrow transplantation. Reduced doses of IR seem to favor the success of engraftment. This observation supports the growing evidences suggesting the importance of the microenvironment integrity for the success of bone marrow transplantation and hematopoiesis maintenance. IR induces senescence of bone marrow stromal cells in vitro. This defense mechanism which leads to a permanent cell growth arrest is also observed in different organs in vivo but has not yet been studied in the hematopoietic niche. The objectives of this doctoral thesis are to determine whether IR induces senescence of bone marrow stromal cells and whether such induction alters hematopoietic functions. Our results have demonstrated for the first time that total body IR actually induces the senescence of bone marrow stromal cells. Furthermore, this alteration of the microenvironment affects B lymphopoiesis in an Ink4a/Arf-dependent manner (paper #1). In addition, the systemic changes associated with IR compromise bone homeostasis by increasing bone resorption without reducing bone formation (paper #2). All together, these data enhance our knowledge related to the effects of IR-induced senescent bone marrow stromal cells on hematopoietic function. Moreover, our results suggest that using drugs and/or procedures inducing no senescent bone marrow stromal cells would provide a better long-term prognosis for patients.