Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: Acidentes ofídicos são considerados um problema de saúde pública global, dada sua alta ocorrência de mortes, onde alguns casos resultam em sequelas irreparáveis, deixando o indivíduo desabilitado por toda a vida. Somente no Brasil, em média 20 mil mortes ao ano são registradas. Desta forma, alguns pesquisadores têm buscado estudar a estrutura-função de componentes dos venenos de serpentes peçonhentas à fim de desenvolver alternativas terapêuticas para esse problema de grande interesse médico. Um dos componentes que tem recebido atenção nas últimas décadas é a BthTX-I, uma proteína PLA2s-homóloga não catalítica, devido seu efeitos farmacológico notadamente miotóxico. Embora diversas técnicas tenham sido empregadas na compreensão do mecanismo de ação dessas proteínas, o conhecimento nessa área permanece controverso, tornando-se necessário a continuidade de estudos. O estudo estrutural e computacional de proteínas constitui uma alternativa viável para identificar as várias conformações de uma dada proteína, bem como seu comportamento dinâmico. Sendo assim, o presente trabalho buscou aplicar métodos computacionais, como simulação de MD, análise de Modos Normais (NM) e Dinâmica Molecular excitada por Modos Normais (MDeNM) à BthTX-I em pH ácido ou básico e nativa ou em complexo com o α-tocoferol – molécula tida como ativadora alostérica – na descrição do seu espaço conformacional, buscando compreender os aspectos estruturais do seu mecanismo de ação. Além disso, foram empregadas té... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ophidian accidents constitute a global public health problem due its high mortality, with some cases leading to permanent sequels. In Brazil, around 20 thousand deaths are registered. Therefore, researchers have been studying the snake venom composition in order to develop therapeutic alternatives to this medical problem. Some components from snake venom are highlighted in the past decades, as BthTX-I, a non-catalytic PLA2s-homologous protein, due its many pharmacological effects, notably myotoxic. Although many techniques have been employed to better understand the molecular mechanism of action for these proteins, this knowledge remains controversial, emphasizing the need to progress this field. The structural and computational study of proteins is a valuable tool to access the various conformations of a given protein, as well its dynamical behavior. Thus, the present work applied computational methods as MD, Normal Modes (NM) analysis and Molecular Dynamics with excited Normal Modes (MDeNM) to BthTX-I in acidic or basic pH and unbound or bound to α-tocopherol – a molecule identified as an allosteric activator – in order to describe the conformational space of this protein and determine the structural aspects of its mechanism of action. Further, biophysical experiments as Dynamic Light Scattering (DLS) were employed in order to comprehend the oligomeric form of BthTX-I with or without α-tocopherol. MD simulations showed that dimeric form of BthTX-I is stable when in neutral/... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A bothropstoxina I (BthTX-I) é uma miotoxina isolada do veneno da serpente brasileira Bothrops jararacussu, a qual é um membro da família das fosfolipases A2, mas não apresentam atividade catalítica devido á substituição D49K. A proteína for fornecida pelo Prof. Dr. J. R. Giglio e Profa. Dra. A. C. O. Cintra do Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e usada em experimentos de cristalização, os quais foram realizados usando a técnica de difusão de vapor \"hanging drop\" a 18°C. A BthTX-I cristalizou em tampão HEPES 0.1 M, pH variando entre 7.0 e 7.6. O agente precipitante foi o (NH4)SO4 em concentrações que variaram de 57% a 62% de saturação. A coleta de dados foi inicialmente feita utilizando o difratômetro automático R-AXIS IIC da Rigaku Co. do Laboratório de Cristalografia de proteínas do IFSC-USP. Subseqüentemente foi realizado uma segunda coleta de dados no SERC Daresbury Laboratory na Inglaterra, usando radiação síncrotron. A BthTX-I cristalizou no grupo espacial P3121 com os seguintes parâmetros de rede: a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. O processamento de dados foi realizado com o programa MOSFLM, conduzindo a um Rmerge=6.3% e completeza de 99.6% a uma resolução de 2.1 ANGSTROM. A estrutura foi resolvida por Substituição Molecular, utilizando o programa AMoRe, onde foi utilizada como modelo inicial a estrutura da miotoxina da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus e refinada usando o programa XPLOR que conduziu a um fator Rfinal= 18.7% e Rfree=27.4%. A unidade assimétrica contém dois monômeros, os quais podem ser escolhidos de forma a apresentar interações similares aquelas descritas para a miotoxina II da Bothrops asper. A superfície de interface é entretanto, surpreendentemente pequena quando comparada com outras estruturas diméricas e a complementaridade é menor do que o valor esperado. Um modelo teórico para a ligação do fosfolipídeo na BthTX-I sugere que nenhuma interação direta entre a ligação ester sn-2 e a K49 deve ser esperada de forma a explicar a falta de atividade catalítica. Foi visto também, que é possível se reproduzir um dendrograma baseado na seqüência de aminoácidos, pelo uso de estruturas tridimensionais para os membros da família das PLA2 / Bothropstoxin- I (BthTX-I) is a myotoxin isolated from the Brazilian snake Bothrops jararacussu which is a member of the phospholipase A2 but presents no catalytic activity due to a D49K substitution. Protein was provided from the Departamento de Medecina de Ribeirão Preto by Prof. Dr. J. R. Giglio and Profa. Dra. A. C. O. Cintra and used in crystallization experiments which were performed using the vapor diffusion technique in hanging drops at 18°C. The BthTX-I crystallized in 0.1 M HEPES, pH ranging from 7.0 to 7.6. The precipitant was (NH4)SO4 in concentrations ranging from 57% to 62%. The data collection was initially performed using the automatic difractometer R-AXIS IIC from the Rigaku Co. at the Laboratório de Cristalografia of IFSC-USP. Subsequently a second data set was collected at SERC Daresbury Laboratory in England using synchrotron radiation. BthTX-I crystallizes in space group P3121 with a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. Processing of the data was performed with the MOSFLM program yielding an Rmerge= 6.3% and completeness of 99.6% at 2.1 ANGSTROM. resolution. The structure was solved by Molecular Replacement using the package AMoRe with the Agkistrodon piscivorus piscivorus enzyme as search model and refined using the refinement program X-PLOR to a Rfinal= 18.7% and Rfree=27.4%. The asymmetric unit contains two BthTX-I monomers, which can be chosen such that they present similar interactions to those described for the homologous myotoxin II from Bothrops asper. The interface is, however, surprisingly small when compared to other dimeric structures and is less complementary than expected. A theorical model for phospholipid building to BthTX-I suggests that no direct interactions between the sn-2 ester bond and K49 would be expected, thus explaining the lack of catalytic activity. It is shown that it is possible to reproduce a dendrogram based on amino acid sequences and by the use of three dimensional structures for members of the PLA2 family

A bothropstoxina I (BthTX-I) é uma miotoxina isolada do veneno da serpente brasileira Bothrops jararacussu, a qual é um membro da família das fosfolipases A2, mas não apresentam atividade catalítica devido á substituição D49K. A proteína for fornecida pelo Prof. Dr. J. R. Giglio e Profa. Dra. A. C. O. Cintra do Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e usada em experimentos de cristalização, os quais foram realizados usando a técnica de difusão de vapor \"hanging drop\" a 18°C. A BthTX-I cristalizou em tampão HEPES 0.1 M, pH variando entre 7.0 e 7.6. O agente precipitante foi o (NH4)SO4 em concentrações que variaram de 57% a 62% de saturação. A coleta de dados foi inicialmente feita utilizando o difratômetro automático R-AXIS IIC da Rigaku Co. do Laboratório de Cristalografia de proteínas do IFSC-USP. Subseqüentemente foi realizado uma segunda coleta de dados no SERC Daresbury Laboratory na Inglaterra, usando radiação síncrotron. A BthTX-I cristalizou no grupo espacial P3121 com os seguintes parâmetros de rede: a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. O processamento de dados foi realizado com o programa MOSFLM, conduzindo a um Rmerge=6.3% e completeza de 99.6% a uma resolução de 2.1 ANGSTROM. A estrutura foi resolvida por Substituição Molecular, utilizando o programa AMoRe, onde foi utilizada como modelo inicial a estrutura da miotoxina da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus e refinada usando o programa XPLOR que conduziu a um fator Rfinal= 18.7% e Rfree=27.4%. A unidade assimétrica contém dois monômeros, os quais podem ser escolhidos de forma a apresentar interações similares aquelas descritas para a miotoxina II da Bothrops asper. A superfície de interface é entretanto, surpreendentemente pequena quando comparada com outras estruturas diméricas e a complementaridade é menor do que o valor esperado. Um modelo teórico para a ligação do fosfolipídeo na BthTX-I sugere que nenhuma interação direta entre a ligação ester sn-2 e a K49 deve ser esperada de forma a explicar a falta de atividade catalítica. Foi visto também, que é possível se reproduzir um dendrograma baseado na seqüência de aminoácidos, pelo uso de estruturas tridimensionais para os membros da família das PLA2 / Bothropstoxin- I (BthTX-I) is a myotoxin isolated from the Brazilian snake Bothrops jararacussu which is a member of the phospholipase A2 but presents no catalytic activity due to a D49K substitution. Protein was provided from the Departamento de Medecina de Ribeirão Preto by Prof. Dr. J. R. Giglio and Profa. Dra. A. C. O. Cintra and used in crystallization experiments which were performed using the vapor diffusion technique in hanging drops at 18°C. The BthTX-I crystallized in 0.1 M HEPES, pH ranging from 7.0 to 7.6. The precipitant was (NH4)SO4 in concentrations ranging from 57% to 62%. The data collection was initially performed using the automatic difractometer R-AXIS IIC from the Rigaku Co. at the Laboratório de Cristalografia of IFSC-USP. Subsequently a second data set was collected at SERC Daresbury Laboratory in England using synchrotron radiation. BthTX-I crystallizes in space group P3121 with a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. Processing of the data was performed with the MOSFLM program yielding an Rmerge= 6.3% and completeness of 99.6% at 2.1 ANGSTROM. resolution. The structure was solved by Molecular Replacement using the package AMoRe with the Agkistrodon piscivorus piscivorus enzyme as search model and refined using the refinement program X-PLOR to a Rfinal= 18.7% and Rfree=27.4%. The asymmetric unit contains two BthTX-I monomers, which can be chosen such that they present similar interactions to those described for the homologous myotoxin II from Bothrops asper. The interface is, however, surprisingly small when compared to other dimeric structures and is less complementary than expected. A theorical model for phospholipid building to BthTX-I suggests that no direct interactions between the sn-2 ester bond and K49 would be expected, thus explaining the lack of catalytic activity. It is shown that it is possible to reproduce a dendrogram based on amino acid sequences and by the use of three dimensional structures for members of the PLA2 family

A lesão tecidual é um dos efeitos locais descritos nos envenenamentos botrópicos. Toxinas isoladas, como: a jararagina (JAR) e bothropstoxina-I (BthTX-I), obtidas dos venenos de B. jararaca e B. jararacussu, respectivamente, induzem intensa resposta inflamatória e lesão tecidual, porém apresentam diferentes mecanismos de ação. Como descrito, a resolução da lesão tecidual envolve a interação entre mecanismos de reparo do tecido e o sistema imune. Neste contexto, a resposta inflamatória é iniciada por meio da detecção de sinais de dano tecidual agudo devido a distúrbios da homeostasia resultantes ou não de agentes microbianos (DAMPs) e/ou por reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Uma vez induzida, a resposta inflamatória está envolvida tanto no processo de lesão visando a eliminação do agente indutor, assim como no reparo tecidual. Diversos receptores estão envolvidos no reconhecimento de PAMPs e DAMPs como os transmembrânicos representados pelos do tipo Toll, e os citosólicos que compreendem complexos proteicos que formam os inflamassomas. Estes complexos multiproteicos citosólicos podem participar da indução da resposta imune inata por ativação de caspase-1 com consequente liberação de IL-1&#946, que pode resultar em morte celular. Considerando o exposto, o objetivo deste trabalho foi estudar a participação de inflamassoma na resposta inflamatória no tecido muscular de injeção das toxinas, a capacidade da BthTX-I e JAR de induzir a ativação de inflamassoma em macrófagos e os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. O estudo da migração de neutrófilos e macrófagos para o músculo gastrocnémio de animais C57BL/6 ou deficientes em caspase 1/11 (Caspase 1/11-/-) ou NLRP3 (NLRP3-/-) injetados com JAR e BthTX-I permitiu verificar que o inflamassoma NLRP3 participa da migração destas células inflamatórias para local de injeção das toxinas. A análise da produção de IL-1&#946 nas culturas de macrófagos peritoneais incubados com JAR e BthTX-I (6 e 24h) mostrou que somente a BthTX-I foi capaz de induzir a secreção desta citocina por um mecanismo dependente de caspase 1/11, ASC e NLRP3 e independente de IPAF. A incubação de macrófagos humanos com as toxinas permitiu verificar que ambas as toxinas induziram a secreção de IL-1&#946 dependente de caspase 1, porém esta produção foi significativamente maior em resposta à BthTX-I. Nos macrófagos peritoneais de camundongos observamos a relação entre a secreção de IL-1&#946 e morte celular em ensaio de incorporação do brometo de etídio nas culturas incubadas com BthTX-I por 24h e não com a JAR. Visto que ambas as toxinas injetadas via intramuscular induzem resposta inflamatória intensa, foi analisado o efeito delas sobre a viabilidade e secreção de IL-6 e MCP-1 em miotubos C2C12. Os resultados mostraram que somente a BthTX-I induz efeito miotóxico sobre esta linhagem celular. Além disso, pudemos verificar que BthTX-I induz altos níveis de IL-6 e MCP-1 quando comparados aos obtidos com a JAR. Visto que a BthTX-I induziu alta secreção de MCP-1 pelos miotubos C2C12, em experimento in vivo realizado em camundongos C57BL/6 ou deficientes em CCR2 (CCR2-/-) pode ser observada a dependência da interação entre MCP-1 e o CCR2 para a migração dos macrófagos em resposta a injeção de BthTX-I. Em culturas de miotubos incubados com as toxinas pôde ser observada alta liberação de ATP induzida pela BthTX-I in vitro. Em outros experimentos foi estudada a capacidade do sobrenadante de miotubos incubados com BthTX-I de induzir a secreção de IL-1&#946 pelos macrófagos in vitro. Os resultados mostraram a produção de IL-1&#946 nessas culturas de macrófagos, assim como a produção desta citocina em macrófagos incubados com BthTX-I juntamente com ATP. A hidrólise do ATP no sobrenadante da cultura de C2C12 estimulada com BthTX-I aboliu a secreção de IL-1 pelos macrófagos in vitro. Além disso, foi observada a inibição da produção de IL-1&#946 nas culturas de macrófagos primados com LPS e incubados com a BthTX-I em condições de altas concentrações de KCl sugerindo papel relevante do efluxo de K+ na produção de IL-1&#946 induzida pela BthTX-I. Em conjunto, os resultados acrescentam novas informações sobre o potencial inflamatório da JAR e BthTX-I, quanto à ação destas toxinas em macrófagos, ativação de inflamassoma e células musculares. / Tissue damage is one of the local effects described in bothropic envenomations. Isolated toxins, such as jararhagin (JAR) and bothropstoxin-I (BthTX-I), obtained from B. jararaca and B. jararacussu venoms, respectively, induce intense inflammatory response and tissue injury, however mediated by distinct mechanisms. As described, resolution of tissue injury involves the interaction between mechanisms of tissue repair and the immune system. In this context, the inflammatory response is initiated by detecting of signs of acute tissue damage due to disorders of homeostasis resulting from distinct agents (DAMPs) and / or recognition of pathogens associated molecular patterns (PAMPs). Once induced, the inflammatory response is involved both in the injury process for the elimination of the pathogenic agent, as well as in the tissue repair. Several receptors are involved in the recognition of PAMPs and DAMPs as the transmembrane receptors such as the Toll-like, and the cytosolic ones that comprise protein complexes - inflammasomes. These cytosolic multiprotein complexes may participate in the induction of the innate immune response by activation of caspase-1 with consequent release of IL-1&#946, which may result in cell death. Thus, we aimed to study the role of inflammasome on the inflammatory response in muscular tissue of JAR and BthTX-I injection, the ability of BthTX-I and JAR to induce the activation of inflammasome in macrophages and the molecular mechanisms involved in this process. The analyses of the neutrophils and macrophages migration in gastrocnemius muscle of C57BL/6 or Caspase 1/11 (Caspase 1/11-/-) or NLRP3 (NLRP3-/-) deficient mice injected with JAR e BthTX-I allow us to verify that NLRP3 inflammasome participates in these cells migration for the local of the toxins injection. The detection of IL-1&#946 on supernatants from macrophage cultures incubated with JAR or BthTX-I (6 e 24h) showed that only BthTX-I was able to induce this cytokine secretion by a mechanism dependent of caspase 1/11, ASC and NLRP3 and independent of IPAF. The incubation of human macrophages with the toxins demonstrated that both toxins induced IL-1&#946 secretion, however this production was significantly higher in response to BthTX-I. On murine macrophage cultures it was verified the correlation between the IL-1&#946 secretion and the cell death in the incorporation of ethidium bromide assay of cultures incubated with BthTX-I during 24h and not with JAR. Since that both toxins injected in the muscle induced intense inflammation, it was analyzed the effect of both toxins on the viability and the secretions of IL-6 and MCP-1 by C2C12 myotubes. The results showed that only BthTX-I induces a myotoxic effect on this cell line. Furthermore, it was verified that BthTX-I induces high secretion of IL-6 and MCP-1 when compared with those induced by JAR. Considering that BthTX-I induces high levels of MCP-1, in in vivo experiment using C57BL/6 and CCR2 deficient (CCR2-/-) mice it was observed that the interaction of MCP-1 and CCR2 is essential for the macrophage recruitment for the toxin injection. High release of ATP was detected in C2C12 myotube cultures incubated with BthTX-I but not with JAR. In another experiments it was studied the ability of the supernatants of C2C12 myotubes incubated with BthTX-I to induce the IL-1&#946 secretion by peritoneal macrophages in vitro. The results showed the IL-1&#946 secretion in the macrophage cultures as well as the cytokne secretion in macrophages incubated with BthTX-I and ATP independent of the priming with LPS. The hydrolysis of the ATP on the supernatants of C2C12 incubated with the BthTX-I abolished the IL-1&#946 production by macrophages in vitro. In addition, it was not observed IL-1&#946 production by macrophages primed with LPS and incubated with BthTX-I in the presence of high concentration of KCl suggesting a relevant role of K&#43 efflux for this cytokine secretion in response to BthTX-I. Taken together, the results show new findings about the inflammatory effect of JAR and BthTX-I, concerning about the action of these toxins on macrophages, inflammasome activation and muscle cell.