Hohenheim, Univ., Diss., 2008.

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta enero 2018 / El mercado de la uva de mesa en Chile es una importante fuente de ingreso económico, siendo nuestro país catalogado como líder exportador de esta fruta. Sin embargo, el principal problema de índole fitopatológico que afecta la uva de mesa son las infecciones producidas por el hongo Botrytis cinerea, que se caracterizan por generar pudriciones o atizonamientos de las partes florales, brotes y bayas, causando importantes pérdidas económicas. Su control incluye un manejo integrado del cultivo, además de un tratamiento químico preventivo mediante el uso de fungicidas. No obstante, aunque se realicen todas estas prácticas el control total no resulta satisfactorio, debido al aumento de cepas fúngicas resistentes a la acción de los fungicidas. Frente a esta problemática, se han estudiado otras formas de control dentro de las que se incluye la utilización de microorganismos capaces de impedir la infección de B. cinerea sobre cultivos susceptibles, entre los cuales podemos destacar el biocontrolador comercial Serenade, que posee como ingrediente activo la cepa bacteriana Bacillus subtilis QST 713. El objetivo principal de esta tesis fue caracterizar cepas bacterianas silvestres con actividad antifúngica y determinar la capacidad protectora de las bacterias contra el ataque del hongo sobre el vegetal. Se seleccionaron cepas bacterianas silvestres que al ser caracterizadas a nivel filogenético, bioquímico y ultraestructural, fueron clasificadas en el género Bacillus y en las especies B. subtilis y B. pumilus. Luego de evaluar su capacidad antifúngica mediante bioensayos in vitro e in vivo, se seleccionaron las cepas B. subtilis NB y B. pumilus G2, las que fueron capaces de proteger al tejido vegetal de forma más eficiente que el producto comercial Serenade. Posteriormente, se realizó extracción orgánica de las moléculas secretadas por estas bacterias, determinándose preliminarmente su naturaleza y estructura química, utilizando las técnicas TLC, IR, HPLC, LC-MS/MS y GC-MS. Finalmente, con el uso de estas metodologías se pudo demostrar que B. subtilis NB y B. pumilus G2 secretan enzimas que degradan la pared celular fúngica, dipéptidos cíclicos ciclo-(Pro-Leu) y ciclo- (Pro-Phe) y lipopéptidos cíclicos (iturinas, fengicinas y surfactinas). Estas bacterias poseen un gran potencial para controlar infecciones producidas por B. cinerea en las variedades de uva de mesa afectadas por este hongo. Sin embargo, se requieren estudios posteriores que permitan confirmar y ampliar los resultados de esta tesis, antes que se pueda desarrollar un producto comercial / Chile is a leading exporter of table grapes, and this market is an important source of income for the country. However, infection with the fungus Botrytis cinerea, characterized by the rotting of grape flowers, buds, and berries, causes important economic losses. Fungus control includes integrated crop management and preventive chemical fungicide treatments. Despite these practices, overall control is unsatisfactory as fungal strains become increasingly resistant to fungicides. Alternative control methods have been studied, including the use of microorganisms capable of preventing B. cinerea infection on susceptible cultivars. Among these is the commercial biocontrol Serenade, which contains the Bacillus subtilis QST 713 bacterial strain as the main active ingredient. The main objectives of this thesis were to characterize wild bacterial strains with antifungal activity and determine the protective ability of these strains for table grape vines challenged by B. cinerea. Wild bacterial strains were characterized at the phylogenetic, biochemical, and ultrastructural levels and classified in the genus Bacillus and species B. subtilis and B. pumilus. After evaluating antifungal capacities through in vitro and in vivo bioassays, the B. subtilis NB and B. pumilus G2 strains were selected. These strains were able to more efficiently protect plant tissue than the commercial product Serenade. Subsequently, the molecules secreted by these bacteria were organically extracted, and their chemical structures and natures were determined using the techniques TLC, IR, HPLC, LC-MS/MS, and GC-MS. These methodologies revealed that B. subtilis NB and B. pumilus G2 secreted enzymes that degraded the fungal cell wall, the cyclic dipeptides cyclo-(Pro-Leu) and cyclo-(Pro-Phe), and cyclic lipopeptides (iturins, fengycins, and surfactins). These bacteria show promising potential in controlling B. cinerea infections among affected Chilean table grape species. However, further studies are required to expand upon the present results before a product can be developed for commercial use / Proyecto DGT-2014AC

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Botrytis cinerea Pers., [forme imparfaite du Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel.] est le champignon ascomycète responsable de la pourriture grise (moisissure grise, pourriture de la grappe) chez des centaines de plantes hôtes au niveau mondial. Il est considéré comme un agent pathogène à haut risque de développement de résistance aux fongicides et s’attaque aux fruits, aux légumes mais, aussi aux plantes ornementales. Afin de lutter contre les maladies causées par B. cinerea, plusieurs familles de fongicides de synthèse sont homologuées au Canada. Un des fongicides récemment introduit et fréquemment utilisé est le boscalide. L’utilisation du boscalide combiné à la pression de sélection a mené au développement de la résistance dans les populations de B. cinerea. La génétique des mécanismes de résistance étant de plus en plus documentée, plusieurs mutations responsables de la résistance au boscalide ont été identifiées sur le gène de la sous-unité B de la succinate déshydrogénase (SdhB). Des substitutions d’acides aminés provoqués par des polymorphismes nucléotidiques (SNP) sont associées à cette résistance. Les mutations les plus fréquentes retrouvées chez les individus résistants sont la substitution d’une histidine par une tyrosine (H272Y), par une arginine (H272R), ou par une leucine (H272L) au codon 272 de la sous-unité SdhB. De plus, sur le codon 225, une proline est substituée par une phénylalanine (P225F) et sur le codon 230, une asparagine est substituée par une isoleucine (N230I). Il existe des outils moléculaires pour détecter les mutations H272Y, H272R, H272L, P225F et N230I, mais ils ne permettent pas d’analyses quantitatives et leur précision est limitée. Il devient donc important de développer une méthode efficace permettant de détecter et quantifier simultanément les mutations liées à la résistance au boscalide. L’objectif du travail était donc de développer un nouvel outil de détection et de quantification des mutations reliées à la résistance au boscalide chez B.cinerea. À l’aide d’une banque d’individus de B.cinerea déjà caractérisés pour la présence des cinq mutations (P225F, N230I, H272L, H272Y et H272R) et caractérisés pour la résistance au boscalide, un nouvel essai de pyroséquençage a été mis au point sur plateforme PyroMark Q24 (Qiagen). L’utilisation du PyroMark Q24 comme outil de détection et de quantification de cinq mutations reliées à la résistance au boscalide a permis de repousser les limites des techniques existantes. La technique est basée sur le séquençage par synthèse générant des données quantitatives avec une précision de 5%. Les résultats ont démontré une relation linéaire (R[indice supérieur 2]=0,99) entre les ratios (0% à 100%) de spores d'individus résistants et sensibles connus et prédit avec le PyroMark Q24. Le pyroséquençage est une technologie prometteuse puisqu’elle favorisera l’étude populationnelle en offrant la possibilité de combiner les échantillons et permettra ainsi d'analyser un grand nombre d’échantillons plus rapidement, avec une meilleure précision que les technologies de détection actuelles. La disponibilité d’informations quantitatives sur la proportion de chacune des mutations présentes dans une population permettra l’amélioration de la compréhension et de la gestion face à la résistance aux fongicides au sein de la communauté agricole.

La pourriture grise est une maladie qui affecte de nombreuses cultures dont la vigne. Elle est provoquée par un complexe de deux espèces fongiques, l’espèce majoritaire Botrytis cinerea et l’espèce minoritaire Botrytis pseudocinerea. Les deux espèces se distinguent par leur sensibilité à certains fongicides notamment au fenhexamid, inhibiteur de la 3-cétoréductase des stérols. Ce fongicide a un spectre d’action restreint aux espèces phylogénétiquement proches du genre Botrytis (Sclerotinia et Monilinia fructicola). Son utilisation a conduit à la sélection de souches résistantes parmi lesquelles on distingue trois phénotypes : le phénotype HydR1 correspond à l’espèce B. pseudocinerea naturellement résistante ; les phénotypes HydR2 et HydR3 correspondent à l’espèceB. cinerea ayant acquis la résistance suite à l’introduction du fongicide. L’objet de cette thèse est l’étude des phénotypes HydR1 et HydR2 présents à de faibles, voire très faibles fréquences dans des populations de pourriture grise.Chez B. pseudocinerea (HydR1), nous avons identifié une monooxygénase à cytochrome P450 nommée Cyp684 responsable de la résistance au fenhexamid. Le gène cyp684 montre des polymorphismes (structure et séquence nucléotidique) entre les espèces ainsi qu’une induction par le fenhexamid chez B. pseudocinerea. La comparaison de la séquence du gène cyp684 chez plusieurs espèces de Botrytis et de leurs niveaux de résistance au fenhexamid indique que les acides aminés polymorphes de la protéine Cyp684 sont responsables de la résistance au fenhexamid chez B. pseudocinerea. Le rôle connu des monooxygénase à cytochrome P450 dans la métabolisation des xénobiotiques et la synergie entre le fenhexamid et des inhibiteurs de monooxygénases à P450 suggèrent que Cyp684 soit impliqué dans la métabolisation du fenhexamid. Concernant le phénotypeHydR2 de B. cinerea, le mécanisme de résistance reste à identifier. Les souches HydR2 se distinguent par leur phénotype rose dû à un métabolite secondaire nommé bikavérine. Le génotypage réalisé sur les descendantes d’un croisement entre une souche HydR2 et une souche sensible a mis en évidence un lien physique entre le gène ou l’allèle hydR2 et le cluster bikavérine. Afin d’identifier la niche écologique et de comprendre l'épidémiologie de B. pseudocinerea, nous avons développé une méthode de qPCR espèce spécifique, nommée « B. pseudocinerea allele specific PCR » (BpASP). Cet outil permettra de détecter et de quantifier l’espèce B.pseudocinerea dans les populations de Botrytis, selon la saison, la région géographique et les plantes hôtes. / Grey mold is a fungal disease affecting many crops including grapevine. It is generated by a species complex of two fungal species, the major one, Botrytis cinerea, and the minor species, Botrytis pseudocinerea. Both species differ by their sensitivity to several fungicides, in particular to fenhexamid, a potent inhibitor of sterol 3-ketoreductase. This fungicide has a narrow spectrum of activity limited to species closely related to the genus Botrytis (e.g., Sclerotinia and Monilinia fructicola). Fenhexamid applications have led to the selection of resistant strains with three different phenotypes: the HydR1 phenotype corresponds to the naturally resistant species B. pseudocinerea; HydR2 and HydR3 phenotypes correspond to B. cinerea strains that acquired resistance after the introduction of fenhexamid. The topic of this thesis is the study of the phenotypes HydR1 andHydR2 present at low or even very low frequencies in grey mold populations. We identified a cytochrome P450 monooxygenase named Cyp684 responsible for resistance to fenhexamid in B.pseudocinerea (HydR1). The cyp684 gene differs between both species in its gene structure, nucleotide sequence (polymorphisms) and expression. The comparison of cyp684 sequences among different Botrytis species and their resistance levels to fenhexamid indicate the polymorphic amino acids of the Cyp684 protein to be responsible for fenhexamid resistance in B. pseudocinerea. The known involvement of cytochrome P450s in xenobiotic metabolisation and synergy between fenhexamid and P450-inhibitors suggest that Cyp684 could be involved in fenhexamid metabolisation. Concerning the B. cinerea HydR2 phenotype, the resistance mechanism remains to be identified. HydR2 strains have a specific purple pigmentation due to the secondary metabolite bikaverin. Genotyping of progeny derived from a cross between a HydR2 and a sensitive strain revealed aphysical link between the hydR2 gene or allele and the gene cluster involved in bikaverin biosynthesis. In order to identify the ecological niche of B. pseudocinerea and its epidemiological behavior we developed a species-specific qPCR method named “B. pseudocinerea allele specific PCR” (BpASP). This tool will allow detecting and quantifying the species B. pseudocinerea in natural Botrytis populations, collected according to season, geographic origin or plant hosts.

Reproduction de : Thèse doctorat : Biologie et physiologie végétales : Reims : 2008. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p.101-124.

Reproduction de : Thèse doctorat : Biologie et physiologie végétales : Reims : 2007. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. f. 123-154.

Red sorrel is a perennial weed in wild blueberry fields that decreases yield. Multiple experiments were conducted to evaluate its impact on blueberry pollination, Botrytis blight incidence, and berry yield. Kerb applications did not significantly impact blueberry stem or floral bud formation. Removal of red sorrel with Kerb increased blueberry yield at both sites. However a double application had no difference than one application. Blueberry and red sorrel flowering overlapped and red sorrel pollen grains were found on blueberry flowers in both years at all sites. Red sorrel pollen grains increased the incidence of germinating spores in Petri dishes and this relationship was adequately modeled with a three parameter, exponential rise to a maximum. Red sorrel pollen significantly increased disease incidence on immature blueberry flowers. Honey bees foraged from blueberry and red sorrel flowers, but there was no evidence to suggest that they favored red sorrel flowers over blueberry flowers.

Thesis (Ph. D.)--Oregon State University, 2009. / Printout. Includes bibliographical references (leaves 115-135). Also available on the World Wide Web.

University, Diss., 2003--Bonn.