La microflore des raisins est importante d'un point de vue technologique car elle conditionne en partie la qualité du vin. Or, la diversité des flores fongiques présentes sur baies de raisin ainsi que leur potentiel de contamination du produit final ne sont pas encore pleinement connus. Dans ce cadre, la caractérisation des flores fongiques cultivables présentes sur baies de raisin a été réalisée par PCR ITS-RFLP. 41 espèces de moisissures différentes sur les 43 étudiées appartenant à 11 genres différents ont été caractérisées de façon fiable. Seules les espèces Penicillium thomii et Penicillium glabrum ont présenté le même profil. Ainsi 96.3% des souches étudiées ont été caractérisées avec au maximum 4 enzymes de restriction et 41.5% des souches ont pu l'être avec seulement 2 enzymes de restriction. Ces résultats ont permis d'enrichir les bases de données, moyennement pourvues en séquences ITS caractéristiques de genres ou d'espèces de moisissures présentes sur baies de raisin. De plus, une étude exhaustive des moisissures présentes sur baies de raisin en Bourgogne a permis, par PCR ITS-RFLP, d'identifier 199 souches au niveau de l'espèce et ce quelque soit le genre. Penicillium spinulosum est l'espèce majoritaire isolée pour le millésime 2008 en Bourgogne. Parallèlement, la quantification de Botrytis cinerea, choisi comme micro-organisme modèle, a été réalisée par qPCR. La technique qPCR décrite dans ce travail présente (i) une bonne sensibilté avec une limite de détection de 6.4 pg d'ADN correspondant à 540 spores, (ii) l'originalité de travailler en échantillons naturellement contaminés et la fiabilité d'utiliser un standard interne. L'évaluation de l'efficacité de différentes stratégies de traitements anti-Botrytis a confirmé l'importance de la prophylaxie (effeuillage) dans la lutte contre Botrytis cinerea.

The fungus Botrytis cinerea is an opportunistic pathogen on a wide variety of crops, causing disease known as grey mould through infections via wounds or dead plant parts. Synthetic fungicides for controlling this disease are fast becoming ineffective due to the development of resistance. This, coupled with consumers world wide becomng increasingly conscious of potential environment and health problems associated with the build up of toxic chemicals, (particularly in food products), have resulted in pressure to reduce the use of chemical pesticide volumes as well as its residues. An emerging alternative to random synthesis is the study and exploitation of naturally occurring products with fungicidal properties. There have been reports on the uses of synthetic fungicides for the control of plant pathogenic fungi. When utilized in two-way mixtures, such fungicides may maintain or enhance the level of control of a pathogen at reduced rates for both components utilized in combinations, or alone at normal rates. For this study it was hypothesize that the addition of plant extracts may enhance the antifungal efficacy of the synthetic strobilurin fungicide, kresoxim-methyl against Botrytis cinerea.

Universiẗat, Diss., 2003--Bonn. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2003.

Thesis (MScAgr)--Stellenbosch University, 1962. / ENGLISH ABSTRACT: no abstract available / AFRIKAANSE OPSOMMING: geen opsomming

CAPES / O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito dos eliciadores acibenzolar-S-metil (ASM) e da proteína harpina em pré e pós-colheita na indução de resistência a Botrytis cinerea, causador do mofo-cinzento em morangos, e sobre outros agentes infestantes. Quatro experimentos foram conduzidos, dois deles em pré-colheita, e outros dois em pós-colheita. No primeiro experimento (1) em pré-colheita, conduzido em casa-de-vegetação, testou-se dois produtos à base de harpina (ProActTM 2,5 g L-1 com 1% do i.a., e Messenger® 0,75 g L-1 com 3% do i.a) e um à base de ASM (Bion® 500WG 0,5 g L-1 com 50% do i.a.), mais a testemunha (água destilada). Após 24 horas da segunda pulverização dos tratamentos foi realizada inoculação do fungo B. cinerea (105 conídios mL-1). Neste experimento foram avaliadas: produtividade, incidência e severidade da mancha-de-dendrofoma, flores abortadas, incidência de ácaros e incidência de frutos com mofo-cinzento, além do teor de proteínas totais, atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (FAL), fenóis totais e taxa de assimilação de CO2. No segundo experimento (2) em pré-colheita, foram testadas doses de harpina (ProActTM 100, 200 e 300 mg L-1) e de ASM (Bion® 500 WG 100, 200, 300 e 400 mg L-1), mais a testemunha (água destilada). Após 24 horas da primeira aplicação dos tratamentos foi realizada inoculação de B. cinerea (104 conídios mL-1). Neste experimento foram realizadas avaliações para os parâmetros de produtividade, incidência de podridões e taxa de assimilação de CO2. Além disso, após a quarta aplicação dos tratamentos, foram coletados frutos para um dos experimentos (4) em pós-colheita. Foram realizados mais dois experimentos em pós-colheita, e o terceiro experimento (3) foi conduzido em parcelas subdivididas, com e sem ferimentos nos frutos. Os frutos foram pulverizados com ASM (Actigar® 50WG 5,0 mg do i.a. mL-1), dois produtos comerciais contendo proteína harpina (80 mg do i.a. L-1 - ProActTM e Messenger®) e uma testemunha (água destilada). Para o quarto experimento (4), frutos tratados em pré-colheita com 100, 200 e 300 mg L-1 ProActTM (1% de harpina), e 100, 200, 300 e 400 mg L-1 de Bion® (50% de ASM), mais a testemunha (água destilada). No experimento 3, os tratamentos foram aplicados por meio de pulverização e 12 horas após efetuou-se a inoculação do fungo B. cinerea (105 conídios mL-1). Após 48 horas da inoculação os frutos foram avaliados quanto à área lesionada e firmeza de polpa. Foi coletada amostra do material vegetal para análise do teor de proteínas totais e da atividade da FAL. Os frutos do experimento 4 foram colhidos do experimento 2, depois da quarta aplicação dos tratamentos. Após a desinfecção em HCl (1%) os frutos foram inoculados com o fungo B. cinerea (105 conídios mL-1) e passadas 96 horas foram avaliadas a área lesionada e a firmeza da polpa. Nos experimentos em pré-colheita foi observada indução de resistência à B. cinerea pelos eliciadores, inclusive com efeito de doses. No experimento 1, verificou-se maior atividade da FAL e maior acúmulo de fenóis totais, sendo estes parâmetros relacionados à redução da porcentagem de frutos podres e a menor incidência e severidade da mancha-de-dendrofoma. Em pós-colheita, no experimento 3, houve redução de área lesionada por B. cinera mediante aplicação dos eliciadores. A atividade da fenilalanina amônia-liase aumentou em relação à testemunha e foi relacionada ao maior controle do mofo-cinzento, como também, à maior firmeza de polpa. No experimento 4, também houve a redução da área lesionada, bem como o aumento da firmeza de polpa com o aumento das doses de ambos os produtos. As doses 300 e 9 400 mg L-1 de ProActTM e Bion®, respectivamente, apresentaram os menores valores de área lesionada e a dosagem de 200 mg L-1 de ambos os produtos apresentou maior firmeza de polpa. / The objective of this work was to evaluate the effects of elicitors acibenzolar-S-metil (ASM) and harpin protein in pre and post harvest in the induction of resistance against Botrytis cinerea, responsible to the gray-mold in strawberries, and about other infestent agents. Four experiments had been led, two of them in pre harvest, and other two in post harvest. The first experiment (1) in pre harvest, was carried out in a greenhouse. It was tested two products from harpin protein (ProActTM 2,5 g L-1 with 1% of i.a, and Messenger® 0,75 g L-1 with 3% of i.a) and one from ASM (0,5 Bion® 500WG g L-1 with 50% of i.a), more the control (distilled water). 24 hours after the second spraying of the treatments was carried through inoculation of B. cinerea (105 conidia mL-1). To this experiment we had also been evaluated: productivity, incidence and severity of the one leaf blight fungus (Dendrophoma obscurans), percentage of aborted flowers, incidence of mites and percentage of fruits with the gray-mold, beyond the content of total proteins, activity of the phenylalanine ammonia-lyase enzyme (PAL), total phenols and the CO2 assimilation rate. In the second experiment (2) in pre harvest, doses of harpin (ProActTM 100, 200 and 300 mg L-1) and of ASM had been tested (Bion® 500 WG 100, 200, 300 and 400 mg L-1), more the control (distilled water). 24 hours after the first application of the treatments inoculation of B. cinerea (104 conidia mL-1) was carried through. In this experiment evaluations for the productivity parameters, percentage of putrid fruits and the CO2 assimilation rate had been carried through. Besides that, after the fourth application of the treatments, had been collected fruits for one of the experiments (4) in post harvest. Two experiments had been led more, in post harvest, the third experiment (3) was led in subdivided parts, with and without wounds in the fruits. The fruits had been sprayed with acibenzolar-Smetil (Actigar® 50WG 5.0 mg of i.a. mL-1), two commercial products having harpin protein (80 mg of i.a. L-1 - ProActTM e Messenger®) and one control (distilled water). The fruits of experiment 4 had been harvested of experiment 2, after the fourth application of the treatments. To the fourth experiment (4), fruits in pre harvest with 100, 200 and 300 mg L-1 ProActTM (1% of harpin), and 100, 200, 300 and 400 mg L-1 of Bion® (50% of ASM), more the control (distilled water), were evaluated in post harvest. In experiment 3, the treatments had been applied by means of spraying and 12 hours after the B. cinerea fungus was inoculated (105 conidia mL-1). After 48 hours of the inoculation the fruits had been evaluated as for the injured area and pulp firmness. Sample of the vegetal material was collected for analysis of the total proteins content and the activity of the PAL. After the disinfection in HCl (1%) the fruits had been inoculated with B. cinerea fungus (105 conidia mL-1) and passed 96 hours had been evaluated the injured area and the firmness of the pulp. In the experiments in pre harvest the induction of resistance against B. cinerea was observed by the use of elicitors, including with effect of doses. In experiment 1, it was verified bigger activity of the PAL and bigger accumulation of total phenols, being these parameters related to the reduction of the 11 percentage of rotten fruits and the smaller incidence and severity of the one leaf blight. In post harvest, in the experiment 3, there was reduction of injured area by B. cinerea through the application of the elicitors. Plants sprayed with the elicitors increased the activity of phenylalanine ammonia-lyase and it was related to the biggest control of the gray mold, as well as, the biggest pulp firmness. In experiment 4, there was also had the reduction of the injured area, as well as the increase of the pulp firmness with the increase of the doses of both the products. The doses of 300 and 400 mg L-1 of ProActTM and Bion®, respectively, had presented the smaller values of injured area, and the dosage of 200 mg L-1 of both the products presented greater pulp firmness.

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Memoria para optar al título profesional de: Ingeniero Agrónomo / Botrytis cinerea Pers., hongo fitopatógeno de más de doscientas especies vegetales, es el causante de la “Pudrición Gris” que es la enfermedad más importante que afecta a la uva de mesa en Chile. El control de esta enfermedad, se basa principalmente en el uso de fungicidas botryticidas. Sin embargo, año a año, se incrementan las poblaciones resistentes a estos productos logrando infectar las estructuras florales, para luego permanecer en estado latente hasta la madurez de la baya, desarrollando, finalmente, pudriciones durante el periodo de pre y poscosecha. Con objeto de llevar a cabo estudios epidemiológicos en uva de mesa, se marcaron nueve aislados de Botrytis cinerea (Wild-type-WT), de los cuales tres eran resistentes a fenhexamid (HydR3+, CE 50 9,64 µg/ml) y dos sensibles (HydS, CE 50 0,09 µg/ml), siendo uno de estos últimos del tipo multidroga MDR1; y otros dos eran resistentes a iprodione (Ip+, CE 50 5,48 µg/ml) y dos sensibles a esta molécula (Ip-, CE 50 0,71 µg/ml). Mediante la estandarización del protocolo para la transformación genética con la bacteria Rhizobium radiobacter (=Agrobacterium tumefaciens) cepa GV3101 con el vector pCAMgfp se logró la transformación de todos los aislados analizados. Los aislados transformados (mutantes) expresaron el gen de la proteína fluorescente verde (Green Fluorescent Protein, GFP-sgfp) y el de resistencia a higromicina (hph) incluso tras pruebas de estabilidad mitótica. Una vez transformados se evaluó el comportamiento morfofisiológico de los aislados mutantes. Para ello, se analizaron los aspectos de conidiogénesis, desarrollo miceliar, formación de esclerocios, nivel de agresividad/virulencia, expresión de la fluorescencia y mantención de las características de resistencia y/o sensibilidad a las moléculas fungicidas evaluadas. El análisis microscópico de la fluorescencia reveló la expresión constitutiva de la proteína y mediante PCR, con partidores específicos, se determinó la presencia del gen sgfp en todos los aislados analizados. Se mantuvo la correspondencia genotípica en todos los aislados y hubo escasas variaciones en los aspectos morfológicos y fenotípicos de los mutantes respecto sus WT. Finalmente, ocho aislados mantuvieron las mismas características morfofisiológicas que sus WT por lo que podrían ser empleados en estudios de interacción hongo-hospedero así como epidemiológicos, fundamentalmente en relación al estado de latencia. / Botrytis cinerea Pers., plant pathogen fungus over two hundred plant species, is the causal agent of the "gray mold", which is the most important disease that affects the table grapes in Chile. The control of this disease on grapevine, is mainly based on the use of fungicides botryticidas. Nevertheless, year after year, the resistant populations increase to this products, this will achieve the infection of floral structures, in order to remain in latent status until grape berry ripening, finally developing rots during pre and postharvest. To accomplish epidemiological studies in grapevines, were marked nine isolates of Botrytis cinerea (Wild type-WT), three of them were fenhexamid resistant (HydR3+, EC 50 9,64 µg/ml), two sensitive (HydS, EC 50 0,09 µg/ml), being one of those who was multidrug type MDR1; others two were resistant to iprodione (Ip+, EC 50 5,48 µg/ml) and two sensitive (Ip- EC 50 0,71 µg/ml). By standardizing of the protocol for genetic transformation with the bacterium Rhizobium radiobacter (=Agrobacterium tumefaciens) strain GV3101 with vector pCAMgfp the transformation of all isolates tested were achieved. The transformed isolates (mutants) expressed the gene for green fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, GFP-sgfp) and hygromycin resistance (hph) even after mitotic stability test. Once transformed the morphophysiological behavior of mutant isolates were evaluated. For this, the aspects of conidiogenesis, mycelial growth, the formation of sclerotia, aggressiveness level/virulence, expression and maintenance characteristics of the fluorescence, of resistance and/or sensitivity to molecules fungicides tested were evaluated. Microscopic analysis of fluorescence revealed the constitutive expression of the protein and by PCR with specific primers, the presence of the sgfp gene in all isolates tested were determined. Genotypic correspondence in all isolates were maintained and there were few variations in morphological and phenotypic aspects of the mutants compared with their WT. Finally, eight isolates maintained the same morphophysiological characteristics, that their WT, consequently they could be used in studies of fungus-host interaction as well as epidemiological, mainly in relation to latency.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-24T22:34:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 287236.pdf: 1097040 bytes, checksum: d0907009139c43ab77550c139616bdc8 (MD5) / Perdas substanciais de producao sao registradas em pos-colheita de macieira causadas principalmente pelos fungos Penicillium expansum e Botrytis cinerea. Os metodos usuais de controle envolvem a imersao de frutos em solucoes fungicidas e o uso da frigorificacao. Na busca por metodos alternativos, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da quitosana e do vapor de acidos de cadeia curta, in vivo e in vitro, sobre os fungos P. expansum e B. cinerea. Nos ensaios in vivo, os frutos de macieira foram inoculados com uma suspensao de esporos de P. expansum ou B. cinerea antes (efeito curativo) ou apos (efeito preventivo) a imersao em suspensao de quitosana ou nas suas formulacoes. Os frutos tratados foram armazenados, no escuro, a 25+1C, sob alta umidade relativa, e avaliados periodicamente quanto a incidencia e a severidade das podridoes. Nos ensaios in vitro, avaliou-se o efeito de quitosana sobre a formacao de colonias de P. expansum, o crescimento micelial e a esporulacao de B. cinerea, bem como a germinacao de esporos e o comprimento do tubo germinativo de ambos. Os resultados indicaram que a imersao dos frutos de macieira em suspensoes de quitosana a 0,25 e 0,5% reduziu a severidade da podridao de Penicillium em ate 54 e 74% em tratamentos preventivos, respectivamente. Nos tratamentos curativos, adjuvantes foram necessarios para se obter bons niveis de reducao da severidade das podridoes: a adicao de glicerol a 3,0% na suspensao de quitosana a 0,5% reduziu em 47,6% a severidade da podridao de Penicillium; a formulacao contendo quitosana a 0,25%, glicerol a 0,75%, estearato de magnesio a 0,1% e Tween 80 a 0,1% foi eficiente em reduzir as podridoes de P. expansum e B. cinerea em 26,5 e 44,6%, respectivamente. Por outro lado, a adicao de cloreto de calcio ou carbonato de potassio as suspensoes de quitosana nao aumentou a eficiencia de controle das suspensoes contra as podridoes. In vitro, a quitosana a 50 e 100 Êg.mL-1 inibiu significativamente a germinacao de esporos e a elongacao do tubo germinativo de P. expansum e B. cinerea, respectivamente. Comparando-se diferentes quitosanas, a de baixo peso molecular (Qbpm) e a comercial (Qcom) reduziram o crescimento micelial e estimularam a esporulacao de B. cinerea em meio BDA. A atividade de peroxidases em tecidos de maca inoculados com P. expansum foi maior do que nos tecidos nao inoculados. No entanto, nao houve efeito da quitosana sobre a atividade das enzimas peroxidases e polifenoloxidases em frutos tratados. Na segunda etapa do trabalho, testou-se a fumigacao dos frutos de macieira cv. Fuji com os acidos formico, acetico e propanoico, bem como etanol e hexanal. Para tanto, depositou-se uma suspensao de esporos de P. expansum na epiderme intacta dos frutos. Apos a secagem, os frutos foram fumigados por 30 min e, posteriormente, feridos no local da deposicao dos esporos. Avaliou-se a severidade e a incidencia da podridao. A fumigacao dos frutos de macieira cv. Fuji, contendo esporos de P. expansum em sua epiderme, com os acidos formico, acetico e propanoico foi eficiente em reduzir a severidade e a incidencia da podridao de Penicillium. Os acidos ainda inibiram totalmente a germinacao do fungo em laminas escavadas, quando utilizados a 12 ÊL.L-1 de ar, mostrando potencial para reduzir a concentracao inicial de inoculo que se encontra tanto na epiderme dos frutos como nas embalagens de acondicionamento. Dessa forma, os resultados do trabalho indicaram que as reducoes na severidade das podridoes pela imersao dos frutos de macieira em quitosana e suas formulacoes devem-se principalmente a atividade antibiotica da quitosana. O uso da fumigacao de frutos com compostos volateis que apresentam elevada atividade antimicrobiana pode ser uma tecnica complementar empregada em pos-colheita, visando reduzir as elevadas concentracoes superficiais de inoculo.

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias con Mención Sanidad Vegetal / Botrytis cinerea Pers. es uno de los patógenos fúngicos más interesante por sus características particulares, puede vivir como patógeno; pero también saprofíticamente, se puede encontrar en todo el mundo y puede infectar un gran número de especies de plantas y sus diferentes partes. B. cinerea pertenece al phylum Ascomycota, clase Leotiomycetes, orden Helotiales (Hibbett et al., 2007). B. cinerea es el nombre de la fase asexual y en su fase teleomórfica corresponde a Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel (Groves and Loveland, 1953), presenta un micelio con hifas septadas, con poros simples, su crecimiento hifal es en ramificaciones con abundante producción de conidias heterocarióticas hialinas a levemente coloreadas formadas sobre conidióforos (Agrios, 1997). En un comienzo el micelio es hialino y luego se torna gris, debido a ello es que se ha denominado a la enfermedad con el nombre de “pudrición gris” (Harvey, 1955).

Tesis para optar al título profesional de Ingeniera Agrónoma y al grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias con mención Sanidad Vegetal / La base del control de Botrytis cinerea radica en el uso de fungicidas aplicados en los periodos críticos de infección (floración y envero a precosecha). Las estrobilurinas (QoIs) por tener efecto sobre Oídio y también sobre Botrytis son alternativas de control en pre y post-floración. Recientemente, en ciertas regiones de Europa, Norteamérica y Chile se ha detectado el inicio de pérdida de sensibilidad de botrytis a QoIs. La resistencia a este grupo de fungicidas en hongos fitopatógenos estaría asociada a tres tipos de mutaciones en el citocromo b, siendo la principal la mutación G143A (reemplazo de Glicina por Alanina en el codón 143). El objetivo del presente estudio fue determinar la posible relación entre pérdida de sensibilidad a QoIs, comportamiento del patógeno y presencia de algunas de las 3 mutaciones asociadas. Con este propósito 20 aislados de B. cinerea recuperados desde vid y seleccionados según antecedentes previos de sensibilidad a azoxystrobin, fueron caracterizados genéticamente, mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) alelo-específico, para detectar la presencia de las mutaciones asociadas a resistencia a QoIs y mediante PCR-duplex para detectar la presencia de los transposones Boty y Flipper. La caracterización fenotípica consideró los siguientes parámetros: aspecto miceliar, esporulación, capacidad formadora de esclerocios (medio Agar- Malta (AM) a 20ºC), crecimiento miceliar (medio AM a 15, 20 y 25ºC), y virulencia sobre bayas cv. Thompson Seedless, con y sin herida a 0 y 20ºC.