Memoria para optar al título profesional de: Ingeniero Agrónomo / Botrytis cinerea Pers., hongo fitopatógeno de más de doscientas especies vegetales, es el causante de la “Pudrición Gris” que es la enfermedad más importante que afecta a la uva de mesa en Chile. El control de esta enfermedad, se basa principalmente en el uso de fungicidas botryticidas. Sin embargo, año a año, se incrementan las poblaciones resistentes a estos productos logrando infectar las estructuras florales, para luego permanecer en estado latente hasta la madurez de la baya, desarrollando, finalmente, pudriciones durante el periodo de pre y poscosecha. Con objeto de llevar a cabo estudios epidemiológicos en uva de mesa, se marcaron nueve aislados de Botrytis cinerea (Wild-type-WT), de los cuales tres eran resistentes a fenhexamid (HydR3+, CE 50 9,64 µg/ml) y dos sensibles (HydS, CE 50 0,09 µg/ml), siendo uno de estos últimos del tipo multidroga MDR1; y otros dos eran resistentes a iprodione (Ip+, CE 50 5,48 µg/ml) y dos sensibles a esta molécula (Ip-, CE 50 0,71 µg/ml). Mediante la estandarización del protocolo para la transformación genética con la bacteria Rhizobium radiobacter (=Agrobacterium tumefaciens) cepa GV3101 con el vector pCAMgfp se logró la transformación de todos los aislados analizados. Los aislados transformados (mutantes) expresaron el gen de la proteína fluorescente verde (Green Fluorescent Protein, GFP-sgfp) y el de resistencia a higromicina (hph) incluso tras pruebas de estabilidad mitótica. Una vez transformados se evaluó el comportamiento morfofisiológico de los aislados mutantes. Para ello, se analizaron los aspectos de conidiogénesis, desarrollo miceliar, formación de esclerocios, nivel de agresividad/virulencia, expresión de la fluorescencia y mantención de las características de resistencia y/o sensibilidad a las moléculas fungicidas evaluadas. El análisis microscópico de la fluorescencia reveló la expresión constitutiva de la proteína y mediante PCR, con partidores específicos, se determinó la presencia del gen sgfp en todos los aislados analizados. Se mantuvo la correspondencia genotípica en todos los aislados y hubo escasas variaciones en los aspectos morfológicos y fenotípicos de los mutantes respecto sus WT. Finalmente, ocho aislados mantuvieron las mismas características morfofisiológicas que sus WT por lo que podrían ser empleados en estudios de interacción hongo-hospedero así como epidemiológicos, fundamentalmente en relación al estado de latencia. / Botrytis cinerea Pers., plant pathogen fungus over two hundred plant species, is the causal agent of the "gray mold", which is the most important disease that affects the table grapes in Chile. The control of this disease on grapevine, is mainly based on the use of fungicides botryticidas. Nevertheless, year after year, the resistant populations increase to this products, this will achieve the infection of floral structures, in order to remain in latent status until grape berry ripening, finally developing rots during pre and postharvest. To accomplish epidemiological studies in grapevines, were marked nine isolates of Botrytis cinerea (Wild type-WT), three of them were fenhexamid resistant (HydR3+, EC 50 9,64 µg/ml), two sensitive (HydS, EC 50 0,09 µg/ml), being one of those who was multidrug type MDR1; others two were resistant to iprodione (Ip+, EC 50 5,48 µg/ml) and two sensitive (Ip- EC 50 0,71 µg/ml). By standardizing of the protocol for genetic transformation with the bacterium Rhizobium radiobacter (=Agrobacterium tumefaciens) strain GV3101 with vector pCAMgfp the transformation of all isolates tested were achieved. The transformed isolates (mutants) expressed the gene for green fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, GFP-sgfp) and hygromycin resistance (hph) even after mitotic stability test. Once transformed the morphophysiological behavior of mutant isolates were evaluated. For this, the aspects of conidiogenesis, mycelial growth, the formation of sclerotia, aggressiveness level/virulence, expression and maintenance characteristics of the fluorescence, of resistance and/or sensitivity to molecules fungicides tested were evaluated. Microscopic analysis of fluorescence revealed the constitutive expression of the protein and by PCR with specific primers, the presence of the sgfp gene in all isolates tested were determined. Genotypic correspondence in all isolates were maintained and there were few variations in morphological and phenotypic aspects of the mutants compared with their WT. Finally, eight isolates maintained the same morphophysiological characteristics, that their WT, consequently they could be used in studies of fungus-host interaction as well as epidemiological, mainly in relation to latency.

Tesis para optar al título profesional de Ingeniera Agrónoma y al grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias con mención Sanidad Vegetal / La base del control de Botrytis cinerea radica en el uso de fungicidas aplicados en los periodos críticos de infección (floración y envero a precosecha). Las estrobilurinas (QoIs) por tener efecto sobre Oídio y también sobre Botrytis son alternativas de control en pre y post-floración. Recientemente, en ciertas regiones de Europa, Norteamérica y Chile se ha detectado el inicio de pérdida de sensibilidad de botrytis a QoIs. La resistencia a este grupo de fungicidas en hongos fitopatógenos estaría asociada a tres tipos de mutaciones en el citocromo b, siendo la principal la mutación G143A (reemplazo de Glicina por Alanina en el codón 143). El objetivo del presente estudio fue determinar la posible relación entre pérdida de sensibilidad a QoIs, comportamiento del patógeno y presencia de algunas de las 3 mutaciones asociadas. Con este propósito 20 aislados de B. cinerea recuperados desde vid y seleccionados según antecedentes previos de sensibilidad a azoxystrobin, fueron caracterizados genéticamente, mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) alelo-específico, para detectar la presencia de las mutaciones asociadas a resistencia a QoIs y mediante PCR-duplex para detectar la presencia de los transposones Boty y Flipper. La caracterización fenotípica consideró los siguientes parámetros: aspecto miceliar, esporulación, capacidad formadora de esclerocios (medio Agar- Malta (AM) a 20ºC), crecimiento miceliar (medio AM a 15, 20 y 25ºC), y virulencia sobre bayas cv. Thompson Seedless, con y sin herida a 0 y 20ºC.

Memoria para optar al título profesional de: Ingeniero Agrónomo Mención: Sanidad Vegetal / En el presente estudio, se evaluó la efectividad de distintos fungicidas en el control de Botrytis cinerea, aplicados antes y con posterioridad a un periodo de infección en uva de mesa cv. Thompson seedless. Para ello se realizaron ensayos durante la temporada 2006 – 2007, en época de floración y pre cosecha en dos parronales de vid, ubicados en la región de Valparaíso y región Metropolitana, donde los racimos de uva fueron asperjados con suspensiones conidiales de B. cinerea. El ensayo evaluó 9 fungicidas, en dos épocas de aplicación. En floración se utilizó: boscalid + pyraclostrobin, tebuconazole, iprodione, pyrimethanil, kresoxim-methyl, cyprodinil + fludioxonil, fenexamid, testigo inoculado y un testigo absoluto y en pre cosecha se usó: boscalid + pyraclostrobin, citrex (11% p/p) + caolín, iprodione, iprodione + azufre, cyprodinil + fludioxonil, fenhexamid, fenhexamid + azufre, un testigo inoculado y un testigo absoluto. Para ambas épocas de aplicación se consideraron 5 periodos de aplicación. Floración: 24 horas antes de la inoculación, 1, 24, 36 y 48 horas después de la inoculación. Pre cosecha: 24 horas antes de la inoculación, 1, 12, 24 y 36 horas después de la inoculación. La fruta fue almacenada en frigorífico comercial y todos los tratamientos fueron evaluados en postcosecha. En época de Floración los fungicidas cyprodinil + fludioxonil (Switch 62,5 WP), kresoxim-methyl (Stroby SC), iprodione (Rovral 4 Flo), pyrimethanil (Scala 40 SC) y tebuconazole (Horizon 25% WP) fueron los que mejor controlaron la pudrición gris respecto al testigo inoculado, no existiendo diferencias significativas entre ellos. En cuanto al periodo de aplicación no existieron diferencias significativas para ninguno de los tratamientos después de un almacenamiento a 0°C. Los fungicidas aplicados en pre cosecha que mejor controlaron la enfermedad después de ser almacenada a 0°C fueron cyprodinil + fludioxonil (Switch 62,5 WG), fenhexamid (Teldor 50 WP), fenhexamid + azufre (Teldor Dust-s) e iprodione (Rovral 4 Flo) para ambos campos. Los periodos de aplicación fueron irrelevantes en este ensayo, para ambas épocas de aplicación, ya que no existieron diferencias significativas en los porcentajes de inhibición en los tratamientos. En cuanto a la inoculación con Botrytis cinerea esta no fue efectiva en ninguna época de aplicación. / The efficiency of different fungicides in the control of gray mold of grapes, applied before or after a simulated infection period, was evaluated on Thompson Seedlees grapes. The trials were conducted in the 2006 – 2007 season, in two commercial table grape vineyards located in Valparaiso and Metropolitan regions, where the grapes were sprayed with a conidial suspension of Botrytis cinerea. The study evaluated nine fungicides applied at bloom or before harvest: In bloom the fungicides boscalid + pyraclostrobin, tebuconazole, iprodione, pyrimethanil, kresoxim-methyl, cyprodinil + fludioxonil, fenexamid, were used and compared with an inoculated control and absolute control treatments; Before harvest the fungicides boscalid + pyraclostrobin, citrex (11% w/w) + kaolin, iprodione, iprodione + sulfur, cyprodinil + fludioxonil, fenhexamid, fenhexamid + sulfur were compared with an inoculated control and an absolute control. At both phenological stages, five fungicide application times were tested. At flowering, the fungicides were sprayed 24 hours before inoculation and 1, 24, 36 and 48 hours after inoculation. Pre harvest fungicide applications were made 24 hours before inoculation and 1, 12, 24 and 36 hours after inoculation. The fruit was harvested and stored in commercial cold storage facilities and all treatments were evaluated in postharvest. At bloom the fungicides cyprodinil + fludioxonil (Switch 62.5 WP), Kresoxim-methyl (Stroby SC), iprodione (Rovral 4 Flo), pyrimethanil (Scala 40 SC) and tebuconazole (Horizon 25% WP), reduced postharvest gray rot compared to the control treatments, without differences between them. The time of application did not affect the development of gray rot after cold storage. Fungicides sprayed at pre harvest with the highest efficacy were cyprodinil + fludioxonil (Switch 62.5 WG), fenhexamid (Teldor 50 WP), fenhexamid + sulfur (Teldor Dust) and iprodione (Rovral 4 Flo) in both vineyards. Application times were irrelevant in this trial, The inoculation with a conidial suspension of Botrytis cinerea was not effective at any time of application.

Memoria para optar al título profesional de: Ingeniera Agrónoma / Uno de los factores que tiene mayor incidencia en la condición de la fruta son las enfermedades de poscosecha, conocidas comúnmente como “pudriciones”. Para el caso de manzanas las más frecuentes son las causadas por Penicillium expansum y Botrytis cinerea. Las aplicaciones de fungicidas sintéticos en poscosecha son una de las estrategias más utilizadas para su control; sin embargo, su uso continuado y prolongado ha generado una disminución de su efecto protector. Tiabendazol ha sido utilizado de manera prolongada como fungicida en el control de dichas enfermedades, pero su uso ha sido limitado por el desarrollo de cepas fitopatógenas resistentes. En el año 2004 fludioxonil fue registrado en Estados Unidos de Norte América para tratamientos de poscosecha en manzanas, siendo altamente efectivo en el control de los patógenos que causan dichas pudriciones incluyendo cepas resistentes a tiabendazol. También se han propuesto otras alternativas de control, como por ejemplo los compuestos antifúngicos naturales. El objetivo del presente estudio fue evaluar la sensibilidad de cepas de Botrytis cinerea y Penicillium expansum aisladas de manzanas, a los fungicidas tiabendazol (Tecto® 500 SC), fludioxonil (Scholar® 50 WP) y productos de origen natural (BC-1000®, Lonlife plus® SC y Biorend® SC). Se determinó in vitro la concentración media efectiva (EC50) y concentración mínima inhibitoria (CMI) la para micelio y conidias a cada fungicida, posteriormente se evaluaron las dosis comerciales de cada producto en condiciones in vivo. Un 10% y un 48% de las cepas de Botrytis cinerea y de Penicillium expansum respectivamente, resultaron ser resistentes a tiabendazol. Fludioxonil fue efectivo en la inhibición de ambos patógenos con valores de EC50 promedio para conidias de 0,02 μg·mL-1 para Botrytis cinerea y de 0,29 μg·mL-1 para Penicillium expansum. Los productos de origen natural presentaron resultados intermedios inhibiendo algunas de las cepas evaluadas, excepto la formulación de BC-1000® utilizada, que no inhibió a ninguno de los dos patógenos. En los ensayos in vivo, el mayor efecto se obtuvo con fludioxonil, y tiabendazol resultó efectivo solo contra las cepas sensibles de ambos patógenos. Las dosis comerciales de los productos naturales utilizados ejercieron un control relativo de ambos patógenos, salvo BC-1000® que no logró efecto de control alguno sobre ambos patógenos. / One of the factors that most affect the condition of the fruit are postharvest diseases, commonly known as "fruit rots”. The most common in apples are caused by Penicillium expansum and Botrytis cinerea. The application of synthetic fungicides in postharvest is one of the strategies used for their control; however, continued use of agrochemicals has led to a decrease in their protective effect. Thiabendazole as a fungicide has been used for a long time in the control of these diseases, but its use has been limited by the development of resistant phytopathogenic strains. In 2004 Fludioxonil was registered in United States of America for use in apples in postharvest treatments being highly effective in controlling these pathogens including resistant strains to thiabendazole. Natural antifungal compounds have also been proposed for postharvest fruit rot control. The aim of this study was to evaluate to sensitivity of Botrytis cinerea and Penicillium expansum strains isolated from apples, the fungicides thiabendazole (Tecto ® 500 SC), fludioxonil (Scholar ® 50 WP) and natural products (BC-1000 ®, Lonlife Plus® SC and Biorend® SC). EC50 and MIC were in vitro calculated for inhibition of mycelium growth and conidial germination for each fungicide, while the commercial dose of each product was in vivo evaluated. 10% and 48% of strains of Botrytis cinerea and Penicillium expansum respectively, were resistant to thiabendazole. Fludioxonil was effective in both pathogens with EC50 values of 0.02 average conidia μg·mL-1 to Botrytis cinerea and 0.29 μg·mL-1 for Penicillium expansum. The natural products showed intermediate results inhibiting some of the strains, except for the formulation of BC-1000 ® used, that did not inhibit any of the two pathogens. Fludioxonil was the most effective active ingredient reducing in vivo both decays, although thiabendazole was only effective against susceptible strains of both pathogens. BC-1000® formulation commercial doses of natural products used exerted a relative control of both pathogens.

Memoria para optar al título profesional de: Ingeniero Agrónomo Mención: Sanidad Vegetal / La pudrición gris, causada por el hongo Botrytis cinerea, corresponde al principal problema fitopatológico que enfrentan los productores de uva de mesa, puesto que limita su producción y exportación al desarrollarse pudriciones incluso en almacenaje. Para su control, se integran diferentes medidas entre las cuales el uso de fungicidas específicos es la base de los programas utilizados. Actualmente, la creciente preocupación por la presencia de residuos de fungicidas en la fruta y el riesgo ambiental asociado a su uso, además del desarrollo de resistencias en Botrytis a estas moléculas, han complicado su empleo como estrategia de control. Ante el cual se han aplicado métodos alternativos como la intensificación de prácticas culturales que disminuyan las condiciones predisponentes de la enfermedad, junto a herramientas naturales que incluyen el uso de extractos de cítricos y controladores biológicos como Trichoderma. Por otro lado, recientemente se ha elaborado un biofungicida con la bacteria antagonista Serratia plymuthica cepa CCGG2742, un controlador biológico de B. cinerea, que en este ensayo se ha probado su sensibilidad frente a fungicidas de uso común en vid, con el objeto de conocer su compatibilidad en un posible programa de control que integre estas estrategias. Se evaluaron los ingredientes activos boscalid, ciprodinil + fludioxonil, fenhexamida, iprodione, kresoxim methyl, pyrimethanil, tebuconazole y extracto de cítrico en concentraciones que fluctuaron entre 0 y 5.000 µg i.a. ∙ mL-1 y se calculó la EC50. Los valores de EC50 obtenidos fueron: 6,00∙104 ; 3,18∙107 ; 7,04∙1012 y 1,38∙1018 µg i.a. ∙ mL-1 , para fenhexamida, extracto de cítrico, tebuconazole y boscalid respectivamente, mientras que con iprodione, kresoxim methyl, pyrimethanil y la mezcla de c+f, no se obtuvieron valores de EC50 positivos, ni indicios de inhibición in vitro. De acuerdo a estos resultados, el uso de dosis comerciales de fungicidas no altera el desarrollo de la cepa CCGG2742. / Gray mold induced by Botrytis cinerea, is the most important disease of table grapes that causes significant losses to grape growers. Its ability to attack in the orchard and its ability to develop under conditions prevailing during storage, shipment and marketing make its control a challenge. Control programs have relied mainly on chemical strategies using specific fungicides. However, the growing public concern about fungicide residues in fruit, and the environmental risk associated to fungicide use, in addition to pathogen’s resistance development, have created a complicated situation for the continuous use of fungicides. Therefore, alternative methods have been developed for non-chemical control, such as cultural practices, and the use of natural products including citrus extracts and biological controls agents, as Trichoderma. Serratia plymuthica, antagonistic to B. cinerea, is a new biocontrol agent, and in this study the sensitivity of the strain CCGG2742 to fungicides commonly used in vineyards was tested, in order to know their compatibility for possible control programs that integrate these tools. Boscalid, ciprodinil + fludioxonil, fenhexamida, iprodione, kresoxim methyl, pyrimethanil, tebuconazole and citric extract were tested at concentrations ranging between 0 and 5,000 µg i.a. ∙ mL-1 . EC50 values obtained ranged between 5.48∙104 and 1.38∙1018 µg i.a. ∙ mL-1 . According to these results, commercial rates of the fungicides tested do not affect the development of S. plymuthica strain CCGG2742.