The biology and epidemiology of bovine herpesvirus 2 (BoHV-2), the agent of bovine herpetic mammillitis (BHM), remain largely unknown. Thus, the present study aimed at addressing selected aspects of BoHV-2 epidemiology and pathogenesis in sheep and guinea pigs. A serological survey for BoHV-2 antibodies in 2.213 samples from cattle > 24-months-old from 136 counties of seven different mesoregions of Rio Grande do Sul (RS) revealed an overall prevalence of 24.5% (543/2.213). These results demonstrate that BoHV-2 infection is widespread among cattle in RS, and potentially involved in cases of mammillitis frequently described in dairy cows. A second experiment was conducted to characterize the latent BoHV-2 infection in a sheep model. Lactating ewes inoculated with BoHV-2 in the skin of the udder shed virus for up to five days, developed mammillitis and seroconverted. However, attempts to reactivate latent infection by dexamethasone (Dx) administration at day 40 post infection (pi) failed. Nevertheless, viral DNA was detected by PCR in several nerve ganglia and/or regional lymph nodes (LNs) of all animals at day 40 post-reactivation (pr). Lambs previously inoculated with BoHV-2 in the nose also harbored latent viral DNA in trigeminal ganglia, tonsils and regional LNs. These results demonstrated that BoHV-2 establishes latent infection in nerve ganglia and in regional lymphoid tissues, yet virus reactivation is not easily achieved by standard protocols used for other alphaherpesvirus. A third experiment was conducted to evaluate guinea pigs (Cavia porcellus) as an experimental model to study the biology of BoHV-2 infection. Weanling (30-40 daysold) guinea pigs inoculated into the genital area and over the skin of the udder and teats with a viral suspension developed moderate to severe clinical signs, noticeably more pronounced in the genital area. Infectious virus was recovered from swabs collected between days 3 and 7 from genital area (8/12) and less frequently (1/12) from teat skin. All animals seroconverted to BoHV-2 developing neutralizing titers from 16 to 128 at day 30 pi. Histological examination of skin biopsies collected from genital lesions showed intranuclear inclusion bodies and perivascular infiltrates composed by lymphocytes and plasmocytes. PCR examination of tissues collected from animals euthanized at day 35 pi revealed the presence of latent viral DNA in nerve ganglia and LNs. Dx administration at day 35 pi was followed by mild recrudescence of genital disease in some animals, yet virus isolation and/or seroconversion which are usually taken as indicators of virus reactivation were not observed. These results show that guinea pigs may be used as models to study BoHV-2 acute and latent infection and confirm that BoHV-2 reactivation is not easily achieved by using the standard protocols for other alphaherpesviruses. Taken together, these results demonstrate that both sheep and guinea pigs are suitable animal models for BoHV-2 infection. / A biologia e a epidemiologia da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 2 (BoHV-2), agente da mamilite herpérica bovina, são pouco conhecidas. Com isso, o presente estudo teve como objetivos elucidar alguns aspectos da epidemiologia e estudar a patogenia da infecção pelo BoHV-2 em ovinos e cobaias. Um estudo sorológico pesquisando anticorpos para o BoHV-2 em 2.213 amostras de bovinos com mais de 2 anos, provenientes de 136 municípios distribuídos em 7 mesoregiões do Rio Grande do Sul (RS), determinou uma soroprevalência de 24,5% (543/2.213). Os resultados demonstram que o BoHV-2 está disseminado no rebanho bovino no RS, com potencial envolvimento em casos de mamilite freqüentemente relatados em rebanhos leiteiros. Um segundo experimento visou caracterizar a infecção latente em ovinos, propostos como modelo experimental. Ovelhas lactantes inoculadas com o BoHV-2 na pele do úbere excretaram o vírus por até 5 dias, desenvolveram mamilite e soroconverteram. Entretanto, a tentativa de reativar a infecção latente pela administração de dexametasona (Dx) no dia 40 pós-infecção (pi) não resultou em reativação. Não obstante, o DNA viral latente foi detectado por PCR em gânglios neurais e/ou em diversos linfonodos (LNs) de todos os animais no dia 40 pós reativação (pr). Cordeiros que haviam sido inoculados com o BoHV-2 pela via nasal igualmente albergavam o DNA viral latente nos gânglios trigêmeos, tonsilas e LNs regionais. Esses resultados demonstram que o BoHV-2 estabelece infecção latente em gânglios neurais e tecidos linfóides regionais, embora a reativação viral não seja facilmente obtida com os protocolos usados em outros alfaherpesvírus. Um terceiro experimento foi realizado para validar cobaias (Cavia porcellus) como modelo experimental para estudo da biologia da infecção com o BoHV-2. Cobaias lactentes (30- 40 dias) inoculadas com o BoHV-2 nas regiões genital e intra-dérmico no tetos e úbere desenvolveram sinais clínicos moderados a severos, notadamente mais pronunciados na região genital. O vírus foi isolado de suabes coletados entre os dias 3 e 7 pi da região genital (8/12) e em menor freqüência da região dos tetos (1/12). Todos os animais soroconverteram para o BoHV-2, apresentando títulos de anticorpos neutralizantes entre 16 e 128 no dia 30 p.i. A análise histológica de biópsias de pele coletada de lesões revelou corpúsculos de inclusão e infiltrado linfocitário e plasmocitário perivascular. PCR realizada com DNA total extraído dos tecidos coletados no dia 35 pi revelou a presença de DNA viral latente em gânglios neurais lombo-sacrais e LNs regionais. A administração de Dx no dia 35 pi cursou com recrudescência clínica na região genital, porém não foram detectados excreção viral nem soroconversão, indicadores de reativação da infecção latente. Estes resultados demonstram que cobaias podem ser usados como modelo para a infecção aguda e latente pelo BoHV- 2, e confirmam que a reativação viral não é facilmente obtida pelo uso de protocolos usuais para outros alfaherpesvírus. Em conjunto, os resultados demonstram a utilidade de ovinos e cobaias como modelo experimental para a infecção pelo BoHV-2.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The bovine mammillits caused by bovine herpesvirus type 2 (BoHV-2) is an important disease of dairy cattle yet very little is known about its pathogenesis. This study aimed at reproducting and characterizing the clinical-pathological aspects of bovine herpesvirus mammillits in experimentally infected sheep. In the first experiment, ten lambs were inoculated in the nasal mucosa and the virological, clinical and serological aspects of acute infection were monitorated. Virus sheeding was detected in nasal secretions of 7 lambs between days 2 and 8 post inoculation (pi) and lasted from one to three days. A serous nasal discharge, changing to mucous and mucopurulent, was observed in all animals between days 2 and 5 pi. Seven lambs developed vesicles, pustules and erosions in the nasal mucosa between days 4 and 8 pi. All inoculated animals seroconverted to BoHV-2. Dexamethasone administration at day 40 pi was not followed by virus shedding, clinical recrudescence or seroconversion. In the second experiment, eight milking ewes were inoculated in the skin of the teats and udder, and monitorated thereafter regarding to viral replication, clinical signs and histological changes. Infectious virus was isolated from lesion swabs of one ewe on days 7 and 8 pi. Five animals developed lesions in inoculation sites between days 4 and 6 pi. The clinical-pathological aspects of the lesions were similar to those of natural infections and were characterizated by erythema, edema, papules, vesicles, exsudation and scabs. By histological examination, the lesions displayed cellular edema and linfoplasmocitic multifocal infiltrate surrounding blood vessels in the dermis. Moreover, eosinophilic intranuclear inclusion bodies were observed in inflamatory cells and syncitia. Virus particles resembling herpesvirus were observed by eletronic transmission microscopy. These results indicate that sheep are susceptible to BoHV-2 infection, and can develop clinical signs similar to those observed in cattle in natural outbreaks of herpes mammillitis. Thus, this animal species may be used as a model to study pathogenesis, vaccine development and antiviral drugs. / A mamilite causada pelo herpesvírus bovino tipo 2 (BoHV-2) é uma importante enfermidade de gado leiteiro, porém pouco se sabe sobre a sua patogenia. O presente trabalho teve como objetivos reproduzir e caracterizar em ovinos as manifestações clínico-patológicas associadas com a infecção natural de bovinos pelo BoHV-2. Em um primeiro experimento, dez cordeiros foram inoculados na mucosa nasal e a infecção aguda foi monitorada nos aspectos clínicos, virológicos e sorológicos. Excreção viral em secreções nasais foi detectada em 7/10 animais entre os dias 2 e 8 pós-inoculação (pi), com duração que variou entre um e três dias. Todos animais apresentaram secreção nasal serosa, passando a mucosa e mucopurulenta, entre os dias 2 e 5 pi, e sete deles apresentaram também hiperemia e o desenvolvimento de vesículas, pústulas e erosões na mucosa nasal entre os dias 4 e 8 pi. Todos os animais soroconverteram ao BoHV-2. A administração de dexametasona aos 40 dias pi não foi seguida de excreção viral, soroconversão ou recrudescência clínica. Em um segundo experimento, oito ovelhas lactantes foram inoculadas na pele das tetas e do úbere, seguida da caracterização virológica, clínica e histopatológica da infecção aguda. O vírus foi isolado a partir de suabes coletados das lesões de uma ovelha nos dias 7 e 8 pi. Cinco (5/8) animais desenvolveram lesões nos locais de inoculação entre os dias 4 e 6 pi. As lesões apresentaram características clínicopatológicas semelhantes às observadas em infecções naturais, e se caracterizaram por hiperemia, edema, pápula, vesículas, exsudação e formação de crostas. Histologicamente, as lesões se caracterizaram por edema intracelular, presença de um infiltrado linfoplasmocitário multifocal e predominantemente perivascular na derme, além de corpúsculos de inclusão eosinofílicos intranucleares em células inflamatórias e células sinciciais. Partículas víricas com morfologia típica de herpesvírus foram observadas sob microscopia eletrônica de transmissão. Esses resultados indicam que ovinos são susceptíveis à infecção pelo BoHV-2 e desenvolvem lesões características de mamilite herpética quando inoculados experimentalmente, podendo ser utilizados para estudos de patogenia, desenvolvimento de vacinas e pesquisas de drogas antivirais.