O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico encontrado em diversos tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos. A síntese do NO é realizada pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Um dos mecanismos de ação do NO é dado pela ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), resultando na produção de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), um mensageiro secundário nessa via de sinalização celular. O GMPc por sua vez é capaz de modular a atividade de algumas fosfodiesterases (PDEs), enzimas responsáveis pela degradação do GMPc e de outro nucleotídeo cíclico, o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da elevação dos níveis de NO por meio do doador de óxido nítrico (SNAP) e o uso de inibidores de diferentes isoformas de fosfodiesterases no meio de cultivo durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos sobre a retomada da meiose, concentração de NO e níveis de GMPc e AMPc. Deste modo, os complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram cultivados por até 9 horas com o doador de NO (SNAP - 10-7 M) associado ou não ao inibidor de GCs (ODQ - 10-5 M) e associado ou não aos inibidores das fosfodiesterases, PDE5 (Sildenafil - 10µM), PDE3 (Cilostamide - 20µM) e PDE8 (Dipiridamole - 50µM). As amostras foram avaliadas quanto a taxa de retomada da meiose, níveis de NO (9h de MIV) e níveis dos nucleotídeos cíclicos GMPc e AMPc (0, 1, 2 e 3h de MIV). O SNAP retardou o rompimento da vesícula germinativa com 9horas de cultivo (P<0,05) e quando o SNAP foi associado ao ODQ o efeito foi revertido (P>0,05). A inclusão de SNAP no cultivo, os níveis de NO foram elevados (P<0,05). Os níveis de GMPc só foram influenciados positivamente pelo SNAP com 1 hora de cultivo (P<0,05) e após 2 e 3 horas, esta influência não persistiu (P>0,05), visto que o ODQ aboliu o efeito. A influência do SNAP foi devido ao estímulo da GCs. Para os níveis de AMPc, o doador de NO não foi capaz de influenciar suas concentrações durante as 3 horas de cultivo (P>0,05). Quando o SNAP foi associado ao Sildenafil (SNAP+SIL) não houve diferença em relação ao grupo imaturo (P>0,05), porém, também não se diferiu do tratamento SNAP e controle (P>0,05). Para as taxas de retomada de meiose todos os tratamentos foram eficientes e conseguiram retardar a quebra da vesícula germinativa diante do grupo controle (P<0,05), sendo o grupo SNAP+CIL mais eficiente. Para os níveis de AMPc, nem mesmo com a utilização de inibidores das PDE3 e PDE8 foi possível atenuar a queda do nucleotídeo. Em conclusão, o SNAP exerceu influência na retomada da meiose, na concentração de NO e nos níveis de GMPc sendo que sua ação se deve à atividade da GCs. Não houve influência sobre os níveis de AMPc, quando o SNAP foi associado a inibidores específicos de fosfodiesterases, mesmo quando apresentaram efeito sobre a retomada da meiose. A via NO/GCs/GMPc não parecer atuar sobre a via PDE3/AMPc, sugerindo a ação de outras vias no controle da meiose. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger found in many cell types such as endothelial cells, neurons and macrophages. The synthesis of NO is made by the action of nitric oxide synthase (NOS). One of the mechanisms of action of NO is given by the activation of the enzyme soluble guanylate cyclase (sGC), resulting in the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), a secondary messenger in this pathway of cell signaling. The cGMP in turn is capable of modulating the activity of some phosphodiesterases (PDEs), enzymes responsible for degradation of cGMP and other cyclic nucleotide, cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The objective of this study was to investigate the effects of elevated levels of NO via nitric oxide donor (SNAP) and the use of inhibitors of phosphodiesterase isoforms in the culture medium during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP and cAMP levels. Thus, the complexes cumulus-oocyte (COCs) were cultured for cattle up to 9 hours with the NO donor (SNAP - 10-7 M) with or without the inhibitor of sGC (ODQ - 10-5 M) and with or without to inhibitors of phosphodiesterase PDE5 (Sildenafil - 10µM), PDE3 (Cilostamide - 20µM) and PDE8 (Dipyridamole - 50µM). The samples were evaluated for the rate of resumption of meiosis, levels of NO (9h - IVM) and levels of cyclic nucleotides cGMP and cAMP (0, 1, 2 and 3h - IVM). The SNAP delayed with germinal vesicle breakdown of 9hours cultivation (P < 0.05) when SNAP was associated with ODQ was reversed the effect (P> 0.05). The inclusion of SNAP cultivation, NO levels were increased (P<0.05). cGMP levels were positively influenced only by the snap 1 hour in culture (P<0.05) and after 2 and 3 hours, this effect was not maintained (P<0.05), whereas ODQ abolished the effect. The influence of SNAP was due to stimulation of GCs. For cAMP levels, the NO donor was not able to influence their concentrations during the 3 h incubation (P>0.05). When SNAP was associated with Sildenafil (SIL+SNAP) there was no difference compared to the immature group (P>0.05), however, also did not differ from SNAP treatment and control (P>0.05). Rates for resumption of meiosis all treatments were efficient and able delay before germinal vesicle breakdown in the control group (P<0.05), with SNAP+CIL group more efficient. For cAMP levels, even with the use of inhibitors of PDE3 and PDE8 was possible to alleviate the decrease of the nucleotide. In conclusion, SNAP exerted influence on the resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP levels and that its action is due to a GCs activity. There was no effect on cAMP levels, when SNAP was associated with specific phosphodiesterase inhibitors, even when presented effect on the resumption of meiosis. The pathway NO/sGC/cGMP seem not act on the pathway PDE3/AMPc, suggesting the action of other pathways in the control of meiosis.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico encontrado em diversos tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos. A síntese do NO é realizada pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Um dos mecanismos de ação do NO é dado pela ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), resultando na produção de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), um mensageiro secundário nessa via de sinalização celular. O GMPc por sua vez é capaz de modular a atividade de algumas fosfodiesterases (PDEs), enzimas responsáveis pela degradação do GMPc e de outro nucleotídeo cíclico, o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da elevação dos níveis de NO por meio do doador de óxido nítrico (SNAP) e o uso de inibidores de diferentes isoformas de fosfodiesterases no meio de cultivo durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos sobre a retomada da meiose, concentração de NO e níveis de GMPc e AMPc. Deste modo, os complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram cultivados por até 9 horas com o doador de NO (SNAP - 10-7 M) associado ou não ao inibidor de GCs (ODQ - 10-5 M) e associado ou não aos inibidores das fosfodiesterases, PDE5 (Sildenafil - 10µM), PDE3 (Cilostamide - 20µM) e PDE8 (Dipiridamole - 50µM). As amostras foram avaliadas quanto a taxa de retomada da meiose, níveis de NO (9h de MIV) e níveis dos nucleotídeos cíclicos GMPc e AMPc (0, 1, 2 e 3h de MIV). O SNAP retardou o rompimento da vesícula germinativa com 9horas de cultivo (P<0,05) e quando o SNAP foi associado ao ODQ o efeito foi revertido (P>0,05). A inclusão de SNAP no cultivo, os níveis de NO foram elevados (P<0,05). Os níveis de GMPc só foram influenciados positivamente pelo SNAP com 1 hora de cultivo (P<0,05) e após 2 e 3 horas, esta influência não persistiu (P>0,05), visto que o ODQ aboliu o efeito. A influência do SNAP foi devido ao estímulo da GCs. Para os níveis de AMPc, o doador de NO não foi capaz de influenciar suas concentrações durante as 3 horas de cultivo (P>0,05). Quando o SNAP foi associado ao Sildenafil (SNAP+SIL) não houve diferença em relação ao grupo imaturo (P>0,05), porém, também não se diferiu do tratamento SNAP e controle (P>0,05). Para as taxas de retomada de meiose todos os tratamentos foram eficientes e conseguiram retardar a quebra da vesícula germinativa diante do grupo controle (P<0,05), sendo o grupo SNAP+CIL mais eficiente. Para os níveis de AMPc, nem mesmo com a utilização de inibidores das PDE3 e PDE8 foi possível atenuar a queda do nucleotídeo. Em conclusão, o SNAP exerceu influência na retomada da meiose, na concentração de NO e nos níveis de GMPc sendo que sua ação se deve à atividade da GCs. Não houve influência sobre os níveis de AMPc, quando o SNAP foi associado a inibidores específicos de fosfodiesterases, mesmo quando apresentaram efeito sobre a retomada da meiose. A via NO/GCs/GMPc não parecer atuar sobre a via PDE3/AMPc, sugerindo a ação de outras vias no controle da meiose. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger found in many cell types such as endothelial cells, neurons and macrophages. The synthesis of NO is made by the action of nitric oxide synthase (NOS). One of the mechanisms of action of NO is given by the activation of the enzyme soluble guanylate cyclase (sGC), resulting in the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), a secondary messenger in this pathway of cell signaling. The cGMP in turn is capable of modulating the activity of some phosphodiesterases (PDEs), enzymes responsible for degradation of cGMP and other cyclic nucleotide, cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The objective of this study was to investigate the effects of elevated levels of NO via nitric oxide donor (SNAP) and the use of inhibitors of phosphodiesterase isoforms in the culture medium during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP and cAMP levels. Thus, the complexes cumulus-oocyte (COCs) were cultured for cattle up to 9 hours with the NO donor (SNAP - 10-7 M) with or without the inhibitor of sGC (ODQ - 10-5 M) and with or without to inhibitors of phosphodiesterase PDE5 (Sildenafil - 10µM), PDE3 (Cilostamide - 20µM) and PDE8 (Dipyridamole - 50µM). The samples were evaluated for the rate of resumption of meiosis, levels of NO (9h - IVM) and levels of cyclic nucleotides cGMP and cAMP (0, 1, 2 and 3h - IVM). The SNAP delayed with germinal vesicle breakdown of 9hours cultivation (P < 0.05) when SNAP was associated with ODQ was reversed the effect (P> 0.05). The inclusion of SNAP cultivation, NO levels were increased (P<0.05). cGMP levels were positively influenced only by the snap 1 hour in culture (P<0.05) and after 2 and 3 hours, this effect was not maintained (P<0.05), whereas ODQ abolished the effect. The influence of SNAP was due to stimulation of GCs. For cAMP levels, the NO donor was not able to influence their concentrations during the 3 h incubation (P>0.05). When SNAP was associated with Sildenafil (SIL+SNAP) there was no difference compared to the immature group (P>0.05), however, also did not differ from SNAP treatment and control (P>0.05). Rates for resumption of meiosis all treatments were efficient and able delay before germinal vesicle breakdown in the control group (P<0.05), with SNAP+CIL group more efficient. For cAMP levels, even with the use of inhibitors of PDE3 and PDE8 was possible to alleviate the decrease of the nucleotide. In conclusion, SNAP exerted influence on the resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP levels and that its action is due to a GCs activity. There was no effect on cAMP levels, when SNAP was associated with specific phosphodiesterase inhibitors, even when presented effect on the resumption of meiosis. The pathway NO/sGC/cGMP seem not act on the pathway PDE3/AMPc, suggesting the action of other pathways in the control of meiosis.

Beef and milk production industries represent the largest agricultural industries in the United States with a retail equivalent value of approximately $112 billion (USDA, 2008). Infertility is the major problem for mammalian reproduction. In the United States approximately 66% of cows are bred by Artificial Insemination (AI), but only ~50% of these inseminations result in successful pregnancies. Infertility can occur either from male factor (spermatozoon) or female factor (oocyte) and male contributes approximately 40% of cases. Infertility costs the producer approximately $5 per exposed cow for every 1% reduction in pregnancy rate. In spite of its millions of dollars in economic impact, the precise molecular events/mechanisms that determine the fertilizing potential of an oocyte and spermatozoon are not well defined. The thesis of my doctoral dissertation is that proteomics-based “systems biology” modeling of bovine oocyte and spermatozoon can facilitate rapid understanding of fertility. To test this thesis, I needed to first identify the proteins associated with bovine oocyte and its associated cumulus cells, and spermatozoon. The next step was functional annotation of the experimentally confirmed proteins to identify the major functions associated with the oocyte, cumulus cells and spermatozoon, and finally, generate a proteomics based systems biology model of bovine oocyte and cumulus cell communication and male fertility. The results of my dissertation established the methods that provide afoundation for high-throughput proteomics approaches of bovine oocyte and cumuluscell biology and allowed me to model the intricate cross communication between oocyte and cumulus cells using systems biology approaches. Proteomics based systems biology modeling of oocytes and cumulus cells identified the signaling pathways and proteins associated with this communication that may have implications in oocyte maturation. In addition, systems biology modeling of differential spermatozoa proteomes from bulls of varying fertility rates enabled the identification of putative molecular markers and key pathways associated with male fertility. The ultimate positive impact of these results is to facilitate the field of biomedical research with useful information for comparative biology, better understanding of bovine oocyte and spermatozoon development, infertility, biomarker discovery, and eventually development of therapies to treat infertility in bovine as well as humans.

The development of oocytes of differing quality retrieved using transvaginal follicular aspiration (TVFA) and following DNA injection was examined. Eight cows were subjected to twice weekly TVF A for 16 wk. Oocytes retrieved were graded and placed in an in-vitro maturation, fertilization and co-culture (IVMIIVFIIVC) program. Two thirds of oocytes were injected with DNA. Good quality oocytes from slaughtered cows (SH) were obtained once monthly and processed the same way. Good quality TVF A oocytes had a higher mean development score than poor quality oocytes, but not different from that of good quality SH oocytes. Good quality TVF A oocytes produced more viable embryos (31.7% blastocysts) than poor quality oocytes or SH oocytes (12.8% and 20.4% blastocysts, respectively). Embryo development following injection of DNA was the same for oocytes for each source-quality group (TVF A-good, 8.4; TVF A-poor, 5.5; SH-good, 6.3 % blastocysts). Development of good quality TVFA oocytes increased during the last 9 wk of the 16 wk collection period. Poor oocyte development increased slightly to 9 wk and then decreased. Development of TVF A oocytes injected with DNA did not vary during the experiment. However, development of controls increased from a mean score of2.50 at wk 1 to 4.17 at wk 16. Oocytes from TVFA produced more PCR positive blastocysts (95.0%) than SH oocytes (61.5%). More calves were born from the transfer of embryos injected with DNA from TVF A oocytes (3/5) than from SH oocytes (116), although not statistically significant. One calf was PCR positive in bone-marrow, but was negative in other tissues. The use of oocytes obtained by TVF A may improve the efficiency of producing transgenic cattle. / Master of Science

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aim of this study was to evaluate the effect of fibroblast growth factor 10 (FGF10) on bovine oocyte meiotic resumption in an in vitro oocyte and follicular cells co-culture system. At first, an oil-free culture system able to maintain a stable osmolality of the medium without the negative interference of the oil was established. The maintenance of osmotic equilibrium confirms that fourwell plate with water in the central hole can be a feasible alternative to replace oil for scientific experimentation and embryo culture. The embryo development rate in the alternative system (near 30% blastocyst) was similar to that obtained in the conventional system (33% blastocyst). Afterwards, the role of FGF10 on bovine oocyte meiotic resumption was evaluated in a co-culture of oocytes and follicular cells in the presence of angiotensin II (10-11M AngII). All tested concentrations of FGF10 inhibited the resumption of meiosis induced by AngII (P ≤ 0.05). The highest germinal vesicle breakdown (GVBD) rate was observed when FGF10 was absent (45.3%). At concentrations of 10, 100, and 1000ng mL-1 FGF10, the rates of GVBD were 30.2, 29.6 and 27%, respectively. In a second experiment, oocytes were co-cultured with follicular hemisections to test if FGF10 (100ng mL-1) acts directly on COCs or through follicular cells to inhibit AngII (10-11M)-induced meiotic resumption. The AngII-induced GVBD (62.6%) was inhibited when FGF10 was added to in vitro co-culture system (37.8%; P ≤ 0.05). However, FGF10 did not affect meiotic resumption of COCs cultured without AngII in the presence or absence of follicular cells. The third experiment tested if FGF10 inhibits progesterone-induced meiotic resumption. The addition of FGF10 did not affect the meiotic resumption rate induced by progesterone (41.1% and 41.7% GVBD with and without FGF10, respectively; P ≥ 0.05). However, indomethacin (10μM) blocked (20.1% GVBD; P ≤ 0.05) progesterone positive effect suggesting that this steroid, like AngII, acts through cyclooxygenases pathway to induce meiotic resumption. Results show that FGF10 interacts with follicular cells to inhibit AngII but not progesterone-induced meiotic resumption of bovine oocytes. / O presente trabalho teve por objetivo averiguar o papel do fator de crescimento fibroblástico 10 (FGF10) no reinício da meiose de oócitos bovinos, utilizando um modelo in vitro de co-cultivo de oócitos e células foliculares. Em um primeiro estudo, foi estabelecido um sistema de cultivo capaz de manter a osmolalidade dos meios constante na ausência de óleo. A adição de água entre os poços de placas de cultivo foi eficiente na prevenção da evaporação dos meios sendo uma alternativa na experimentação científica e produção in vitro de embriões. Com este sistema, se obteve uma taxa média de 30% de desenvolvimento embrionário, resultado similar ao obtido no sistema convencional (33% blastocistos). Após o estabelecimento do sistema, avaliou-se a participação do FGF10 no reinício da meiose de oócitos bovinos e sua interação com a maturação nuclear induzida por angiotensina II (AngII; 10-11M) e progesterona (100ng mL-1). Todas as concentrações de FGF10 testadas foram eficientes na inibição do reinício da meiose induzido por AngII (P ≤ 0,05). As maiores taxas de rompimento de vesícula germinativa (RVG) foram observadas na ausência de FGF10 (45,3%). Nas concentrações de 10, 100, e 1000ng mL-1 de FGF10, as taxas de RVG foram 30,2, 29,6 e 27%, respectivamente. Após o estabelecimento da dose ideal, foi verificado que a adição de FGF10 (100ng mL-1) ao cultivo de complexos cumulus-oócitos acarretou em diminuição na taxa de reinício da meiose somente na presença de células foliculares e AngII (37,8% e 62,6% de RVG com e sem FGF10, respectivamente; P ≤ 0,05). A partir dos resultados dos experimentos anteriores, o terceiro experimento foi delineado para testar se o FGF10 é capaz de inibir o reinício da divisão meiótica induzido por progesterona. A adição de FGF10 não afetou a taxa de reinício da meiose induzida pela progesterona (41,1% e 41,7% de RVG com e sem FGF10, respectivamente; P ≥ 0,05). Entretanto, a adição de indometacina (10μM) bloqueou (20,1% de RVG; P ≤ 0,05) o efeito positivo da progesterona. Este bloqueio demonstra que a progesterona, assim como já foi demonstrado para AngII, utiliza a via das ciclooxigenases para induzir o reinício da meiose e este evento parece não ser regulado pelo FGF10. Os resultados demonstram que o FGF10 interage com as células foliculares para inibir o reinício da meiose estimulado pela AngII mas não pela progesterona.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_caroline_gomes_lucas.pdf: 894020 bytes, checksum: 8d27baa8c8ae08744efe112062ff8b86 (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / The possibility of increasing the genetic pattern and animal production make the in vitro production of embryos an extremely valuable technique for the technological development of livestock. However, due to the need for mimicking the in vivo process, that consists in several interdependent steps there are difficulties in setting the optimal conditions for each situation performed. The improvement of in vitro maturation (IVM) protocols through supplementation with different molecules can increase the efficiency of the culture medium and improve the competence of oocytes for fertilization and embryogenesis. A promising approach is the realization of mediated delivery of nanocarriers molecules. Tretinoin (TTN, all- trans retinoic acid - ATRA ) is a natural retinoid and active metabolite of vitamin A with important action in cell proliferation and differentiation and embryonic development under both in vivo and in vitro conditions. TTN acts on the cytoplasmic maturation process, in the initial embryonic development and oocyte competence, improving the quality of embryos generated. The combinations of tretinoin with polymeric nanoparticles are alternatives to enhance the solubility and chemical stability of this molecule, allowing controlled release and decreased degradation. The objective of this study was to evaluate the effects of IVM medium supplementation with tretinoin-loaded lipid-core nanocapsules (TTN-LNC) at concentrations of 0.25, 0.5 and 1 μM, by analysis of embryonic development until the blastocyst stage, production of reactive oxygen species (ROS), and expression of genes related to apoptosis and pluripotency. As main results, TTN-LNC 0.25 μM increased the rate of blastocyst production and reduced ROS production. In addition, TTN and TTN-LNC induced a lower gene expression of Bax and SHC1, suggesting beneficial effects on the development of embryos. The results indicate that nanoencapsulation allows the use of a lower dose of TTN-LNC with consequent obtention of higher percentages of blastocyst production and decreased production of ROS, making nanoembriology a potential tool for improving bovine embryos IVP. / A possibilidade de aumento do padrão genético e da produção animal torna a produção in vitro (PIV) de embriões uma técnica extremamente valiosa para o desenvolvimento tecnológico da pecuária. No entanto, devido a necessidade de uma mimetização do processo in vivo, que consiste em várias etapas interdependentes, há dificuldades em ajustar as condições ótimas requeridas para cada situação reproduzida. O melhoramento dos protocolos de maturação in vitro (MIV) através da suplementação com diferentes moléculas permite aumentar a eficiência dos meios de cultivo e melhorar a competência de oócitos para a fertilização e embriogênese. Uma abordagem altamente promissora é a realização da entrega de moléculas mediada por nanocarreadores. A tretinoína (TTN, ácido retinóico all-trans - ATRA) é um retinóide natural e metabólito ativo da vitamina A, com ação importante na proliferação e diferenciação celular, e no desenvolvimento embrionário tanto em condições in vivo como in vitro. A TTN age no processo de maturação citoplasmática, no desenvolvimento inicial embrionário e competência oocitária melhorando a qualidade dos embriões gerados. A associação da tretinoína à nanopartículas poliméricas surge como alternativa para melhorar a solubilidade e estabilidade química desta molécula, possibilitando uma liberação controlada e redução da degradação. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação com nanocápsulas de núcleo lipídico associadas à tretinoína (TTN-LNC) no meio de MIV, nas concentrações de 0,25, 0,5 e 1 μM, através da análise do desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e expressão de genes relacionados a apoptose e pluripotência. Como principais resultados, a TTN-LNC a 0,25 μM aumentou a taxa de produção de blastocistos e reduziu a produção de EROs. Além disso, TTN e TTN-LNC induziram uma menor expressão dos genes Bax e SHC1 sugerindo efeitos benéficos sobre o desenvolvimento embrionário. Os resultados indicam que a nanoencapsulação permite a utilização de uma menor dose de TTN-LNC com consequente obtenção de maiores porcentagens de produção de blastocistos e diminuição da produção de EROs, tornando a nanoembriologia uma ferramenta potencial para a melhora da técnica de PIV de embriões bovinos.