Introdução: A barreira hematoencefálica limita a penetração de compostos farmacologicamente ativos para o cérebro devido à presença de zônulas de oclusão no endotélio cerebral e a expressão de transportadores de influxo e efluxo que modulam o acesso de fármacos para o parênquima cerebral. Nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC) tem sido estudadas como carreadores de fármacos para o tecido cerebral devido à capacidade de modulação da farmacocinética desses compostos. Entretanto, ainda pouco se sabe sobre os processos envolvidos nas alterações farmacocinéticas e na distribuição tecidual promovidas por esses transportadores. Objetivo: Pretendeu-se investigar as alterações na farmacocinética plasmática e penetração cerebral da quetiapina (QTP) nanoencapsulada em ratos Wistar. Materiais e Métodos: QLNC (1mg/mL) foram obtidas através da metodologia de nanoprecipitação e apresentaram reduzido tamanho de partícula (143 ± 6 nm), baixo indicie de polidispersão (PI < 0.1), alta eficiência de encapsulação (96%), potencial zeta negativo (-7.65 ± 0.815 mV) e pH ácido. QLNC quando visualizadas por MET apresentaram tamanho esférico, homogêneo com ausência de agregados. Os estudos in vivo desse trabalho foram aprovados pelo CEUA/UFRGS. Análise do plasma total e a utilização da microdiálise para determinação das concentrações plasmáticas e cerebrais livres foram realizadas após administração intravenosa da formulação de nanocápsulas de QTP (5 mg /kg ) (QLCN) ou do fármaco em solução (FQ) (5 mg /kg e 10 mg /kg) na presença e na ausência de 30 mg /kg de probenecida (PB), um inibidor de transportadores de membrana. Métodos validados foram utilizados para a quantificação do fármaco em diferentes matrizes. As concentrações cerebral e hepática totais foram investigadas através da técnica de homogeneizado de tecido. Além disso, a fração livre no plasma (fu) e a penetração nos eritrócitos também foi realizada. Resultados: QTP apresentou farmacocinética linear na faixa de doses investigadas, é um substrato para transportadores de efluxo na BHE. Diferenças foram observadas na fu da QTP até 2 h após administração de QLNC indicando que LNC do tipo III promove uma liberação sustentada do fármaco do carreador. QLNC não foi capaz de alterar o coeficiente de partição nos eritrócitos determinado in vitro. As concentrações cerebrais e hepáticas totais foram aumentadas após administração da formulação de nanocápsulas, porém, as concentrações cerebrais livres não foram alteradas em comparação com o QTP em solução. Após administração de PB o fator de penetração da QTP livre no cérebro foi reduzido de 1,55 ± 0.17 para 0,94 ± 0,15. Porém, essa inibição pela probenecida não teve efeito na penetração cerebral de QLNC (0,88 ± 0,21 – 0,92 ± 0.13) provavelmente devido ao fato da QTP ser carreada pela LNC e não estar disponível para interagir com transportadores. Conclusão: Considerando todos os resultados sugere-se que as LNC do tipo III carreiam a QTP através da circulação sistêmica até o parênquima cerebral. / Introduction: Blood-brain barrier (BBB) hinders the delivery of therapeutics to central nervous system due to the endothelial cells tight junctions, which restrict paracellular transport of substances, and the expression of influx and efflux transporters, which modulate drugs access to the brain. Lipid-core nanocapsules (LNC) have been proposed as drug carriers to improve brain delivery by modulating drug pharmacokinetics (PK). However, little in know about this modulation process and it is not clear whether the LCN carry the drug through the BBB or increase free drug penetration due to changes in the barrier permeability. Objective: The work aimed to investigate the alterations in the model drug quetiapine (QTP) plasma PK and brain penetration following nanoencapsulation into LNC (QLNC) using microdialysis. Methods: QLNC (1 mg.mL-1) were obtained by nanoprecipitation and presented small particle size (143 ± 6 nm), low polidispersion index (PI < 0.1), high incorporation efficiency (96%), negative zeta potential (–7.65 ± 0.815 mV) and acidic pH. TEM photomicrography showed spherically shaped particles and absence of aggregation. Animal studies approved by CEUA/UFRGS. Total plasma and free plasma and brain concentrations, last two determined by microdialysis, were analyzed after QLNC (5 mg/kg) and free drug (FQ – 5 and 10 mg/gk) i.v. dosing to Wistar rats alone or following probenecid (PB), an influx transporter inhibitor, i.v. administration (30 mg/kg). Drug was quantified in all matrices by validate LC/UV methods. Total brain and liver concentration after FQ and QLNC dosing were investigated in tissues homogenate. Furthermore, QTP free fraction (fu) in plasma and erythrocyte penetration were determined. Results: QTP presented linear PK in the dose range investigated and is substrate to influx transporters at the BBB. Differences observed on QTP fu up to 2 h after QLNC dosing indicate a drug slow release in the blood stream loaded into the LNC type III nanocarrier for this period of time. The LNC did not altered QTP erythrocytes partition coefficient. Total brain and liver concentrations were increased after QLNC dosing but free brain concentrations were not altered in comparison with FQ dosing. After PB dosing, QTP brain penetration was reduced from 1.55 ± 0.17 to 0.94 ± 0.15 when FQ was administered but the inhibition of influx transporters had no effect on QLNC brain penetration (0.88 ± 0.21 to 0.92 ± 0.13) probably because QTP is loaded into the LNC and not available to interact with transporters. Conclusions: Taking together these results suggested that LNC type III carries QTP in the blood stream and delivers the drug to the brain.

Introdução: A barreira hematoencefálica limita a penetração de compostos farmacologicamente ativos para o cérebro devido à presença de zônulas de oclusão no endotélio cerebral e a expressão de transportadores de influxo e efluxo que modulam o acesso de fármacos para o parênquima cerebral. Nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC) tem sido estudadas como carreadores de fármacos para o tecido cerebral devido à capacidade de modulação da farmacocinética desses compostos. Entretanto, ainda pouco se sabe sobre os processos envolvidos nas alterações farmacocinéticas e na distribuição tecidual promovidas por esses transportadores. Objetivo: Pretendeu-se investigar as alterações na farmacocinética plasmática e penetração cerebral da quetiapina (QTP) nanoencapsulada em ratos Wistar. Materiais e Métodos: QLNC (1mg/mL) foram obtidas através da metodologia de nanoprecipitação e apresentaram reduzido tamanho de partícula (143 ± 6 nm), baixo indicie de polidispersão (PI < 0.1), alta eficiência de encapsulação (96%), potencial zeta negativo (-7.65 ± 0.815 mV) e pH ácido. QLNC quando visualizadas por MET apresentaram tamanho esférico, homogêneo com ausência de agregados. Os estudos in vivo desse trabalho foram aprovados pelo CEUA/UFRGS. Análise do plasma total e a utilização da microdiálise para determinação das concentrações plasmáticas e cerebrais livres foram realizadas após administração intravenosa da formulação de nanocápsulas de QTP (5 mg /kg ) (QLCN) ou do fármaco em solução (FQ) (5 mg /kg e 10 mg /kg) na presença e na ausência de 30 mg /kg de probenecida (PB), um inibidor de transportadores de membrana. Métodos validados foram utilizados para a quantificação do fármaco em diferentes matrizes. As concentrações cerebral e hepática totais foram investigadas através da técnica de homogeneizado de tecido. Além disso, a fração livre no plasma (fu) e a penetração nos eritrócitos também foi realizada. Resultados: QTP apresentou farmacocinética linear na faixa de doses investigadas, é um substrato para transportadores de efluxo na BHE. Diferenças foram observadas na fu da QTP até 2 h após administração de QLNC indicando que LNC do tipo III promove uma liberação sustentada do fármaco do carreador. QLNC não foi capaz de alterar o coeficiente de partição nos eritrócitos determinado in vitro. As concentrações cerebrais e hepáticas totais foram aumentadas após administração da formulação de nanocápsulas, porém, as concentrações cerebrais livres não foram alteradas em comparação com o QTP em solução. Após administração de PB o fator de penetração da QTP livre no cérebro foi reduzido de 1,55 ± 0.17 para 0,94 ± 0,15. Porém, essa inibição pela probenecida não teve efeito na penetração cerebral de QLNC (0,88 ± 0,21 – 0,92 ± 0.13) provavelmente devido ao fato da QTP ser carreada pela LNC e não estar disponível para interagir com transportadores. Conclusão: Considerando todos os resultados sugere-se que as LNC do tipo III carreiam a QTP através da circulação sistêmica até o parênquima cerebral. / Introduction: Blood-brain barrier (BBB) hinders the delivery of therapeutics to central nervous system due to the endothelial cells tight junctions, which restrict paracellular transport of substances, and the expression of influx and efflux transporters, which modulate drugs access to the brain. Lipid-core nanocapsules (LNC) have been proposed as drug carriers to improve brain delivery by modulating drug pharmacokinetics (PK). However, little in know about this modulation process and it is not clear whether the LCN carry the drug through the BBB or increase free drug penetration due to changes in the barrier permeability. Objective: The work aimed to investigate the alterations in the model drug quetiapine (QTP) plasma PK and brain penetration following nanoencapsulation into LNC (QLNC) using microdialysis. Methods: QLNC (1 mg.mL-1) were obtained by nanoprecipitation and presented small particle size (143 ± 6 nm), low polidispersion index (PI < 0.1), high incorporation efficiency (96%), negative zeta potential (–7.65 ± 0.815 mV) and acidic pH. TEM photomicrography showed spherically shaped particles and absence of aggregation. Animal studies approved by CEUA/UFRGS. Total plasma and free plasma and brain concentrations, last two determined by microdialysis, were analyzed after QLNC (5 mg/kg) and free drug (FQ – 5 and 10 mg/gk) i.v. dosing to Wistar rats alone or following probenecid (PB), an influx transporter inhibitor, i.v. administration (30 mg/kg). Drug was quantified in all matrices by validate LC/UV methods. Total brain and liver concentration after FQ and QLNC dosing were investigated in tissues homogenate. Furthermore, QTP free fraction (fu) in plasma and erythrocyte penetration were determined. Results: QTP presented linear PK in the dose range investigated and is substrate to influx transporters at the BBB. Differences observed on QTP fu up to 2 h after QLNC dosing indicate a drug slow release in the blood stream loaded into the LNC type III nanocarrier for this period of time. The LNC did not altered QTP erythrocytes partition coefficient. Total brain and liver concentrations were increased after QLNC dosing but free brain concentrations were not altered in comparison with FQ dosing. After PB dosing, QTP brain penetration was reduced from 1.55 ± 0.17 to 0.94 ± 0.15 when FQ was administered but the inhibition of influx transporters had no effect on QLNC brain penetration (0.88 ± 0.21 to 0.92 ± 0.13) probably because QTP is loaded into the LNC and not available to interact with transporters. Conclusions: Taking together these results suggested that LNC type III carries QTP in the blood stream and delivers the drug to the brain.

Introdução: A barreira hematoencefálica limita a penetração de compostos farmacologicamente ativos para o cérebro devido à presença de zônulas de oclusão no endotélio cerebral e a expressão de transportadores de influxo e efluxo que modulam o acesso de fármacos para o parênquima cerebral. Nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC) tem sido estudadas como carreadores de fármacos para o tecido cerebral devido à capacidade de modulação da farmacocinética desses compostos. Entretanto, ainda pouco se sabe sobre os processos envolvidos nas alterações farmacocinéticas e na distribuição tecidual promovidas por esses transportadores. Objetivo: Pretendeu-se investigar as alterações na farmacocinética plasmática e penetração cerebral da quetiapina (QTP) nanoencapsulada em ratos Wistar. Materiais e Métodos: QLNC (1mg/mL) foram obtidas através da metodologia de nanoprecipitação e apresentaram reduzido tamanho de partícula (143 ± 6 nm), baixo indicie de polidispersão (PI < 0.1), alta eficiência de encapsulação (96%), potencial zeta negativo (-7.65 ± 0.815 mV) e pH ácido. QLNC quando visualizadas por MET apresentaram tamanho esférico, homogêneo com ausência de agregados. Os estudos in vivo desse trabalho foram aprovados pelo CEUA/UFRGS. Análise do plasma total e a utilização da microdiálise para determinação das concentrações plasmáticas e cerebrais livres foram realizadas após administração intravenosa da formulação de nanocápsulas de QTP (5 mg /kg ) (QLCN) ou do fármaco em solução (FQ) (5 mg /kg e 10 mg /kg) na presença e na ausência de 30 mg /kg de probenecida (PB), um inibidor de transportadores de membrana. Métodos validados foram utilizados para a quantificação do fármaco em diferentes matrizes. As concentrações cerebral e hepática totais foram investigadas através da técnica de homogeneizado de tecido. Além disso, a fração livre no plasma (fu) e a penetração nos eritrócitos também foi realizada. Resultados: QTP apresentou farmacocinética linear na faixa de doses investigadas, é um substrato para transportadores de efluxo na BHE. Diferenças foram observadas na fu da QTP até 2 h após administração de QLNC indicando que LNC do tipo III promove uma liberação sustentada do fármaco do carreador. QLNC não foi capaz de alterar o coeficiente de partição nos eritrócitos determinado in vitro. As concentrações cerebrais e hepáticas totais foram aumentadas após administração da formulação de nanocápsulas, porém, as concentrações cerebrais livres não foram alteradas em comparação com o QTP em solução. Após administração de PB o fator de penetração da QTP livre no cérebro foi reduzido de 1,55 ± 0.17 para 0,94 ± 0,15. Porém, essa inibição pela probenecida não teve efeito na penetração cerebral de QLNC (0,88 ± 0,21 – 0,92 ± 0.13) provavelmente devido ao fato da QTP ser carreada pela LNC e não estar disponível para interagir com transportadores. Conclusão: Considerando todos os resultados sugere-se que as LNC do tipo III carreiam a QTP através da circulação sistêmica até o parênquima cerebral. / Introduction: Blood-brain barrier (BBB) hinders the delivery of therapeutics to central nervous system due to the endothelial cells tight junctions, which restrict paracellular transport of substances, and the expression of influx and efflux transporters, which modulate drugs access to the brain. Lipid-core nanocapsules (LNC) have been proposed as drug carriers to improve brain delivery by modulating drug pharmacokinetics (PK). However, little in know about this modulation process and it is not clear whether the LCN carry the drug through the BBB or increase free drug penetration due to changes in the barrier permeability. Objective: The work aimed to investigate the alterations in the model drug quetiapine (QTP) plasma PK and brain penetration following nanoencapsulation into LNC (QLNC) using microdialysis. Methods: QLNC (1 mg.mL-1) were obtained by nanoprecipitation and presented small particle size (143 ± 6 nm), low polidispersion index (PI < 0.1), high incorporation efficiency (96%), negative zeta potential (–7.65 ± 0.815 mV) and acidic pH. TEM photomicrography showed spherically shaped particles and absence of aggregation. Animal studies approved by CEUA/UFRGS. Total plasma and free plasma and brain concentrations, last two determined by microdialysis, were analyzed after QLNC (5 mg/kg) and free drug (FQ – 5 and 10 mg/gk) i.v. dosing to Wistar rats alone or following probenecid (PB), an influx transporter inhibitor, i.v. administration (30 mg/kg). Drug was quantified in all matrices by validate LC/UV methods. Total brain and liver concentration after FQ and QLNC dosing were investigated in tissues homogenate. Furthermore, QTP free fraction (fu) in plasma and erythrocyte penetration were determined. Results: QTP presented linear PK in the dose range investigated and is substrate to influx transporters at the BBB. Differences observed on QTP fu up to 2 h after QLNC dosing indicate a drug slow release in the blood stream loaded into the LNC type III nanocarrier for this period of time. The LNC did not altered QTP erythrocytes partition coefficient. Total brain and liver concentrations were increased after QLNC dosing but free brain concentrations were not altered in comparison with FQ dosing. After PB dosing, QTP brain penetration was reduced from 1.55 ± 0.17 to 0.94 ± 0.15 when FQ was administered but the inhibition of influx transporters had no effect on QLNC brain penetration (0.88 ± 0.21 to 0.92 ± 0.13) probably because QTP is loaded into the LNC and not available to interact with transporters. Conclusions: Taking together these results suggested that LNC type III carries QTP in the blood stream and delivers the drug to the brain.

O objetivo desta tese foi desenvolver um modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) aplicável a avaliação de esquemas posológicos de antifúngicos sistêmicos no tratamento de infecções cerebrais associadas ao Cryptococcus neorformans. Inicialmente um modelo de infecção cerebral em ratos Wistar machos imunocompetentes foi estabelecido. Os animais foram inoculados a partir da administração iv de 1.106 UFC/mL na veia lateral caudal, de uma cepa de Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957). A presença da levedura em cérebro, pulmão, fígado, rins e coração foi avaliada após 7, 10 e 14 dias. Paralelamente foram investigados os parâmetros bioquímicos (contagem de leucócitos, TGO, TGP, uréia, creatinina, albumina e CK) e a permeabilidade vascular cerebral com azul de Evans. Após 10 dias de inoculação foi produzida uma infecção com características semelhantes a doença em humanos. C. neoformans esteve presente em todos os tecidos investigados pelas análises histológicas e microbiológicas e diferenças nos níveis de albumina, ureia, TGP e CK, alteração no número de leucócitos (monócitos e neutrófilos) e elevação da permeabilidade cerebral ao azul de Evans foram observadas nos animais infectados. Após estabelecida e caracterizada a infecção, foi avaliada a farmacocinética plasmática e tecidual cerebral através da técnica de microdiálise, do fluconazol (FLU) (20 mg/kg, i.v. bolus) e do voriconazol (VRC) (5 mg/kg, i.v. bolus) em ratos Wistar sadios (n = 13) e infectados (n = 13). De posse dos dados das concentrações plasmáticas e teciduais vs tempo dos grupos sadios e infectados construiu-se um modelo farmacocinético populacional (PopPK) para cada fármaco investigado. A penetração cerebral do VRC demonstrou-se elevada nos animais infectados (fTsadios = 0,85 vs fTinfectados = 1,86). O modelo PopPK de dois compartimentos e eliminação por Michaelis Menten descreveu o perfil de concentrações versus tempo de VRC em plasma e tecido, simultaneamente. A covariável infecção foi incluída em V2 e VM. Observou-se o grande potencial do VRC para tratar meningite associada a C. neoformans, pois os níveis alcançados em tecidos infectados foram superiores aos valores descritos para CIM de VRC contra C. neoformans (0,03 - 0,5 μg/mL). A farmacocinética do FLC foi descrita através de um modelo PopPK de dois compartimentos com eliminação linear incluindo dados de concentrações plasmáticas e livres cerebrais para ambos os grupos investigados. Nesse modelo a covariável infecção foi atribuída ao parâmetro k21 e covariável peso foi atribuída aos parâmetros V1 e V2. De posse desse modelo popPK, foram investigados os desfechos farmacodinâmicos considerando o nível de exposição cerebral nas doses de 125 e 250 mg/kg para ratos e 400-2000 mg para humanos observado em tecido sadio e infectado através da probabilidade de atingir o alvo terapêutico (PTA - fASC/CIM = 389) do FLC usando simulações de Monte Carlo. Essas simulações demonstraram um uso limitado de fluconazol em monoterapia para o tratamento de meningite por C. neoformans. Após a etapa farmacocinética procederam-se os estudos farmacodinâmicos através da metologia de curvas de morte em função do tempo do fluconazol e voriconazol frente a C. neoformans. Os dados da curva de morte foram modelados adequadamente com o modelo PK-PD de Emax modificado incluindo um termo de atraso de crescimento. A CIM foi determinada para ambos os fármacos por microdiluição e os valores foram de 0,03 μg/mL para voriconazol e 0,5 μg/mL para fluconazol, indicando que esta cepa ATCC 28957 é sensível a ambos os fármacos. Os valores de k, EC50 e kmax foram determinados para vários múltiplos das CIM de cada fármaco (0,03×, 0,06×, 0,25×, 0,5×, 1× 4×, 16×, 32× e 64×). O valor médio de k foi de 0,38 h-1, EC50 foi de 1,26 ± 0,18 μg/mL e 0,32 ± 0,06 μg/mL e kmax foi de 0,95 ± 0,21 h-1 e 0,64 ± 0,12 h-1 para FLC e VRC, respectivamente. Por fim, de posse dos parâmetros calculados através do modelo PK-PD foram realizadas simulações dos desfechos de tratamento para meningite criptocócica no cenário clínico para ambos os fármacos após administração das doses 200 e 400 mg de voriconazol e 800 e 2000 mg de fluconazol por dez semanas. Através das simulações conclui-se que para fluconazol há 25% de insucesso na dose de 800 mg e 10% na dose de 2000 mg com um tempo médio de 3 semanas para erradicação da levedura. Para o voriconazol, o EC50 teve pouco impacto sobre a erradicação do fungo e, em todos os cenários foi observada uma erradicação completa do fungo em curto espaço de tempo (1 - 2 semanas). Os resultados incentivam o uso de voriconazol nos pacientes com meningite criptocócica e uma reavaliação do uso de fluconazol. / The aim of this thesis was to develop a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model for the evaluation of systemic antifungal dosing regimens for the treatment of brain infections associated with Cryptococcus neorformans. Firstly a model of brain infection in immunocompetent male Wistar rats was established. The animals were inoculated by intravenously administration of 1. 106 CFU/mL of Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957) into the tail lateral vein. The presence of yeasts in the brain, lung, the liver, kidneys and the heart was evaluated after 7, 10 and 14 days. The biochemical parameters (leucocytes counting, GOT, GPT, urea, creatinine, albumin and CK) and cerebral vascular permeability with Evans blue were investigated. After 10 days post inoculation an infection with characteristics similar in humans was produced. C. neoformans was present in all tissues investigated by histological and microbiological analyzes and differences in albumin, urea, GPT and CK levels, alterations in the number of leukocytes (monocytes and neutrophils), and elevation of cerebral permeability to Evans blue were observed in infected animals. After establishing and characterizing the infection, the plasma and cerebral tissue pharmacokinetics were evaluated by microdialysis after administration of fluconazole (FLU) (20 mg/kg, iv bolus) and voriconazole (VRC) (5 mg/kg, iv bolus) in healthy (n = 13) and infected Wistar rats (n = 13). A population pharmacokinetic model (PopPK) was build for each drug, based on data from plasma and tissue concentrations vs. time of healthy and infected groups. The brain penetration of voriconazole was shown to be high in infected animals (fThealthy = 0.85 vs fTinfected = 1.86) than in healthy ones. The two-compartment model with Michaelis Menten elimination best described the concentration of VRC in plasma and tissue. The covariate infection was included in V2 and VM. The great potential of voriconazole to treat meningitis associated with C. neoformans was observed, as the levels reached in infected tissues were higher than the values described for MIC against C. neoformans (0.03 - 0.5 μg/mL). The pharmacokinetics of FLC was described using a two-compartment model with linear elimination including data from plasma and brain free concentrations for both groups investigated. In this model the covariate infection was attributed to parameter k21 and covariate weight was assigned to parameters V1 and V2. With this popPK model, the pharmacodynamic outcomes were investigated considering the level of brain exposure at doses of 125 and 250 mg/kg for rats and 400 - 2000 mg for humans observed in healthy and infected tissue through the probability of attaining the target (PTA - fAUC/MIC = 389) of fluconazole using Monte Carlo simulations. These simulations demonstrated limited use of fluconazole in monotherapy for the treatment of C. neoformans meningitis. After the pharmacokinetics modeling, the pharmacodynamic studies were carried out using the methodology of time-kill curves of fluconazole and voriconazole versus C. neoformans. The kill curves data were suitably modeled with the modified Emax PK-PD model including a growth delay term. MIC was determined for both drugs by microdilution and values were 0.03 μg.mL-1 for voriconazole and 0.5 μg.mL-1 for fluconazole, indicating that this ATCC 28957 strain is sensitive to both drugs. The values of k, EC50 and kmax were determined for several MIC multiples of each drug (0.03 ×, 0.06 ×, 0.25 ×, 0,5×, 1 × 4 ×, 16 ×, 32 × and 64 ×). The mean value of k was 0.38 h-1, EC50 was 1.26 ± 0.18 μg.mL-1 and 0.32 ± 0.06 μg.mL-1 and kmax was 0.95 ± 0.21 h -1 and 0.64 ± 0.12 h-1 for FLC and VRC, respectively. Finally, the parameters obtained using the PK-PD model were used to simulate treatment outcomes for cryptococcal meningitis in the clinical setting for both drugs after administration of 200 and 400 mg of voriconazole and 800 and 2000 mg of fluconazole for 10 weeks. By the simulations it is concluded that for fluconazole there is a 25% rate of failure at the dose of 800 mg and 10% at the dose of 2000 mg with an average time of 3 weeks for eradication of the yeast. For voriconazole, the EC50 had little impact on fungus eradication and, in all scenarios complete eradication of the fungus was observed in a short time (1 - 2 weeks). The results encourage the use of voriconazole in patients with cryptococcal meningitis and a reassessment of fluconazole use.

O objetivo desta tese foi desenvolver um modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) aplicável a avaliação de esquemas posológicos de antifúngicos sistêmicos no tratamento de infecções cerebrais associadas ao Cryptococcus neorformans. Inicialmente um modelo de infecção cerebral em ratos Wistar machos imunocompetentes foi estabelecido. Os animais foram inoculados a partir da administração iv de 1.106 UFC/mL na veia lateral caudal, de uma cepa de Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957). A presença da levedura em cérebro, pulmão, fígado, rins e coração foi avaliada após 7, 10 e 14 dias. Paralelamente foram investigados os parâmetros bioquímicos (contagem de leucócitos, TGO, TGP, uréia, creatinina, albumina e CK) e a permeabilidade vascular cerebral com azul de Evans. Após 10 dias de inoculação foi produzida uma infecção com características semelhantes a doença em humanos. C. neoformans esteve presente em todos os tecidos investigados pelas análises histológicas e microbiológicas e diferenças nos níveis de albumina, ureia, TGP e CK, alteração no número de leucócitos (monócitos e neutrófilos) e elevação da permeabilidade cerebral ao azul de Evans foram observadas nos animais infectados. Após estabelecida e caracterizada a infecção, foi avaliada a farmacocinética plasmática e tecidual cerebral através da técnica de microdiálise, do fluconazol (FLU) (20 mg/kg, i.v. bolus) e do voriconazol (VRC) (5 mg/kg, i.v. bolus) em ratos Wistar sadios (n = 13) e infectados (n = 13). De posse dos dados das concentrações plasmáticas e teciduais vs tempo dos grupos sadios e infectados construiu-se um modelo farmacocinético populacional (PopPK) para cada fármaco investigado. A penetração cerebral do VRC demonstrou-se elevada nos animais infectados (fTsadios = 0,85 vs fTinfectados = 1,86). O modelo PopPK de dois compartimentos e eliminação por Michaelis Menten descreveu o perfil de concentrações versus tempo de VRC em plasma e tecido, simultaneamente. A covariável infecção foi incluída em V2 e VM. Observou-se o grande potencial do VRC para tratar meningite associada a C. neoformans, pois os níveis alcançados em tecidos infectados foram superiores aos valores descritos para CIM de VRC contra C. neoformans (0,03 - 0,5 μg/mL). A farmacocinética do FLC foi descrita através de um modelo PopPK de dois compartimentos com eliminação linear incluindo dados de concentrações plasmáticas e livres cerebrais para ambos os grupos investigados. Nesse modelo a covariável infecção foi atribuída ao parâmetro k21 e covariável peso foi atribuída aos parâmetros V1 e V2. De posse desse modelo popPK, foram investigados os desfechos farmacodinâmicos considerando o nível de exposição cerebral nas doses de 125 e 250 mg/kg para ratos e 400-2000 mg para humanos observado em tecido sadio e infectado através da probabilidade de atingir o alvo terapêutico (PTA - fASC/CIM = 389) do FLC usando simulações de Monte Carlo. Essas simulações demonstraram um uso limitado de fluconazol em monoterapia para o tratamento de meningite por C. neoformans. Após a etapa farmacocinética procederam-se os estudos farmacodinâmicos através da metologia de curvas de morte em função do tempo do fluconazol e voriconazol frente a C. neoformans. Os dados da curva de morte foram modelados adequadamente com o modelo PK-PD de Emax modificado incluindo um termo de atraso de crescimento. A CIM foi determinada para ambos os fármacos por microdiluição e os valores foram de 0,03 μg/mL para voriconazol e 0,5 μg/mL para fluconazol, indicando que esta cepa ATCC 28957 é sensível a ambos os fármacos. Os valores de k, EC50 e kmax foram determinados para vários múltiplos das CIM de cada fármaco (0,03×, 0,06×, 0,25×, 0,5×, 1× 4×, 16×, 32× e 64×). O valor médio de k foi de 0,38 h-1, EC50 foi de 1,26 ± 0,18 μg/mL e 0,32 ± 0,06 μg/mL e kmax foi de 0,95 ± 0,21 h-1 e 0,64 ± 0,12 h-1 para FLC e VRC, respectivamente. Por fim, de posse dos parâmetros calculados através do modelo PK-PD foram realizadas simulações dos desfechos de tratamento para meningite criptocócica no cenário clínico para ambos os fármacos após administração das doses 200 e 400 mg de voriconazol e 800 e 2000 mg de fluconazol por dez semanas. Através das simulações conclui-se que para fluconazol há 25% de insucesso na dose de 800 mg e 10% na dose de 2000 mg com um tempo médio de 3 semanas para erradicação da levedura. Para o voriconazol, o EC50 teve pouco impacto sobre a erradicação do fungo e, em todos os cenários foi observada uma erradicação completa do fungo em curto espaço de tempo (1 - 2 semanas). Os resultados incentivam o uso de voriconazol nos pacientes com meningite criptocócica e uma reavaliação do uso de fluconazol. / The aim of this thesis was to develop a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model for the evaluation of systemic antifungal dosing regimens for the treatment of brain infections associated with Cryptococcus neorformans. Firstly a model of brain infection in immunocompetent male Wistar rats was established. The animals were inoculated by intravenously administration of 1. 106 CFU/mL of Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957) into the tail lateral vein. The presence of yeasts in the brain, lung, the liver, kidneys and the heart was evaluated after 7, 10 and 14 days. The biochemical parameters (leucocytes counting, GOT, GPT, urea, creatinine, albumin and CK) and cerebral vascular permeability with Evans blue were investigated. After 10 days post inoculation an infection with characteristics similar in humans was produced. C. neoformans was present in all tissues investigated by histological and microbiological analyzes and differences in albumin, urea, GPT and CK levels, alterations in the number of leukocytes (monocytes and neutrophils), and elevation of cerebral permeability to Evans blue were observed in infected animals. After establishing and characterizing the infection, the plasma and cerebral tissue pharmacokinetics were evaluated by microdialysis after administration of fluconazole (FLU) (20 mg/kg, iv bolus) and voriconazole (VRC) (5 mg/kg, iv bolus) in healthy (n = 13) and infected Wistar rats (n = 13). A population pharmacokinetic model (PopPK) was build for each drug, based on data from plasma and tissue concentrations vs. time of healthy and infected groups. The brain penetration of voriconazole was shown to be high in infected animals (fThealthy = 0.85 vs fTinfected = 1.86) than in healthy ones. The two-compartment model with Michaelis Menten elimination best described the concentration of VRC in plasma and tissue. The covariate infection was included in V2 and VM. The great potential of voriconazole to treat meningitis associated with C. neoformans was observed, as the levels reached in infected tissues were higher than the values described for MIC against C. neoformans (0.03 - 0.5 μg/mL). The pharmacokinetics of FLC was described using a two-compartment model with linear elimination including data from plasma and brain free concentrations for both groups investigated. In this model the covariate infection was attributed to parameter k21 and covariate weight was assigned to parameters V1 and V2. With this popPK model, the pharmacodynamic outcomes were investigated considering the level of brain exposure at doses of 125 and 250 mg/kg for rats and 400 - 2000 mg for humans observed in healthy and infected tissue through the probability of attaining the target (PTA - fAUC/MIC = 389) of fluconazole using Monte Carlo simulations. These simulations demonstrated limited use of fluconazole in monotherapy for the treatment of C. neoformans meningitis. After the pharmacokinetics modeling, the pharmacodynamic studies were carried out using the methodology of time-kill curves of fluconazole and voriconazole versus C. neoformans. The kill curves data were suitably modeled with the modified Emax PK-PD model including a growth delay term. MIC was determined for both drugs by microdilution and values were 0.03 μg.mL-1 for voriconazole and 0.5 μg.mL-1 for fluconazole, indicating that this ATCC 28957 strain is sensitive to both drugs. The values of k, EC50 and kmax were determined for several MIC multiples of each drug (0.03 ×, 0.06 ×, 0.25 ×, 0,5×, 1 × 4 ×, 16 ×, 32 × and 64 ×). The mean value of k was 0.38 h-1, EC50 was 1.26 ± 0.18 μg.mL-1 and 0.32 ± 0.06 μg.mL-1 and kmax was 0.95 ± 0.21 h -1 and 0.64 ± 0.12 h-1 for FLC and VRC, respectively. Finally, the parameters obtained using the PK-PD model were used to simulate treatment outcomes for cryptococcal meningitis in the clinical setting for both drugs after administration of 200 and 400 mg of voriconazole and 800 and 2000 mg of fluconazole for 10 weeks. By the simulations it is concluded that for fluconazole there is a 25% rate of failure at the dose of 800 mg and 10% at the dose of 2000 mg with an average time of 3 weeks for eradication of the yeast. For voriconazole, the EC50 had little impact on fungus eradication and, in all scenarios complete eradication of the fungus was observed in a short time (1 - 2 weeks). The results encourage the use of voriconazole in patients with cryptococcal meningitis and a reassessment of fluconazole use.

O objetivo desta tese foi desenvolver um modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) aplicável a avaliação de esquemas posológicos de antifúngicos sistêmicos no tratamento de infecções cerebrais associadas ao Cryptococcus neorformans. Inicialmente um modelo de infecção cerebral em ratos Wistar machos imunocompetentes foi estabelecido. Os animais foram inoculados a partir da administração iv de 1.106 UFC/mL na veia lateral caudal, de uma cepa de Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957). A presença da levedura em cérebro, pulmão, fígado, rins e coração foi avaliada após 7, 10 e 14 dias. Paralelamente foram investigados os parâmetros bioquímicos (contagem de leucócitos, TGO, TGP, uréia, creatinina, albumina e CK) e a permeabilidade vascular cerebral com azul de Evans. Após 10 dias de inoculação foi produzida uma infecção com características semelhantes a doença em humanos. C. neoformans esteve presente em todos os tecidos investigados pelas análises histológicas e microbiológicas e diferenças nos níveis de albumina, ureia, TGP e CK, alteração no número de leucócitos (monócitos e neutrófilos) e elevação da permeabilidade cerebral ao azul de Evans foram observadas nos animais infectados. Após estabelecida e caracterizada a infecção, foi avaliada a farmacocinética plasmática e tecidual cerebral através da técnica de microdiálise, do fluconazol (FLU) (20 mg/kg, i.v. bolus) e do voriconazol (VRC) (5 mg/kg, i.v. bolus) em ratos Wistar sadios (n = 13) e infectados (n = 13). De posse dos dados das concentrações plasmáticas e teciduais vs tempo dos grupos sadios e infectados construiu-se um modelo farmacocinético populacional (PopPK) para cada fármaco investigado. A penetração cerebral do VRC demonstrou-se elevada nos animais infectados (fTsadios = 0,85 vs fTinfectados = 1,86). O modelo PopPK de dois compartimentos e eliminação por Michaelis Menten descreveu o perfil de concentrações versus tempo de VRC em plasma e tecido, simultaneamente. A covariável infecção foi incluída em V2 e VM. Observou-se o grande potencial do VRC para tratar meningite associada a C. neoformans, pois os níveis alcançados em tecidos infectados foram superiores aos valores descritos para CIM de VRC contra C. neoformans (0,03 - 0,5 μg/mL). A farmacocinética do FLC foi descrita através de um modelo PopPK de dois compartimentos com eliminação linear incluindo dados de concentrações plasmáticas e livres cerebrais para ambos os grupos investigados. Nesse modelo a covariável infecção foi atribuída ao parâmetro k21 e covariável peso foi atribuída aos parâmetros V1 e V2. De posse desse modelo popPK, foram investigados os desfechos farmacodinâmicos considerando o nível de exposição cerebral nas doses de 125 e 250 mg/kg para ratos e 400-2000 mg para humanos observado em tecido sadio e infectado através da probabilidade de atingir o alvo terapêutico (PTA - fASC/CIM = 389) do FLC usando simulações de Monte Carlo. Essas simulações demonstraram um uso limitado de fluconazol em monoterapia para o tratamento de meningite por C. neoformans. Após a etapa farmacocinética procederam-se os estudos farmacodinâmicos através da metologia de curvas de morte em função do tempo do fluconazol e voriconazol frente a C. neoformans. Os dados da curva de morte foram modelados adequadamente com o modelo PK-PD de Emax modificado incluindo um termo de atraso de crescimento. A CIM foi determinada para ambos os fármacos por microdiluição e os valores foram de 0,03 μg/mL para voriconazol e 0,5 μg/mL para fluconazol, indicando que esta cepa ATCC 28957 é sensível a ambos os fármacos. Os valores de k, EC50 e kmax foram determinados para vários múltiplos das CIM de cada fármaco (0,03×, 0,06×, 0,25×, 0,5×, 1× 4×, 16×, 32× e 64×). O valor médio de k foi de 0,38 h-1, EC50 foi de 1,26 ± 0,18 μg/mL e 0,32 ± 0,06 μg/mL e kmax foi de 0,95 ± 0,21 h-1 e 0,64 ± 0,12 h-1 para FLC e VRC, respectivamente. Por fim, de posse dos parâmetros calculados através do modelo PK-PD foram realizadas simulações dos desfechos de tratamento para meningite criptocócica no cenário clínico para ambos os fármacos após administração das doses 200 e 400 mg de voriconazol e 800 e 2000 mg de fluconazol por dez semanas. Através das simulações conclui-se que para fluconazol há 25% de insucesso na dose de 800 mg e 10% na dose de 2000 mg com um tempo médio de 3 semanas para erradicação da levedura. Para o voriconazol, o EC50 teve pouco impacto sobre a erradicação do fungo e, em todos os cenários foi observada uma erradicação completa do fungo em curto espaço de tempo (1 - 2 semanas). Os resultados incentivam o uso de voriconazol nos pacientes com meningite criptocócica e uma reavaliação do uso de fluconazol. / The aim of this thesis was to develop a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model for the evaluation of systemic antifungal dosing regimens for the treatment of brain infections associated with Cryptococcus neorformans. Firstly a model of brain infection in immunocompetent male Wistar rats was established. The animals were inoculated by intravenously administration of 1. 106 CFU/mL of Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957) into the tail lateral vein. The presence of yeasts in the brain, lung, the liver, kidneys and the heart was evaluated after 7, 10 and 14 days. The biochemical parameters (leucocytes counting, GOT, GPT, urea, creatinine, albumin and CK) and cerebral vascular permeability with Evans blue were investigated. After 10 days post inoculation an infection with characteristics similar in humans was produced. C. neoformans was present in all tissues investigated by histological and microbiological analyzes and differences in albumin, urea, GPT and CK levels, alterations in the number of leukocytes (monocytes and neutrophils), and elevation of cerebral permeability to Evans blue were observed in infected animals. After establishing and characterizing the infection, the plasma and cerebral tissue pharmacokinetics were evaluated by microdialysis after administration of fluconazole (FLU) (20 mg/kg, iv bolus) and voriconazole (VRC) (5 mg/kg, iv bolus) in healthy (n = 13) and infected Wistar rats (n = 13). A population pharmacokinetic model (PopPK) was build for each drug, based on data from plasma and tissue concentrations vs. time of healthy and infected groups. The brain penetration of voriconazole was shown to be high in infected animals (fThealthy = 0.85 vs fTinfected = 1.86) than in healthy ones. The two-compartment model with Michaelis Menten elimination best described the concentration of VRC in plasma and tissue. The covariate infection was included in V2 and VM. The great potential of voriconazole to treat meningitis associated with C. neoformans was observed, as the levels reached in infected tissues were higher than the values described for MIC against C. neoformans (0.03 - 0.5 μg/mL). The pharmacokinetics of FLC was described using a two-compartment model with linear elimination including data from plasma and brain free concentrations for both groups investigated. In this model the covariate infection was attributed to parameter k21 and covariate weight was assigned to parameters V1 and V2. With this popPK model, the pharmacodynamic outcomes were investigated considering the level of brain exposure at doses of 125 and 250 mg/kg for rats and 400 - 2000 mg for humans observed in healthy and infected tissue through the probability of attaining the target (PTA - fAUC/MIC = 389) of fluconazole using Monte Carlo simulations. These simulations demonstrated limited use of fluconazole in monotherapy for the treatment of C. neoformans meningitis. After the pharmacokinetics modeling, the pharmacodynamic studies were carried out using the methodology of time-kill curves of fluconazole and voriconazole versus C. neoformans. The kill curves data were suitably modeled with the modified Emax PK-PD model including a growth delay term. MIC was determined for both drugs by microdilution and values were 0.03 μg.mL-1 for voriconazole and 0.5 μg.mL-1 for fluconazole, indicating that this ATCC 28957 strain is sensitive to both drugs. The values of k, EC50 and kmax were determined for several MIC multiples of each drug (0.03 ×, 0.06 ×, 0.25 ×, 0,5×, 1 × 4 ×, 16 ×, 32 × and 64 ×). The mean value of k was 0.38 h-1, EC50 was 1.26 ± 0.18 μg.mL-1 and 0.32 ± 0.06 μg.mL-1 and kmax was 0.95 ± 0.21 h -1 and 0.64 ± 0.12 h-1 for FLC and VRC, respectively. Finally, the parameters obtained using the PK-PD model were used to simulate treatment outcomes for cryptococcal meningitis in the clinical setting for both drugs after administration of 200 and 400 mg of voriconazole and 800 and 2000 mg of fluconazole for 10 weeks. By the simulations it is concluded that for fluconazole there is a 25% rate of failure at the dose of 800 mg and 10% at the dose of 2000 mg with an average time of 3 weeks for eradication of the yeast. For voriconazole, the EC50 had little impact on fungus eradication and, in all scenarios complete eradication of the fungus was observed in a short time (1 - 2 weeks). The results encourage the use of voriconazole in patients with cryptococcal meningitis and a reassessment of fluconazole use.