As plantas superiores sintetizam uma ampla variedade de compostos, denominados classicamente metabólitos secundários, que as ajudam a se adaptar ao seu ambiente. Um subconjunto de metabólitos secundários são os alcalóides. Essas substâncias nitrogenadas de baixo peso molecular desempenham funções variadas nas plantas, podendo apresentar propriedades antibióticas, repelentes de herbívoros ou alelopáticas. O alcalóide monoterpeno indólico braquicerina, de estrutura inédita, foi extraído da planta arbustiva Psychotria brachyceras (Rubiaceae). Esse composto revelou ação específica como antiinflamatório em testes de quimiotaxia, possuindo, portanto, potencial valor farmacológico. Trabalhos anteriores revelaram que a molécula possui significativas propriedades antioxidantes e antimutagênicas, e que a concentração foliar desse alcalóide é induzida por dano mecânico e radiação ultravioleta (UV). Neste trabalho, demonstramos os resultados de uma série de experimentos desenvolvidos com o objetivo de entender o papel de braquicerina em P. brachyceras frente a esses estresses. Uma parte dos experimentos foi desenvolvida paralelamente com amostras de Psychotria carthagenensis da mesma região, que não acumula alcalóides e é mais sensível a UV do que P. brachyceras, além de ser alvo significativo de herbívoros em seu ambiente natural. O comportamento de algumas classes de metabólitos secundários reconhecidas como importantes na resposta a ferimento e radiação UV é descrito em amostras de P. brachyceras submetidas a esses tratamentos. A aplicação de dano mecânico e de radiação ultravioleta não alterou os níveis de compostos fenólicos e flavonóides totais, respectivamente. A única classe de metabólitos que sofreu regulação nessas condições foram antocianinas, que tiveram sua concentração induzida em experimentos de exposição à UV; porém, os teores induzidos em P. brachyceras foram muito menores do que àqueles basais em P. carthagenensis. Os dados sugerem um papel predominante do alcalóide frente a esses estresses. O potencial tóxico/repelente da braquicerina foi testado em bioensaios que utilizaram herbívoros generalistas. O alcalóide isolado não foi capaz de inibir o consumo das amostras pelos animais, o mesmo ocorrendo com extratos de P. brachyceras. Porém, extratos de P. carthagenensis inibiram a alimentação do molusco Helix aspersa, provavelmente pela presença de taninos. A atividade protetora do alcalóide foi testada em discos foliares de P. carthagenensis expostos à UV. A aplicação de braquicerina diminuiu a degradação de clorofilas causada pela radiação. Ensaios de atividade antioxidante in vitro e in vivo demostraram que o alcalóide é ativo em relação ao ânion superóxido e ao peróxido de hidrogênio, espécies ativas de oxigênio importantes no estresse por ultravioleta e dano mecânico, respectivamente. Além disso, foi verificado que epidermes foliares acumulam braquicerina. Os dados sugerem uma atividade predominantemente antioxidante ou moduladora de estresse oxidativo para o alcalóide. Essa atividade de detoxificação pode fazer parte de uma estratégia de tolerância da planta tanto em relação ao ultravioleta quanto ao ferimento/herbivoria e pode ser importante em outras condições adversas. / Higher plants synthesize a wide range of compounds, classically known as secondary metabolites, which help plants adapt to their environment. A class of secondary metabolites are the alkaloids. These nitrogen-containing low molecular weight substances play several roles in plants as antimicrobial, herbivore deterrents or allelopathic agents. The monoterpene indole alkaloid brachycerine, which has a unique structure, was extracted from the shrub Psychotria brachyceras (Rubiaceae). This compound showed antinflamatory activity in chemotaxis assays, indicative of pharmacological potential. Previous work described antioxidant and antimutagenic effects for brachycerine, and the regulation of its leaf tissue concentration upon ultraviolet (UV) radiation exposure and mechanical damage stress. In this thesis, we report the data from a series of experiments in an attempt to understand the roles of brachycerine in P. brachyceras with regard to wounding and UV stresses. Some experiments were carried on using samples from Psychotria carthagenensis shrubs of the same region, a plant devoid of detectable alkaloids. P. carthagenensis leaves are UV-sensitive if compared to P. brachyceras and are often found damaged by herbivores in field-grown plants. The contents of secondary metabolites with known functions in wounding and UV responses are described from experiments in which P. brachyceras samples were submitted to these treatments. The only group of secondary metabolites regulated by these stresses was that of anthocyanins in UV treated samples; however, induced content of these metabolites were always much lower than the basal ones in P. carthagenensis. The data indicated a major role for brachycerine in UV and wound responses. Toxic/deterrent properties of brachycerine were tested in bioassays with generalist herbivores. The alkaloid failed to deter herbivore feeding, however, samples treated with P. carthagenensis extracts were less consumed by the snail Helix aspersa, and this may be due to the presence of tannins. UV-protecting activity was tested in brachycerine-treated P. carthagenensis leaf disks exposed to UV radiation. Brachycerine treatment protected disk samples from UV-driven chlorophyll loss. In vitro and in vivo assays detected antioxidant activity of brachycerine towards superoxide anion and hydrogen peroxide, reactive oxygen species related to UV and wounding stress, respectively. In addition, it was shown that leaf epidermal layers accumulate brachycerin. The results suggest an antioxidant or oxidative stress modulator role for brachycerine in P. brachyceras. This detoxifying activity may be part of a tolerance strategy in relation to UV and wounding stresses, and perhaps to other environmental pressures.

Embora o ferro seja um dos elementos mais abundantes na crosta terrestre, somente uma pequena fração está disponível para ser utilizada pelos organismos vivos. A solubilidade do ferro em solos com pH neutro é muito baixa, aproximadamente 10-18 M. Em condições de baixa disponibilidade de ferro, diversos microrganismos podem produzir e excretar sideróforos, quelantes orgânicos de baixo peso molecular envolvidos na solubilização e seqüestro de Fe3+. A captação de ferro é fator limitante para a fixação biológica do nitrogênio, uma vez que esse elemento está diretamente envolvido em moléculas como a nitrogenase, leg-hemoglobina, ferredoxina e citocromos. Enquanto microrganismos de vida-livre, os rizóbios devem ser capazes de solubilizar ferro e competir por ele no solo. As bactérias pertencentes ao gênero Bradyrhizobium são de grande relevância agronômica devido à capacidade de fixar nitrogênio em simbiose com diversas leguminosas, especialmente a soja [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii são duas espécies capazes de nodular soja e quatro estirpes são comumente utilizadas como inoculantes no Brasil: B. elkanii SEMIA 587 e SEMIA 5019 e B. japonicum SEMIA 5079 e SEMIA 5080. Os genes fegA e fhuA, relacionados à síntese de proteínas de membrana transportadoras do complexo Fe3+ - sideróforo já foram identificados em B. japonicum 61A152 e Rhizobium leguminosarum, respectivamente. Ao contrário de B. japonicum, nada se conhece sobre esses genes na espécie B. elkanii. No presente trabalho foram analisadas a habilidade em produzir sideróforos e a presença de genes relacionados à síntese de proteínas receptoras do complexo Fe3+ - sideróforo entre diferentes estirpes de Bradyrhizobium. Uma porção do gene fhuA de B. elkanii foi isolada e apresentou um elevado grau de conservação com outros genes relacionados à captação de sideróforos em diferentes bactérias. Experimentos de Southern-blot demonstraram que existe apenas uma cópia do gene fhuA, e nenhuma do gene fegA, no genoma da estirpe SEMIA 587 de B. elkanii. Através do tradicional método CAS, a capacidade de produzir e captar sideróforos in vitro foi confirmada entre as estirpes de B. elkanii utilizadas como inoculantes comerciais no Brasil. As linhagens de B. japonicum, entretanto, mesmo possuindo receptores de membrana específicos para sideróforos, não são capazes de se multiplicar em meio de cultura deficiente em ferro. Tais resultados indicam a possibilidade de diferenças significativas quanto ao sistema de captação de ferro entre tais estirpes. Estudos que confirmem a função do gene fhuA estão sendo conduzidos para verificação da viabilidade fenotípica de B. elkanii mutante para esse gene. / Although iron is one of the most abundant elements in Earth, only one small fraction is available to be used by living organisms. The solubility of iron in soils with neutral pH is very low, approximately 10-18 M. During iron deficiency, many microorganisms can produce and excrete low molecular weight organic chelators termed siderophores involved in the solubilization and sequestration of Fe3+. The iron uptake is a limiting factor for the biological nitrogen fixation as iron is directly involved in many molecules that are essential to this process, like nitrogenase, leg-hemoglobin, ferredoxin and cytochrome. While free-living microorganism, rhizobia should be able to solubilize iron and compete for it in soil. Bacteria belonging to the genus Bradyrhizobium are of enormous agricultural value since they are able to fix atmospheric nitrogen in symbiosis with several leguminous plants, especially soybean [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii strains are two species capable of nodulate soybean, in which four strains are commonly used as inoculant in Brazil: B. elkanii SEMIA 587 and SEMIA 5019 and B. japonicum SEMIA 5079 and SEMIA 5080. In B. japonicum 61A152 and Rhizobium leguminosarum fegA and fhuA genes, which are involved in the synthesis of membrane Fe3+-siderophore uptake proteins were already identified, respectively. In the opposite, almost nothing is known about these genes in B. elkanii species. In this work the siderophore production ability and the presence of genes related to the membrane Fe3+- siderophore uptake were analyzed in several Bradyrhizobium strains. A B. elkanii fhuA DNA region was isolated and it presented a high level of homology with others siderophore uptake related genes from different bacterial species. Southern blot experiments shown that there is a single fhuA gene copy in the B. elkanii SEMIA 587 genome, and no fegA gene was identified in this genome. Through the traditional CAS methodology, the siderophore production and uptake in vitro activities were demonstrated in the B. elkanii strains used as inoculant in Brazil. B. japonicum strains, however, although having siderophores specific membrane receptors, were not able to growth in a medium lacking iron. Such results indicated that significant differences concerning iron uptake system might exist between these two bacterial species. Studies to confirm fhuA gene function are under way aiming to verify the phenotypic viability of B. elkanii fhuA mutants.

O estresse de calor prejudica o crescimento e reprodução dos organismos vegetais, ao alterar a permeabilidade de membranas biológicas e desnaturar proteínas, limitando o metabolismo primário. Dentre as respostas ao estresse abiótico, está a síntese de metabólitos secundários. Braquicerina é um alcaloide monoterpeno indólico com ação antioxidante, protetora contra UV e antimutagênica sintetizado por partes aéreas de Psychotria brachyceras. O objetivo deste trabalho é investigar o metabolismo de braquicerina sob estresse de calor. Assim, espera-se contribuir para o conhecimento acerca do metabolismo secundário nas respostas ao estresse de calor, descrever a função in planta do composto, e fornecer ferramentas para obtenção do alcaloide para fins farmacêuticos. O acúmulo de braquicerina foi induzido em discos foliares mantidos a 40ºC por três dias, tanto em regime de elevação abrupta como gradual da temperatura. Baixa temperatura (10ºC) não afetou o acúmulo do alcaloide. Discos foliares de Psychotria carthagenensis, uma espécie que não sintetiza alcaloides monoterpeno indólicos, foram também desafiados por estresse de calor. Clorofila total, teor de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica foram quantificados em ambas as espécies. P. carthagenensis foi relativamente tolerante ao calor, o que pode estar relacionado à sua elevada concentração de antocianinas, fortemente induzidas por choque térmico de 50ºC por 6h. Peroxidação lipídica foi reduzida nas amostras de P. brachyceras sob estresse de calor agudo ou gradual em comparação à condição controle, sendo este parâmetro inalterado nas duas condições em P. carthagenensis. O teor de peróxido de hidrogênio foi menor em P. brachyceras submetida a choque de térmico em relação ao controle, enquanto o mesmo parâmetro não foi alterado em P. carthagenensis. Discos foliares das espécies sensíveis ao calor Brugmansia suaveolens e Brassica oleracea, pré-tratadas com braquicerina em concentrações similares às encontradas em P. brachyceras, adquiriram fenótipo tolerante ao choque térmico. A expressão do gene que codifica a enzima triptofano descarboxilase (TDC), envolvida na biossíntese de braquicerina em P. brachyceras, foi fortemente inibida em discos foliares submetidos à 40ºC por 6h, 12h e 24h, sugerindo que o efeito da temperatura na estimulação de acúmulo de alcaloide ocorra em nível pós-transcricional. Em conjunto, os dados indicam que a exposição ao calor é um meio efetivo de aumentar o rendimento de braquicerina, cuja acumulação contribui para proteção contra os danos oxidativos associados. / Heat stress impairs plant growth and reproduction by altering membrane permeability and promoting protein denaturation, which limits primary metabolism. Secondary metabolites often take part in protection against abiotic stress responses. Brachycerine is a monoterpene indole alkaloid with antioxidant, UV protectant, and antimutagenic activity synthesized by Psychotria brachyceras shoots. Brachycerine metabolism was analyzed under heat stress, in order to shed light on brachycerine‘s in planta function and to provide potential tools to improve alkaloid yields for pharmaceutical analysis. Accumulation was induced in leaf disks kept at 40ºC for three days, both by abrupt and stepwise temperature increase. Brachycerine concentration was not affected by low temperature (10ºC) exposure. Leaf disks of Psychotria carthagenensis, a species devoided of alkaloids, were also challenged by heat. Total chlorophyll, hydrogen peroxide and lipid peroxidation concentrations were determined in both species. P. carthagenensis was relatively tolerant to heat treatments which may be explained by its high anthocyanin concentration, strongly induced by heat shock of 50ºC for 6h. Brugmansia suaveolens and Brassica oleracea, pre-treated with brachycerine in concentrations equivalent to those found in P. brachyceras, had a heat shock tolerant phenotype, based on chlorophyll content. Expression of the TRYPTOPHAN DECARBOXYLASE gene, which encodes for an enzyme involved in alkaloid biosynthesis (TDC) was strongly repressed in leaf disks exposed to 40ºC for 6h, 12h e 24h, suggesting that temperature effect may occur at post-transcriptional level. Taken together, data indicate that heat exposure is an effective means to increase yields of brachycerine, whose accumulation contributes to protect against associated oxidative damage.

O estresse de calor prejudica o crescimento e reprodução dos organismos vegetais, ao alterar a permeabilidade de membranas biológicas e desnaturar proteínas, limitando o metabolismo primário. Dentre as respostas ao estresse abiótico, está a síntese de metabólitos secundários. Braquicerina é um alcaloide monoterpeno indólico com ação antioxidante, protetora contra UV e antimutagênica sintetizado por partes aéreas de Psychotria brachyceras. O objetivo deste trabalho é investigar o metabolismo de braquicerina sob estresse de calor. Assim, espera-se contribuir para o conhecimento acerca do metabolismo secundário nas respostas ao estresse de calor, descrever a função in planta do composto, e fornecer ferramentas para obtenção do alcaloide para fins farmacêuticos. O acúmulo de braquicerina foi induzido em discos foliares mantidos a 40ºC por três dias, tanto em regime de elevação abrupta como gradual da temperatura. Baixa temperatura (10ºC) não afetou o acúmulo do alcaloide. Discos foliares de Psychotria carthagenensis, uma espécie que não sintetiza alcaloides monoterpeno indólicos, foram também desafiados por estresse de calor. Clorofila total, teor de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica foram quantificados em ambas as espécies. P. carthagenensis foi relativamente tolerante ao calor, o que pode estar relacionado à sua elevada concentração de antocianinas, fortemente induzidas por choque térmico de 50ºC por 6h. Peroxidação lipídica foi reduzida nas amostras de P. brachyceras sob estresse de calor agudo ou gradual em comparação à condição controle, sendo este parâmetro inalterado nas duas condições em P. carthagenensis. O teor de peróxido de hidrogênio foi menor em P. brachyceras submetida a choque de térmico em relação ao controle, enquanto o mesmo parâmetro não foi alterado em P. carthagenensis. Discos foliares das espécies sensíveis ao calor Brugmansia suaveolens e Brassica oleracea, pré-tratadas com braquicerina em concentrações similares às encontradas em P. brachyceras, adquiriram fenótipo tolerante ao choque térmico. A expressão do gene que codifica a enzima triptofano descarboxilase (TDC), envolvida na biossíntese de braquicerina em P. brachyceras, foi fortemente inibida em discos foliares submetidos à 40ºC por 6h, 12h e 24h, sugerindo que o efeito da temperatura na estimulação de acúmulo de alcaloide ocorra em nível pós-transcricional. Em conjunto, os dados indicam que a exposição ao calor é um meio efetivo de aumentar o rendimento de braquicerina, cuja acumulação contribui para proteção contra os danos oxidativos associados. / Heat stress impairs plant growth and reproduction by altering membrane permeability and promoting protein denaturation, which limits primary metabolism. Secondary metabolites often take part in protection against abiotic stress responses. Brachycerine is a monoterpene indole alkaloid with antioxidant, UV protectant, and antimutagenic activity synthesized by Psychotria brachyceras shoots. Brachycerine metabolism was analyzed under heat stress, in order to shed light on brachycerine‘s in planta function and to provide potential tools to improve alkaloid yields for pharmaceutical analysis. Accumulation was induced in leaf disks kept at 40ºC for three days, both by abrupt and stepwise temperature increase. Brachycerine concentration was not affected by low temperature (10ºC) exposure. Leaf disks of Psychotria carthagenensis, a species devoided of alkaloids, were also challenged by heat. Total chlorophyll, hydrogen peroxide and lipid peroxidation concentrations were determined in both species. P. carthagenensis was relatively tolerant to heat treatments which may be explained by its high anthocyanin concentration, strongly induced by heat shock of 50ºC for 6h. Brugmansia suaveolens and Brassica oleracea, pre-treated with brachycerine in concentrations equivalent to those found in P. brachyceras, had a heat shock tolerant phenotype, based on chlorophyll content. Expression of the TRYPTOPHAN DECARBOXYLASE gene, which encodes for an enzyme involved in alkaloid biosynthesis (TDC) was strongly repressed in leaf disks exposed to 40ºC for 6h, 12h e 24h, suggesting that temperature effect may occur at post-transcriptional level. Taken together, data indicate that heat exposure is an effective means to increase yields of brachycerine, whose accumulation contributes to protect against associated oxidative damage.

O estresse de calor prejudica o crescimento e reprodução dos organismos vegetais, ao alterar a permeabilidade de membranas biológicas e desnaturar proteínas, limitando o metabolismo primário. Dentre as respostas ao estresse abiótico, está a síntese de metabólitos secundários. Braquicerina é um alcaloide monoterpeno indólico com ação antioxidante, protetora contra UV e antimutagênica sintetizado por partes aéreas de Psychotria brachyceras. O objetivo deste trabalho é investigar o metabolismo de braquicerina sob estresse de calor. Assim, espera-se contribuir para o conhecimento acerca do metabolismo secundário nas respostas ao estresse de calor, descrever a função in planta do composto, e fornecer ferramentas para obtenção do alcaloide para fins farmacêuticos. O acúmulo de braquicerina foi induzido em discos foliares mantidos a 40ºC por três dias, tanto em regime de elevação abrupta como gradual da temperatura. Baixa temperatura (10ºC) não afetou o acúmulo do alcaloide. Discos foliares de Psychotria carthagenensis, uma espécie que não sintetiza alcaloides monoterpeno indólicos, foram também desafiados por estresse de calor. Clorofila total, teor de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica foram quantificados em ambas as espécies. P. carthagenensis foi relativamente tolerante ao calor, o que pode estar relacionado à sua elevada concentração de antocianinas, fortemente induzidas por choque térmico de 50ºC por 6h. Peroxidação lipídica foi reduzida nas amostras de P. brachyceras sob estresse de calor agudo ou gradual em comparação à condição controle, sendo este parâmetro inalterado nas duas condições em P. carthagenensis. O teor de peróxido de hidrogênio foi menor em P. brachyceras submetida a choque de térmico em relação ao controle, enquanto o mesmo parâmetro não foi alterado em P. carthagenensis. Discos foliares das espécies sensíveis ao calor Brugmansia suaveolens e Brassica oleracea, pré-tratadas com braquicerina em concentrações similares às encontradas em P. brachyceras, adquiriram fenótipo tolerante ao choque térmico. A expressão do gene que codifica a enzima triptofano descarboxilase (TDC), envolvida na biossíntese de braquicerina em P. brachyceras, foi fortemente inibida em discos foliares submetidos à 40ºC por 6h, 12h e 24h, sugerindo que o efeito da temperatura na estimulação de acúmulo de alcaloide ocorra em nível pós-transcricional. Em conjunto, os dados indicam que a exposição ao calor é um meio efetivo de aumentar o rendimento de braquicerina, cuja acumulação contribui para proteção contra os danos oxidativos associados. / Heat stress impairs plant growth and reproduction by altering membrane permeability and promoting protein denaturation, which limits primary metabolism. Secondary metabolites often take part in protection against abiotic stress responses. Brachycerine is a monoterpene indole alkaloid with antioxidant, UV protectant, and antimutagenic activity synthesized by Psychotria brachyceras shoots. Brachycerine metabolism was analyzed under heat stress, in order to shed light on brachycerine‘s in planta function and to provide potential tools to improve alkaloid yields for pharmaceutical analysis. Accumulation was induced in leaf disks kept at 40ºC for three days, both by abrupt and stepwise temperature increase. Brachycerine concentration was not affected by low temperature (10ºC) exposure. Leaf disks of Psychotria carthagenensis, a species devoided of alkaloids, were also challenged by heat. Total chlorophyll, hydrogen peroxide and lipid peroxidation concentrations were determined in both species. P. carthagenensis was relatively tolerant to heat treatments which may be explained by its high anthocyanin concentration, strongly induced by heat shock of 50ºC for 6h. Brugmansia suaveolens and Brassica oleracea, pre-treated with brachycerine in concentrations equivalent to those found in P. brachyceras, had a heat shock tolerant phenotype, based on chlorophyll content. Expression of the TRYPTOPHAN DECARBOXYLASE gene, which encodes for an enzyme involved in alkaloid biosynthesis (TDC) was strongly repressed in leaf disks exposed to 40ºC for 6h, 12h e 24h, suggesting that temperature effect may occur at post-transcriptional level. Taken together, data indicate that heat exposure is an effective means to increase yields of brachycerine, whose accumulation contributes to protect against associated oxidative damage.