Kyoto University (京都大学) / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第13852号 / 工博第2956号 / 新制||工||1436(附属図書館) / 26068 / UT51-2008-C768 / 京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻 / (主査)教授 今中 忠行, 教授 青山 安宏, 教授 森 泰生 / 学位規則第4条第1項該当

<p>Two experimentswere  conducted  using  pigs  at different  life stages to  determine  the  effects  of dietary  tryptophan  and  water  delivered  oregano  essential  oil  on growth performance, rectal temperature, water use,intestinal integrity and gene expression of biomarkers in the face heat or transport stress. In the first experiment, 192 grow-finish pigs were used to investigate the effects of  water  supplementation  of  oregano  essential  oil  (OEO)  on  growth  performance,  water  intake, rectal temperature, intestinal integrity, and expression of genetic biomarkers during an acute heat challenge. Pigs were randomly allotted to 2 X 2 factorial arrangement of treatments with pigs being heat  stressed  or  not  and  being  supplemented  with  OEO  or  not with 8  replicate  pens  of  each treatment  with  6  pigs/pen  (4  barrows,  2  gilts  per  pen).  Water  treatments  were administered immediately, with  dosing at  47 μL/L of OEO. One-half  of  the  pigs  on  each  water  treatment remained under thermoneutral conditions (TN; 21.1C), while the other half was subjected to a 3 d diurnal, acute heat stress (HS) with 12 hours at 33.3 oC (7AM-7PM) and 12 hours at 26.7oC (7PM-7AM). Three days post-HS, temperatures were reduced back to TN for the rest of the study, and pigs remained on their water treatments. Rectal temperatures were collected in the morning and evening  of  the  heat  stress  period  on  one  barrow  and  one  gilt  in  each  pen. Jejunal  tissue was collected for subsequent histological examination and determination of gene expression. All data were  analyzed  using  the  GLM  procedure  of  SAS  (ver.  9.4).  Pigs  subjected  to  heat  stress  had reduced ADG (P < 0.003) and G:F (P < 0.008) during the 3d heat stress compared to pigs reared under thermoneutral conditions. However, post-heatstress, heat stressed pigs had compensatory gain resulting in increased ADG (P < 0.001) and G:F (P < 0.001) compared to thermoneutral reared pigs.   Overall,  there  was an  interaction  (P  <  0.006)  observed  between  water  and  heat  treatment with  OEO  increasing  ADG  in  thermoneutral  pigs  but  not  in  heat  stressed  pigs.  Similarly, interactions  between  water  and  heat  treatment  were  observed  for  ADFI  during  heat  stress  (P  < 0.004),  post  heat  stress  (P  <  0.01),  and  overall  (P  <  0.004)  from  increasing  OEO  intake  in thermoneutral pigs but not in heat stressed pigs. Rectal temperatures were higher (P < 0.001) for heat stressed pigs at the end of d 1 and 2 of the acute heat challenge compared to TN housed pigs. Pigs exposed to HS also used more water than pigs housed in a thermoneutral environment (P < 0.002). There were no differences between villi height, crypt depth or VH:CD between treatment groups  (P  >0.05).  There  was  also  no  difference  in  TP53  and  CDKNA1  gene  expression  among treatments (P > 0.10). In the second experiment, 36 barrows were used in an 18d experiment to investigate the effects of pre-weaning tryptophan supplementation on performance and intestinal integrity following  weaning  with  or  without  transport  stress  at  weaning.  Pigs  were  randomly allotted to 2 X 2 factorial arrangement of treatments of pre-weaning tryptophan supplementation or not and weaning transport or not. Pigs on the tryptophan treatment received 0.35, 0.45, and 0.55 g Trp/d in 5 day intervals, beginning 15 d prior to weaning.Tryptophan was dissolved in chocolate milk and administered by oral gavage with control pigs receiving milk only. At weaning, 4 pigs from each pre-weaning treatmentwere euthanized for collection of jejunal tissue.  Of the remaining pigs, half the pigs oneach treatment were transported for 12 h, and half were moved into individual pens  with  no  transport.  Following  transport,  all  pigs  were  individually  housed  and  provided  ad libitum  access  towater  andfeed  from  a  common  diet.  On  d  3  post-weaning,  all  pigswere euthanized for collection of jejunal tissue. Jejunal tissue was used for histological examination and for determination of gene expression. All data were analyzed using the GLM procedure of SAS (9.4).  No  effects  of  Trp  supplementation  were  observed  on  pre-weaning  (P  >  0.10)  growth. Pig BW and ADFI were unaffected (P > 0.10) by Trp supplementation and transport at weaning. Post-weaning, there was a tendency (P < 0.06) for an effect of transport on ADG as transported pigs lost weight in the 3 d post-weaning period while non-transported pigs gained slightly. Gain:Feed post-weaning  was  lower  (P  <  0.04)  for  transported  pigs  compared  to  non-transported  pigs.  No differences  were  observed  for villus base  and  mid  width,  villus  height,  crypt  depth  or  villus height:crypt   depth.   There   was   a   tendency   for   an   interaction   of   transportation   and   Trp supplementation  (P  <  0.06)  on  villi  base  width  driven  by  an  increased  villus  width  in  non-transported pigs given supplemental Trp but a decrease in villus width in transported pigs given supplemental Trp.These results conclude that these alleviating agents had minimal effects when pigs  were  stressed, however TN grow-finish pigs  benefitted  from  OEO  water  supplementation among growth performance.</p>

O estresse de calor prejudica o crescimento e reprodução dos organismos vegetais, ao alterar a permeabilidade de membranas biológicas e desnaturar proteínas, limitando o metabolismo primário. Dentre as respostas ao estresse abiótico, está a síntese de metabólitos secundários. Braquicerina é um alcaloide monoterpeno indólico com ação antioxidante, protetora contra UV e antimutagênica sintetizado por partes aéreas de Psychotria brachyceras. O objetivo deste trabalho é investigar o metabolismo de braquicerina sob estresse de calor. Assim, espera-se contribuir para o conhecimento acerca do metabolismo secundário nas respostas ao estresse de calor, descrever a função in planta do composto, e fornecer ferramentas para obtenção do alcaloide para fins farmacêuticos. O acúmulo de braquicerina foi induzido em discos foliares mantidos a 40ºC por três dias, tanto em regime de elevação abrupta como gradual da temperatura. Baixa temperatura (10ºC) não afetou o acúmulo do alcaloide. Discos foliares de Psychotria carthagenensis, uma espécie que não sintetiza alcaloides monoterpeno indólicos, foram também desafiados por estresse de calor. Clorofila total, teor de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica foram quantificados em ambas as espécies. P. carthagenensis foi relativamente tolerante ao calor, o que pode estar relacionado à sua elevada concentração de antocianinas, fortemente induzidas por choque térmico de 50ºC por 6h. Peroxidação lipídica foi reduzida nas amostras de P. brachyceras sob estresse de calor agudo ou gradual em comparação à condição controle, sendo este parâmetro inalterado nas duas condições em P. carthagenensis. O teor de peróxido de hidrogênio foi menor em P. brachyceras submetida a choque de térmico em relação ao controle, enquanto o mesmo parâmetro não foi alterado em P. carthagenensis. Discos foliares das espécies sensíveis ao calor Brugmansia suaveolens e Brassica oleracea, pré-tratadas com braquicerina em concentrações similares às encontradas em P. brachyceras, adquiriram fenótipo tolerante ao choque térmico. A expressão do gene que codifica a enzima triptofano descarboxilase (TDC), envolvida na biossíntese de braquicerina em P. brachyceras, foi fortemente inibida em discos foliares submetidos à 40ºC por 6h, 12h e 24h, sugerindo que o efeito da temperatura na estimulação de acúmulo de alcaloide ocorra em nível pós-transcricional. Em conjunto, os dados indicam que a exposição ao calor é um meio efetivo de aumentar o rendimento de braquicerina, cuja acumulação contribui para proteção contra os danos oxidativos associados. / Heat stress impairs plant growth and reproduction by altering membrane permeability and promoting protein denaturation, which limits primary metabolism. Secondary metabolites often take part in protection against abiotic stress responses. Brachycerine is a monoterpene indole alkaloid with antioxidant, UV protectant, and antimutagenic activity synthesized by Psychotria brachyceras shoots. Brachycerine metabolism was analyzed under heat stress, in order to shed light on brachycerine‘s in planta function and to provide potential tools to improve alkaloid yields for pharmaceutical analysis. Accumulation was induced in leaf disks kept at 40ºC for three days, both by abrupt and stepwise temperature increase. Brachycerine concentration was not affected by low temperature (10ºC) exposure. Leaf disks of Psychotria carthagenensis, a species devoided of alkaloids, were also challenged by heat. Total chlorophyll, hydrogen peroxide and lipid peroxidation concentrations were determined in both species. P. carthagenensis was relatively tolerant to heat treatments which may be explained by its high anthocyanin concentration, strongly induced by heat shock of 50ºC for 6h. Brugmansia suaveolens and Brassica oleracea, pre-treated with brachycerine in concentrations equivalent to those found in P. brachyceras, had a heat shock tolerant phenotype, based on chlorophyll content. Expression of the TRYPTOPHAN DECARBOXYLASE gene, which encodes for an enzyme involved in alkaloid biosynthesis (TDC) was strongly repressed in leaf disks exposed to 40ºC for 6h, 12h e 24h, suggesting that temperature effect may occur at post-transcriptional level. Taken together, data indicate that heat exposure is an effective means to increase yields of brachycerine, whose accumulation contributes to protect against associated oxidative damage.

O estresse de calor prejudica o crescimento e reprodução dos organismos vegetais, ao alterar a permeabilidade de membranas biológicas e desnaturar proteínas, limitando o metabolismo primário. Dentre as respostas ao estresse abiótico, está a síntese de metabólitos secundários. Braquicerina é um alcaloide monoterpeno indólico com ação antioxidante, protetora contra UV e antimutagênica sintetizado por partes aéreas de Psychotria brachyceras. O objetivo deste trabalho é investigar o metabolismo de braquicerina sob estresse de calor. Assim, espera-se contribuir para o conhecimento acerca do metabolismo secundário nas respostas ao estresse de calor, descrever a função in planta do composto, e fornecer ferramentas para obtenção do alcaloide para fins farmacêuticos. O acúmulo de braquicerina foi induzido em discos foliares mantidos a 40ºC por três dias, tanto em regime de elevação abrupta como gradual da temperatura. Baixa temperatura (10ºC) não afetou o acúmulo do alcaloide. Discos foliares de Psychotria carthagenensis, uma espécie que não sintetiza alcaloides monoterpeno indólicos, foram também desafiados por estresse de calor. Clorofila total, teor de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica foram quantificados em ambas as espécies. P. carthagenensis foi relativamente tolerante ao calor, o que pode estar relacionado à sua elevada concentração de antocianinas, fortemente induzidas por choque térmico de 50ºC por 6h. Peroxidação lipídica foi reduzida nas amostras de P. brachyceras sob estresse de calor agudo ou gradual em comparação à condição controle, sendo este parâmetro inalterado nas duas condições em P. carthagenensis. O teor de peróxido de hidrogênio foi menor em P. brachyceras submetida a choque de térmico em relação ao controle, enquanto o mesmo parâmetro não foi alterado em P. carthagenensis. Discos foliares das espécies sensíveis ao calor Brugmansia suaveolens e Brassica oleracea, pré-tratadas com braquicerina em concentrações similares às encontradas em P. brachyceras, adquiriram fenótipo tolerante ao choque térmico. A expressão do gene que codifica a enzima triptofano descarboxilase (TDC), envolvida na biossíntese de braquicerina em P. brachyceras, foi fortemente inibida em discos foliares submetidos à 40ºC por 6h, 12h e 24h, sugerindo que o efeito da temperatura na estimulação de acúmulo de alcaloide ocorra em nível pós-transcricional. Em conjunto, os dados indicam que a exposição ao calor é um meio efetivo de aumentar o rendimento de braquicerina, cuja acumulação contribui para proteção contra os danos oxidativos associados. / Heat stress impairs plant growth and reproduction by altering membrane permeability and promoting protein denaturation, which limits primary metabolism. Secondary metabolites often take part in protection against abiotic stress responses. Brachycerine is a monoterpene indole alkaloid with antioxidant, UV protectant, and antimutagenic activity synthesized by Psychotria brachyceras shoots. Brachycerine metabolism was analyzed under heat stress, in order to shed light on brachycerine‘s in planta function and to provide potential tools to improve alkaloid yields for pharmaceutical analysis. Accumulation was induced in leaf disks kept at 40ºC for three days, both by abrupt and stepwise temperature increase. Brachycerine concentration was not affected by low temperature (10ºC) exposure. Leaf disks of Psychotria carthagenensis, a species devoided of alkaloids, were also challenged by heat. Total chlorophyll, hydrogen peroxide and lipid peroxidation concentrations were determined in both species. P. carthagenensis was relatively tolerant to heat treatments which may be explained by its high anthocyanin concentration, strongly induced by heat shock of 50ºC for 6h. Brugmansia suaveolens and Brassica oleracea, pre-treated with brachycerine in concentrations equivalent to those found in P. brachyceras, had a heat shock tolerant phenotype, based on chlorophyll content. Expression of the TRYPTOPHAN DECARBOXYLASE gene, which encodes for an enzyme involved in alkaloid biosynthesis (TDC) was strongly repressed in leaf disks exposed to 40ºC for 6h, 12h e 24h, suggesting that temperature effect may occur at post-transcriptional level. Taken together, data indicate that heat exposure is an effective means to increase yields of brachycerine, whose accumulation contributes to protect against associated oxidative damage.

O estresse de calor prejudica o crescimento e reprodução dos organismos vegetais, ao alterar a permeabilidade de membranas biológicas e desnaturar proteínas, limitando o metabolismo primário. Dentre as respostas ao estresse abiótico, está a síntese de metabólitos secundários. Braquicerina é um alcaloide monoterpeno indólico com ação antioxidante, protetora contra UV e antimutagênica sintetizado por partes aéreas de Psychotria brachyceras. O objetivo deste trabalho é investigar o metabolismo de braquicerina sob estresse de calor. Assim, espera-se contribuir para o conhecimento acerca do metabolismo secundário nas respostas ao estresse de calor, descrever a função in planta do composto, e fornecer ferramentas para obtenção do alcaloide para fins farmacêuticos. O acúmulo de braquicerina foi induzido em discos foliares mantidos a 40ºC por três dias, tanto em regime de elevação abrupta como gradual da temperatura. Baixa temperatura (10ºC) não afetou o acúmulo do alcaloide. Discos foliares de Psychotria carthagenensis, uma espécie que não sintetiza alcaloides monoterpeno indólicos, foram também desafiados por estresse de calor. Clorofila total, teor de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica foram quantificados em ambas as espécies. P. carthagenensis foi relativamente tolerante ao calor, o que pode estar relacionado à sua elevada concentração de antocianinas, fortemente induzidas por choque térmico de 50ºC por 6h. Peroxidação lipídica foi reduzida nas amostras de P. brachyceras sob estresse de calor agudo ou gradual em comparação à condição controle, sendo este parâmetro inalterado nas duas condições em P. carthagenensis. O teor de peróxido de hidrogênio foi menor em P. brachyceras submetida a choque de térmico em relação ao controle, enquanto o mesmo parâmetro não foi alterado em P. carthagenensis. Discos foliares das espécies sensíveis ao calor Brugmansia suaveolens e Brassica oleracea, pré-tratadas com braquicerina em concentrações similares às encontradas em P. brachyceras, adquiriram fenótipo tolerante ao choque térmico. A expressão do gene que codifica a enzima triptofano descarboxilase (TDC), envolvida na biossíntese de braquicerina em P. brachyceras, foi fortemente inibida em discos foliares submetidos à 40ºC por 6h, 12h e 24h, sugerindo que o efeito da temperatura na estimulação de acúmulo de alcaloide ocorra em nível pós-transcricional. Em conjunto, os dados indicam que a exposição ao calor é um meio efetivo de aumentar o rendimento de braquicerina, cuja acumulação contribui para proteção contra os danos oxidativos associados. / Heat stress impairs plant growth and reproduction by altering membrane permeability and promoting protein denaturation, which limits primary metabolism. Secondary metabolites often take part in protection against abiotic stress responses. Brachycerine is a monoterpene indole alkaloid with antioxidant, UV protectant, and antimutagenic activity synthesized by Psychotria brachyceras shoots. Brachycerine metabolism was analyzed under heat stress, in order to shed light on brachycerine‘s in planta function and to provide potential tools to improve alkaloid yields for pharmaceutical analysis. Accumulation was induced in leaf disks kept at 40ºC for three days, both by abrupt and stepwise temperature increase. Brachycerine concentration was not affected by low temperature (10ºC) exposure. Leaf disks of Psychotria carthagenensis, a species devoided of alkaloids, were also challenged by heat. Total chlorophyll, hydrogen peroxide and lipid peroxidation concentrations were determined in both species. P. carthagenensis was relatively tolerant to heat treatments which may be explained by its high anthocyanin concentration, strongly induced by heat shock of 50ºC for 6h. Brugmansia suaveolens and Brassica oleracea, pre-treated with brachycerine in concentrations equivalent to those found in P. brachyceras, had a heat shock tolerant phenotype, based on chlorophyll content. Expression of the TRYPTOPHAN DECARBOXYLASE gene, which encodes for an enzyme involved in alkaloid biosynthesis (TDC) was strongly repressed in leaf disks exposed to 40ºC for 6h, 12h e 24h, suggesting that temperature effect may occur at post-transcriptional level. Taken together, data indicate that heat exposure is an effective means to increase yields of brachycerine, whose accumulation contributes to protect against associated oxidative damage.