Konstanz, University, Diss., 2004.

Konstanz, Universiẗat, Diss., 2001.

Doctor en Ciencias con Mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo hasta diciembre de 2013 / Single-molecule manipulation has increasingly become a useful methodology for the study of macromolecular dynamics including unfolding-refolding transitions. In this study we use the optical tweezers to investigate the effect of substrate on the mechanical stability of glucokinase from the hiperthermophilic archeon Thermococcus litoralis. To this end, we derivatize the enzyme with DNA handles, via reactive cysteines and attach them to polystyrene beads. The enzyme with different handle attachments was separated using a native gel electrophoresis assay, and the activity of the enzyme in each gel band was monitored in situ by coupling the formation of glucose-6-phosphate to the formation of formazan and the DNA-protein-DNA construct was purified. Different constructs were pulled to investigate the effect of the ADP substrate on the stability of the protein. At 28 pN, the construct S4C/T57C showed hopping between two conformations with a difference in extension of 5.3 nm. For the unfolding reaction, the distances to the transition state were x‡ = 3.09 ± 0.35 nm in the absence and 2.81 ± 0.62 nm in the presence of ADP, respectively; the corresponding values during refolding were 2.24 ± 0.24 nm and 2.46 ± 0.43 respectively. The rate of unfolding extrapolated to zero force was an order of magnitude smaller in the presence than in absence of ADP, with no changes in the extrapolated refolding rates. These results suggest that the folded state of the protein is stabilized by the substrate with no effect on the distance to the transition state for the unfolding reaction.

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L'immense diversité génomique des microorganismes leur permet de vivre partout, même dans les environnements extrêmes tels que Ies sources hydrothermales profondes. Ces dernières, disséminées sur l’ensemble des fonds océaniques, sont un bon modèle pour étudier la biogéographie et la diversification des génomes. Une approche de génomique comparative a été employée sur des isolats du genre Thermococcus proches d'un point de vue évolutif. Ce travail visait à identifier des mécanismes ayant un rôle dans Ia diversification de ces génomes, et également d'identifier des gènes impliqués dans cette différenciation. A cette fin, deux groupes d'une vingtaine d'isolats ayant des origines géographiques diverses ont été sélectionnés et séquencés. L'éloignement géographique résultant de la colonisation de nouveaux systèmes hydrothermaux semble être un facteur de diversification et de spéciation pour certains isolats. Cependant, lorsque les sites hydrothermaux sont relativement proches, il semblerait qu'un transfert de gènes entre les isolats soit toujours possible. Dans ce cas, l’adaptation à de nouvelles niches écologiques serait un facteur de la diversification des génomes. L'approche de génomique comparative a permis d'identifier des gènes spécifiques à certains sous-groupes, apparentés à des espèces. Ces gènes sont notamment impliqués dans les métabolismes des acides aminés, de production d'énergie et de transport d'ions inorganiques. Ceci reflète les pressions de sélections que peuvent subir ces organismes dans ces environnements hostiles à de nombreuses formes de vie. / The immense genomic diversity of microorganisms allows them to live everywhere, even in extreme environments such as deep hydrothermal vents. Scattered over the seabed, these are a good model for studying the biogeography and genomes diversification. A comparative genomics approach has been used on closely related isolates, of the genus Thermococcus. This work aimed at identifying mechanisms that have a role in the diversification of these genomes, and also to identify genes involved in this differentiation. For this purpose, two groups of about 20 isolates with different geographical origins were selected and sequenced.The geographical isolation resulting from colonization of new hydrothermal systems is likely to be a diversification and speciation factor for some isolates. But when hydrothermal sites are relatively close, it would seem that gene transfer between isolates is still possible. In this case, adaptation to new ecological niches would be a factor contributing to the genomes diversification. The comparative genomics approach allowed highlighting genes specific to certain subgroups, related to species. These genes are involved in amino acid metabolism, energy production and the transport of inorganic ions. This reflects selection pressures that these organisms may experience in these environments, otherwise hostile to many forms of life.

Suite à la découverte récente des sources hydrothermales les plus profondes de la planète au niveau de laFosse des Caïmans, des échantillons hydrothermaux y ont été prélevés en vue de cultiver des microorganismes de ce site encore peu documenté. Des cultures d’enrichissement ont été réalisées à partir de ces échantillons en vue d’isoler de nouveaux taxons microbiens ayant des métabolismes clés des cycles biogéochimiques du soufre et du carbone ou une physiologie particulière (piézophilie). Parmi les isolats obtenus, il y avait notamment une nouvelle archée hyperthermophile anaérobie sulfo-réductrice, désignée comme CDGST, qui provenait du champ hydrothermal Beebe, à 4964 m de profondeur. Cette souche, affiliée au genre Thermococcus, présentait une certaine plasticité physiologique et se démarquait de ses plus proches parents du point de vue de sa physiologie.Elle a été caractérisée en détails aux niveaux métabolique, physiologique et génomique. Cette souche estpiézophile et possède la plus large gamme de pression de croissance jamais décrite pour un organisme. Elle se développe de manière optimale à 75°C, pH 6,0 et sous une pression hydrostatique de 50 MPa, la pression in situ de son habitat naturel. Elle appartient à une nouvelle espèce qui a été appelée Thermococcus piezophilus sp.nov. Son génome a été séquencé et annoté.La croissance de ce nouvel isolat est efficace de pression atmosphérique jusqu’à au moins 120 MPa, et la souche croît avec plus de difficultés jusqu'à 130 MPa. Aucun autre microorganisme, qu’il soit psychrophile, mésophile ou hyperthermophile ne possède une telle gamme de pression de croissance. Pour cette raison, les mécanismes d’adaptation de cette souche à la pression ont été étudiés par une approche de transcriptomique.Cette souche s’adapte aux variations de pression notamment en modulant sa production et sa conversion d’énergie (transporteurs, hydrogénases, etc.) en fonction de la pression. / Following the recent discovery of the world’s deepest hydrothermal vents at the Cayman Trough, hydrothermal samples were taken for culturing microorganisms of this site still poorly documented. Enrichment cultures were performed using these samples to isolate new microbial taxa having key metabolisms of biogeochemical cycles of carbon and sulfur or a particular physiology (piezophily). Among the isolates, there was a new hyperthermophilic and anaerobic sulfur-reducing archaea, designated as CDGST, originating from the hydrothermal field Beebe, at 4964 m depth. This strain belonged to the Thermococcus genus. It exhibited some physiological plasticity and was distinguishable from its closest relatives from the point of view of its physiology. It has been characterized in great details at metabolic, physiological and genomics levels. This strain is piezophilic and has the broadest range pressure for growth ever described for an organism. It grows optimally at 75°C, pH 6.0 and under a hydrostatic pressure of 50 MPa, the in situ pressure of its natural habitat. It belongs to a new species that was called Thermococcus piezophilus sp. nov. Its genome has been sequenced and annotated.The growth of this new isolate is effective from atmospheric pressure to at least 120 MPa, and the strain grows with more difficulties up to 130 MPa. No other organism, whether psychrophilic, mesophilic or hyperthermophilic has such a range of growth pressure. For this reason, the adaptation mechanisms to pressure of the strain were studied by a transcriptomic approach. This strain adapts to pressure variations, by modulating notably its energy production and energy conversion (carriers, hydrogenases, etc.) depending on the pressure.

Kyoto University (京都大学) / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第13792号 / 工博第2896号 / 新制||工||1427(附属図書館) / 26008 / UT51-2008-C708 / 京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻 / (主査)教授 今中 忠行, 教授 青山 安宏, 教授 濵地 格 / 学位規則第4条第1項該当

Kyoto University (京都大学) / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第13852号 / 工博第2956号 / 新制||工||1436(附属図書館) / 26068 / UT51-2008-C768 / 京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻 / (主査)教授 今中 忠行, 教授 青山 安宏, 教授 森 泰生 / 学位規則第4条第1項該当

L’ADN est une molécule dont l’intégrité est cruciale pour le bon fonctionnement de tous les organismes vivants. Cependant, il est régulièrement soumis à différents stress provenant de sources endogènes ou exogènes, et qui sont capables de générer dans sa structure des dommages de nature variée. Chaque dommage peut être reconnu par une panoplie de protéines, parmi lesquelles nous pouvons retrouver les protéines de réparation, les inhibiteurs de réparation, les facteurs de transcriptions ou encore les protéines de remodelage chromatinien. Ces protéines constituent l’interactome d’une lésion donnée.Les cyclonucléosides sont des dommages complexes de l’ADN qui ont pour particularité d’impliquer à la fois la base et le résidu de sucre, entre lesquels une liaison covalente supplémentaire est créée. La présence de cette liaison a pour conséquence de déformer la double hélice de l’ADN. Ainsi, ces lésions ne sont pas prises en charge par le système de réparation par excision de bases, comme la plupart des dommages d’oxydation, mais elles seraient plutôt reconnues par le système de réparation par excision de nucléotides, ce dernier prenant en charge les lésions volumineuses.L’objectif de cette thèse est d’étudier l’interactome des cyclonucléosides en utilisant différents modèles biologiques : eucaryotes, bactéries ou archées. En utilisant une technique de piégeage de protéines sur des sondes comportant ces lésions, nous avons effectué un screening des interactions entre les cyclonucléosides et des protéines issues d’extraits protéiques HeLa. Nous avons ainsi identifié l’influence négative des cyclonucléosides sur la reconnaissance de sa séquence cible par un facteur de transcription DREF, ainsi que sur les interactions de PARP1 avec l’ADN. Ces résultats ont été confirmés par l’usage des techniques complémentaires.Nous avons également analysé les interactions entre la glycosylase bactérienne Fpg et les cyclonucléosides : cette enzyme possède une affinité pour ces lésions, sans pourtant exercer d’activité d’excision. Cette affinité est inférieure à l’affinité de la Fpg pour les sites abasiques mais reste supérieure à son affinité pour l’ADN non-endommagé. Le rôle que pourraient jouer les cyclonucléosides dans l’ADN est alors discuté suite aux résultats obtenus.Enfin, une archée radiorésistante Thermococcus gammatolerans a été étudiée. Dans un premier temps, la formation des lésions d’oxydation simples et complexes à forte dose d’irradiation (2500 et 5000 Gy) a été évaluée. La 8-oxo-désoxyguanosine, exemple des lésions simples d’oxydation, est formée en grande quantité suite à une forte dose d’irradiation, et rapidement réparée dans les cellules remises dans des conditions optimales de culture. Les cyclonucléosides, quant à eux, ne sont pas détectés même à de très fortes doses d’irradiation, ce qui soulève des questions sur la formation de ces dommages. Ensuite, deux nouvelles glycosylases isolées de Thermococcus gammatolerans ont été étudiées : leur mécanisme d’action ainsi que leur spécificité vis-à-vis des substrats ont été élucidés.Les travaux effectués au cours de cette thèse ont contribué à la meilleure compréhension des interactions entre les cyclonucléosides et les protéines interagissant avec eux. Le développement des techniques de piégeage des protéines sur les sondes lésées, qui a constitué une partie importante des travaux, pourra également servir à étudier l’interactome d’autres lésions complexes de l’ADN. / DNA is a molecule, which integrity is crucial for correct functioning of all the living organisms. However, it is regularly submitted to different stresses coming from endogenous or exogenous sources, which are able to generate various damages in its structure. Each damage may be recognized by multiple proteins, among which one can find repair proteins, inhibitors of DNA repair, transcription factors or proteins of chromatin remodelling. All these proteins constitute the interactome of a given DNA lesion.Cyclonucleosides are complex damages of DNA, which imply the base and the sugar residue at the same time, since an additional covalent bond is generated between these two. The consequence of the presence of this bond is the deformation of the double helix. For this reason, cyclonucleosides are not recognized by the base excision repair system, as the majority of the oxidative lesions are, but rather by the nucleotide excision repair system, which takes in charge bulky lesions.The objective of this thesis is to study the interactome of the cyclonucleosides, by using different biological models: eucaryotes, bacteries and archaea. By using the technique that enables trapping of proteins on the probes holding these lesions, we realised a screening of interactions between cyclonucleosides and proteins issued from the HeLa extracts. We identified the negative influence of cyclonucleosides on the recognition of its target sequence by the transcription factor DREF, as well as on the PARP1 interactions with DNA. These results were then confirmed by complementary techniques.We have also analysed the interactions between the bacterial glycosylase Fpg and cyclonucleosides: this enzyme possesses an affinity for these lesions, without however exerting an excision activity. This affinity is lower than the Fpg affinity for abasic sites, but it is higher than its affinity for non-damaged DNA. The role that could play cyclonucleosides in DNA is discussed following these results.Finally, a radioresistant archaea Thermococcus gammatolerans was studied. First, the formation of simple and complex oxidative lesions at the high radiation doses (2500 and 5000 Gy) was evaluated. 8-oxo-deoxyguanosine, which is an example of simple oxidative lesions, is formed in great quantity at high irradiation dose, and is rapidly repaired once the cells are put in their optimal culture conditions. As for cyclonucleosides, they are not detected even at very high doses of radiation, which raises questions concerning the formation of these damages. Next, two new glycosylases isolated from Thermococcus gammatolerans were studied: their mechanism of action, as well as their specificity against the substrates, were elucidated.The work accomplished during this thesis contributed to the better understanding of the interactions between cyclonucleosides and the proteins that interact with them. Also, the development of the protein trapping techniques on the damaged probes, which constituted an important part of this work, can be applied to study the interactome of other complex DNA lesions.

Kyoto University (京都大学) / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(工学) / 乙第12200号 / 論工博第3989号 / 新制||工||1438(附属図書館) / 26272 / UT51-2008-C970 / (主査)教授 今中 忠行, 教授 青山 安宏, 教授 森 泰生 / 学位規則第4条第2項該当