In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Auslöser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut ursprünglicher Annotation der „Flybase“ (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich über ca. 10,3 kb erstreckt, für zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminosäuren. Diese beiden ursprünglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente bestätigt werden. Dabei wurde auch ein zusätzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus für mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase“ annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante für die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie trägt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerstört, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erwähnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Auslöser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte ähneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgelöst werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen lässt. Um nun den Beweis führen zu können, dass tatsächlich diese Mutation die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgeführt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Phänotypen vollständig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tatsächlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Phänotypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) bestätigen, sowie weitere Daten erhalten zu können, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage überexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht möglich die SRPK3 in wildtypischen Präparaten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch überexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine mögliche direkte Interaktion beider Proteine…. / In a previous study, a hypomorphic mutation in the gene locus of a putative serine-/threonine kinase was found to cause aggregates of the active zone protein Bruchpilot in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004). Because of its high homology to SR-protein kinases this gene was named serine-/threonine protein kinase 3 (Srpk3). The 10,3 kb large Srpk3 gene locus is located on the left arm of the third chromosome in the chromosomal region 79D4. According to an earlier annotation in “flybase” (http://flybase.bio.indiana.edu) the Srpk3 gene codes for two transcripts of 4,2 (Srpk3-RC) and 3,8 kb (Srpk3-RB). These two transcripts use different transcription and translation start sites, but from the fourth exon on they are identical. The Srpk3-RC and Srpk3-RB transcripts code for proteins of 816 and 749 amino acids respectively. The existence of these two originally annotated transcripts could be verified by RT-PCR. In addition, an alternatively spliced exon of 159 bp was identified, which is part of both groups of transcripts (Srpk3-RF and Srpk3-RE). Therefore the Srpk3 gene locus codes for at least four transcripts. Srpk3-RB and Srpk3-RC do not contain the newly identified, alternatively spliced exon, whereas Srpk3-RF and Srpk3-RE do. The existence of another transcript (Srpk3- RD) annotated in the current version of “flybase” could not be confirmed by RT-PCR experiments. The hypomorphic BRPK mutant Srpk3P1, which has a P-element insertion in the first exon of the RC/RF group of transcripts that destroys the open reading frame of those isoforms, already existed (Eberle, 1995). Therefore in that line only the RB/RE isoforms are expressed. That hypomorphic mutation was found to cause Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004) and in addition several behavioral deficits (Bock, 2006). The behavioral deficits are similar to those caused by a genetic knock-down of the Bruchpilot expression using RNAi (Wagh et al., 2006; Bock, 2006). This observation points towards an exclusive interaction of both proteins. To prove that in fact the mutation of the SRPK3 causes the observed phenotypes, rescue experiments were performed. We were able to revert the mutant phenotypes by expressing the Srpk3-RF cDNA in the nervous system (see also Bock, 2006; Bloch, 2007). Therefore mutation of the SRPK3 indeed causes the observed phenotypes in the hypomorphic BRPK mutant (Srpk3P1). To confirm the data obtained by in situ hybridization on larval brains (Nieratschker, 2004) and to gain more knowledge regarding the localization of the SRPK3, isoform specific antisera have been generated. These antisera recognize over-expressed protein (Bloch, 2007), but they are not able to recognize SRPK3 in wild type animals. Further data about localization of SRPK3 could be provided by using ectopically overexpressed GFP-tagged SRPK3 isoforms. SRPK3-GFP colocalizes with Bruchpilot at the presynaptic active zone. This result along with the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons and the behavioral deficits of SRPK3 mutants provide further evidence for a possible interaction of both proteins. To investigate, if a complete loss of SRPK3 expression alters the phenotypes observed in the hypomorphic SRPK3 mutant, a SRPK3 null mutant was generated by jump-out mutagenesis. The phenotypic analyses performed with the hypomorphic line Srpk3P1were repeated with the SRPK3 null mutant. It became obvious that the phenotypes were not enhanced by complete loss of SRPK3 expression (also see Bloch, 2007). Regarding the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons, no significant differences between hypomorphic mutant and null mutant were observed, however behavioral deficits seem to be more severe in the hypomorph (Bloch, 2007)…..

The neuropeptide pigment-dispersing factor (PDF) is a key player to orchestrate the central clock of Drosophila melanogaster. In the fly brain PDF is expressed by the ventral lateral neurons which are the central pacemakers of the Drosophila circadian system and therefore align different clock neurons and modulate downstream circuits. The terminals of the small ventral lateral neurons (s-LNv) undergo daily circadian morphological changes which also affects the synaptic organization of these neurons. However, PDF function and release seems to be unaffected by the circadian plasticity. In Drosophila presynaptic sites are organized by the active zone protein Bruchpilot (BRP), a homolog of the mammalian ELKS protein. BRP and other active zone scaffold proteins are crucial for the recruiting and membrane fusion of small synaptic vesicles that contain amino-acid or monoamide transmitters. Neuropeptides, like PDF, are produced from larger preproproteins within the regulated secretory pathway. The preproproteins are directed to the lumen of the rough endoplasmic reticulum where, after removal of the signal peptide, the resulting proprotein can be modified and is then exported to the trans-Golgi network. Finally, the proproteins are packaged within dense-core vesicles (DCV) and transported to release sites. Within the trans-Golgi and the dense-core vesicles, the bioactive peptides are processed from the proprotein by a set of specific enzymes. Neuropeptide release sites seem to be non-correlated to active zones (AZ), indicating an independence of PDF release from synaptic scaffold proteins. This study aims to elucidate the relevance of AZ for the release of neuropeptides, especially for PDF, by taking both anatomical and functional aspects into consideration. I employed endogenous BRP labeling to examine the spatial correlation between immunolabeled PDF-containing DCV and BRP-labeled AZs in the s-LNv. The number of BRP-labeled puncta in the s-LNv terminals remained stable between morning (Zeitgeber time 2) and night (Zeitgeber time 14) but the puncta-density changed during circadian plasticity. This is an indicator for recycling of BRP in the s-LNv terminals. The relative distance between BRP- and PDF-labeled puncta was higher in the morning, around the reported time of PDF release. This is also the time of day when the terminal arborization complexity is most prominent. Investigation of the publically available ssTEM dataset (FAFB) suggests that spontaneous DCV release profiles in the s-LNv lacked spatial correlation to BRP-organized AZs (T-bars). Functional impairment of PDF signaling via RNAi expression in the sLNvs leads to a shift of circadian locomotor activity and a weaker rhythmicity under constant darkness. Both were not affected by downregulation of brp in the s-LNvs. However, the knockdown of the peptide release factor cadps or proteins involved in the SNARE complex significantly impaired rhythmic strength. To further investigate the impact of brp knockdown in DCV release, I employed another RNAi screen in the Inka cells, which produce the ecdysis triggering hormone (ETH). Knockdown of eth, cadps and SNARE proteins led to severely impaired behaviour, while knockdown of brp and other AZ scaffold proteins did not phenocopy the impairment of ETH signaling. Taken together, the data collected in this study suggest that DCV release of PDF and ETH is independent of BRP-organized AZs, supporting the hypothesis of different release processes for neuropeptides and classical neurotransmitters. Further investigations are necessary to elucidate the recruitment and targeting of DCV release. Anatomical investigation of CNS in the Drosophila brain proves challenging for structures that are as tiny as ACs since their size lies beyond the diffraction limit of light. Many studies employ electron microscopy (EM) to visualize structures in the scale of nanometers. However, fixation methods for EM reduce the toolset for immunostaining methods because epitopes, neccessary to identify the regions of interests (ROIs) in histology samples are blocked or denaturated. Correlative light and electron microscopy (CLEM) offer a solution to this dilemma by combining the best of both worlds. In this study I adjusted a protocol, which was originally published for C. elegans to Drosophila brain-tissue samples. I was able to label PDF immunostained on serial plastic sections and reconstruct a ROI with a z-resolution of 100nm. / Das Neuropeptid Pigment-Dispersing Factor (PDF) spielt eine Schlüsselrolle bei der Steuerung der zentralen Uhr von Drosophila melanogaster. Im Fliegenhirn wird PDF von den ventralen lateralen Neuronen exprimiert, welche die zentralen Schrittmacher des zirkadianen Systems von Drosophila sind und daher verschiedene Uhrneuronen synchronisieren und nachgeschaltete Schaltkreise modulieren. Die Endigungen der kleinen ventrolateralen Neuronen (s-LNv) unterliegen täglichen zirkadianen morpho- logischen Veränderungen, welche auch die synaptische Organisation dieser Neuronen beeinflussen. Die Funktion und Freisetzung von PDF scheint jedoch von der zirka- dianen Plastizität unbeeinflusst zu sein. In Drosophila werden präsynaptische Stel- len durch das aktive Zonen Protein Bruchpilot (BRP), einem Homolog des ELKS- Proteins der Säugetiere, organisiert. BRP und andere Gerüstproteine der aktiven Zone sind entscheidend für die Rekrutierung und Membranfusion kleiner synapti- scher Vesikel, die Aminosäure- oder Monoamid-Transmitter enthalten. Neuropeptide werden wie PDF aus größeren Präproproteinen im Rahmen des re- gulierten Sekretionsweges hergestellt. Die Präproproteine werden in das Lumen des rauen Endoplasmatischen Retikulums (ER) geleitet, wo das resultierende Proprotein nach Entfernung des Signalpeptids modifiziert werden kann und dann in das trans- Golgi-Netzwerk exportiert wird. Schließlich werden die Proproteine in Dense-Core- Vesikel (DCV) verpackt und zu den Stellen, an denen sie freigesetzt werden, trans- portiert. Innerhalb des trans-Golgi-Netzwerks und der ”dense-core-vesicles”(DCVs) werden die bioaktiven Peptide durch eine Reihe spezifischer Enzyme aus dem Pro- protein prozessiert. Freisetzungsstellen für Neuropeptide scheinen nicht mit akti- ven Zonen (AZ) zu korrelieren, was auf eine Unabhängigkeit der PDF-Freisetzung von synaptischen Gerüstproteinen hinweist. Ziel dieser Studie war es, die Bedeu- tung der AZ für die Freisetzung von Neuropeptiden, insbesondere von PDF, unter Berücksichtigung sowohl anatomischer als auch funktioneller Aspekte aufzuzeigen. Um die räumliche Korrelation zwischen immunmarkierten PDF-haltigen DCVs und BRP-markierten AZs in s-LNvs zu untersuchen, nutzte ich endogene BRP-Markierung. Die Anzahl der BRP Punkte in den s-LNv-Endigungen blieb zwischen Morgen (Zeit- geberzeit 2) und Nacht (Zeitgeberzeit 14) stabil, aber die Punktdichte veränderte sich während der zirkadianen Plastizität. Dies ist ein Indikator für das Recycling von BRP in den s-LNv Endigungen. Der relative Abstand zwischen BRP- und PDF- markierten Punkten war am Morgen größer, etwa zum angegebenen Zeitpunkt der PDF-Freisetzung. Dies ist auch die Tageszeit, zu der die Komplexität der Endigungs- verzweigung am stärksten ausgeprägt ist. Die Untersuchung des frei zugänglichen ssTEM-Datensatzes (FAFB) deutet darauf hin, dass die Profile der spontanen DCV- Freisetzung im s-LNv keine räumliche Korrelation zu den durch BRP organisierten aktiven Zonen (T-Bars) aufweisen. Eine funktionelle Beeinträchtigung der PDF- Signalübertragung durch RNAi-Expression in den s-LNvs führt zu einer Verschie- bung der zirkadianen Bewegungsaktivität und einer schwächeren Rhythmik bei kon- stanter Dunkelheit. Beides wurde durch die Herunterregulierung von brp in den s- LNvs nicht beeinflusst. Die Deaktivierung des Peptidfreisetzungsfaktors Cadps oder von Proteinen, die am SNARE-Komplex beteiligt sind, beeinträchtigte die rhythmi- sche Stärke jedoch signifikant. Um die Auswirkungen der Ausschaltung von brp auf die DCV-Freisetzung weiter zu untersuchen führte ich einen weiteren RNAi-Screen in den Inka-Zellen durch, die das Ecdysis triggering hormone (ETH) produzieren. Die Ausschaltung von ETH, CADPS und SNARE-Proteinen führte zu einer starken Beeinträchtigung des Schlupfverhaltens, während die Ausschaltung von BRP und anderen Gerüstproteinen der AZ den ETH-defizitären Phänotyp nicht kopierte. Insgesamt deuten die in dieser Studie gesammelten Daten darauf hin, dass die DCV- Freisetzung von PDF und ETH unabhängig von BRP-organisierten AZs stattfindet, was die Hypothese unterschiedlicher Freisetzungsprozesse für Neuropeptide und klas- sische Neurotransmitter stützt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Rekru- tierung und das Targeting der DCV-Freisetzung zu klären. Die anatomische Untersuchung des ZNS im Drosophila-Gehirn erweist sich bei so winzigen Strukturen wie den AZs als schwierig, da ihre Größe jenseits der Beugungs- grenze des Lichts liegt. Viele Studien nutzen die Elektronenmikroskopie (EM), um Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu machen. Die Fixierungsmethoden für die EM schränken jedoch das Instrumentarium für Immunfärbemethoden ein, da Epitope, die zur Identifizierung der relevanten Regionen (ROIs) in histologischen Proben notwendig sind, blockiert oder denaturiert werden. Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) bieten eine Lösung für dieses Dilemma, indem sie das Beste aus beiden Welten kombinieren. In dieser Studie habe ich ein Protokoll, das ursprünglich für C. elegans veröffentlicht wurde, an Drosophila-Gehirngewebeproben angepasst. Ich konnte PDF-Immunfärbungen auf seriellen Plastikschnitten markie- ren und eine ROI mit einer z-Auflösung von 100 nm rekonstruieren

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Die intakte Signalübertragung im animalischen Nervensystem erfordert eine an richtiger Stelle ausgebildete funktionsfähige Synapse zwischen zwei Nervenzellen bzw. zwischen Nerv und Muskel. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutante von Drosophila melanogaster untersucht, bei der es zu Veränderungen der Verteilung eines wichtigen Organisationsproteins der synaptischen aktiven Zone kommt. Ein wichtiges Ergebnis der Untersuchungen ist die Beobachtung, dass es in der Mutante zu einer ektopen Ausbildung von Elementen aktiver Zonen in Axonen kommt. In den Arbeitsgruppen von E. Buchner und S. Sigrist ist bereits das Protein Bruchpilot (BRP) charakterisiert worden, das Bestandteil der präsynaptischen Ribbons, bei Drosophila als T-bars bezeichnet, ist. Bei der Suche nach Interaktionspartnern von BRP, ist eine Serin-Arginin-Protein spezifische Kinase SRPK79D entdeckt worden, die offenbar an der Regulation des Aufbaus der Tbars beteiligt ist (Nieratschker et al., 2009). Es gibt vier verschiedene Isoformen der Kinase. Werden nur zwei Isoformen der Kinase (SRPK79D-RB und -RE) exprimiert bzw. das Gen der Kinase komplett ausgeschaltet, findet man Ansammlungen von BRP als immunreaktive Aggregate in der Immunfluoreszenz- Färbung von larvalen Motoneuron-Axonen (Nieratschker, 2008). Es ist unser übergeordnetes Ziel, die Funktion und den molekularen Signalweg der Kinase SRPK79D zu entschlüsseln. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, PB-Protein in Reinform für eine Affinitätsreinigung eines PB-Antikörpers zu gewinnen, um in nachfolgenden Untersuchungen die Lokalisation dieser Kinase-Isoform zu untersuchen. Die Proteinreinigung war erfolgreich, aber es gelang nicht, eine für eine Affinitätsreinigung ausreichende Menge des Proteins zu isolieren. Ein weiterer Versuch, Lokalisationsuntersuchungen zur Expression der Kinase in Drosophila- Embryonen durchzuführen, war ebenfalls nicht erfolgreich. Obwohl die Herstellung einer für die SRPK79D mRNA spezifischen RNA Sonde für die in-Situ-Hybridisierung gelang, war die Sensitivität dieser Sonde nicht hoch genug, um die Lokalisation vornehmen zu können. Eindeutige und aufschlussreiche Ergebnisse dagegen ergab die Untersuchung der Ultrastruktur der BRP-Ansammlungen in den larvalen Motornerven. Als deren Korrelat fanden sich elektronenmikroskopisch charakteristische Ansammlungen elektronendichter intraaxonaler Strukturen, deren Form Ähnlichkeiten zu T-bars aufwies und die von Vesikeln umgeben waren. Die elektronendichten Strukturen zeigten zahlreiche Formvariationen, die wie Ansammlungen von T-bars nebeneinander bzw. „miteinander verklebte“ T-bars oder wie zerstörte T-bars aussahen. In einer nachfolgenden Studie wurde durch eine immun-elektronenmikroskopische Untersuchung gezeigt, dass diese Strukturen in der Tat BRP enthalten (Nieratschker et al., 2009). Ergebnis der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, dass prinzipiell ähnliche Aggregate auch im Wildtyp gelegentlich gefunden werden, dass sie aber in Mutanten signifikant häufiger vorkommen und auch einen signifikant höheren Durchmesser aufweisen. Doppelimmunreaktionen mit Antikörpern, die den C- bzw. N-terminalen Bereich von BRP erkennen, belegten darüber hinaus, dass in den Aggregaten das vollständige BRP-Protein vorliegt. Angeregt durch die Ultrastrukturbefunde von mit den elektronendichten Strukturen in den Aggregaten assoziierten Vesikeln wurde in weiteren Doppelimmunreaktionen untersucht, ob ein typisches Protein synaptischer Vesikel neuromuskulärer Synapsen in Drosophila, der vesikuläre Glutamattransporter (DVGlut), in den BRP-Ansammlungen nachweisbar ist. Während Kolokalisation von BRP und DVGlut in aktiven Zonen präsynaptischer Boutons nachgewiesen werden konnte, war der Vesikelmarker in BRP-Aggregaten nicht kolokalisiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Kinase SRPK79D für die Vermeidung einer ektopen Bildung von BRP-enthaltenden, elektronenmikroskopisch atypischen aktiven Zonen ähnelnden Strukturen in larvalen Motoneuronaxonen notwendig ist. Die in diesen Aggregaten regelmäßig zu beobachtenden Vesikel ähneln morphologisch synaptischen Vesikeln, besitzen aber keine dafür typischen Vesikelmarker. / Intact signal transmission in an animal’s nervous system requires a properly localized and functional synapse between two neurons or between neuron and muscle. This dissertation is part of the investigation of a Drosophila melanogaster mutant which displays alterations in the distribution of a synaptic active zone protein. An important result of the present study is the documentation of an ectopic formation of active zone structural elements in this mutant. Analyses carried out in the laboratories of E. Buchner and S. Sigrist contributed to the characterization of the protein Bruchpilot (BRP), a constituent of the T-bar, the characteristic presynaptic ribbon in Drosophila. Searching for interaction partners of BRP, a serine-arginine-protein specific kinase was identified that apparently regulates T-bar assembly (Nieratschker et al., 2009). There are four kinase isoforms. Knocking out two of these isoforms (SRPK79D-RB and -RE) results in accumulations of BRP-immunoreactive aggregates in the larval ventral nerves (Nieratschker, 2008). Further studies were designed to identify the function and molecular signalling pathways of the kinase SRPK79D. One objective of the present experiments was to produce purified PB-protein in order to enable affinity-purification of an antibody against this isoform of the kinase for subsequent specific immunohistochemical localization analyses. Although production of the antigen was successful, the amount of protein produced was too low to allow efficient affinity purification. An attempt to show the expression pattern of the kinase in Drosophila embryos with in-situ hybridization resulted in production of a SRPK79D specific RNAprobe, however, the probe sensitivity was not high enough to yield conclusive results for mRNA localization. Ultrastructural analyses of the BRP-ir aggregates in the larval ventral nerves, on the other hand, yielded definite and conclusive results. These aggregates corresponded to extensive intraaxonal electron-dense, ribbon-like structures surrounded by vesicles. These electron-dense structures were differently shaped and resembled accumulations of regularly shaped, clotted or dysmorphic T-bars, which in subsequent immuno-electronmicroscopic analyses carried out by another investigator were proven to contain BRP (Nieratschker et al., 2009). An important result of the present study was the observation that similar intraaxonal aggregates were occasionally also present in wild type nerves, however, the aggregates found in the mutants were significantly more frequent and of significantly larger size than those observed in wild-type larvae. Moreover, double-immunostaining using BRP-antibodies recognizing specifically the C- and the N-terminal part of the protein, respectively, provided evidence that the complete BRP protein is localized in the aggregates. Since electron microscopy had showed that numerous vesicles were associated with the electron dense aggregates, we tested whether the vesicular glutamate transporter (DVGlut), a marker protein for synaptic vesicles of motoneurons in Drosophila, could be localized in BRP-ir aggregates. While colocalization of BRP and DVGlut was observed at the presynaptic active zones, no colocalization of the synaptic vesicle marker was observed in the BRP-ir aggregates in the larval nerves. In conclusion, the results provide evidence that the kinase SRPK79D is required for the prevention of ectopic formation of BRP-containing ribbon-like structures in larval ventral nerves. These structures include vesicles resembling synaptic vesicles, which however do not display immunoreactivity for a typical synaptic vesicle marker protein.