Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O arbovírus Mayaro (MAYV), encontrado nas regiões próximas a florestas e áreas rurais da América do Sul, é membro da família Togaviridae, gênero Alphavirus. Este gênero é distribuído amplamente, tendo dois grupos principais: Alphavirus do Velho Mundo (Chikungunya, Sindbis, O¿nyong-nyong, Ross River, Semliki Forest) e do Novo Mundo (Encefalite Equina Venezuelana, Encefalite Equina Ocidental), de acordo com a região na qual foram isolados originalmente. O mosquito Haemagogus spp. é o principal vetor do MAYV que também já foi isolado de mosquitos do gênero Aedes spp. Considerando a semelhança do MAYV com o vírus Chikungunya, recentemente inserido no Brasil, e transmitido por Ae. aegypti, há risco de que o MAYV possa ser transmitido em áreas urbanas. Cabe ressaltar que no Brasil já foram registrados casos de co-circulação de MAYV durante surtos epidêmicos de dengue. A infecção por MAYV causa sintomas semelhantes a outras doenças febris, como a febre da dengue, a febre do Chikungunya, e a malária, dificultando o diagnóstico preciso dos casos. O genoma de MAYV, com cerca de 11,7 kb, é organizado em duas principais regiões: domínio não estrutural (extremidade 5¿ do RNA), contendo os genes que codificam as proteínas não estruturais (nsP1-4); e domínio estrutural, contendo os genes que codificam as proteínas estruturais. As proteínas não estruturais dos Alphavirus são necessárias para o processamento da poliproteína e para síntese do RNA viral. Dentre as proteínas não estruturais, as proteases virais podem ser imunogênicas além de se constituírem em excelentes alvos terapêuticos. O estudo comparativo do genoma dos Alphavirus indica que a proteína nsP2 de MAYV possui diversas atividades enzimáticas, incluindo a atividade de cisteíno protease em sua região C-terminal. Portanto, com o intuito de obter um método de diagnóstico sorológico específico para MAYV, utilizando sistema de expressão recombinante em células de insetos, foi realizada a construção de três baculovírus recombinantes para a nsP2 de MAYV, para obtenção da proteína completa (nsP2FL), do domínio de cisteíno protease da porção C-terminal (Pro38), e do domínio N-terminal (NT51) como controle negativo da atividade proteolítica. A expressão de cada uma das formas recombinantes da nsP2 foi realizada em célula de inseto High Five¿. Os resultados foram analisados por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) e Western blotting. Apenas a construção NT51 da nsP2 de MAYV foi detectada na fração celular da cultura de High Five¿ por Western blotting. A análise de RNA das células High Five¿ e Sf-9 infectadas com os baculovírus recombinantes para nsP2FL e Pro38, revelou a presença de transcritos das proteínas recombinantes, indicando que a ausência dos produtos proteicos poderia ser devido a perda da cauda de histidina presente nas construções por atividade de proteólise na extremidade Cterminal. Esta hipótese foi confirmada após expressão das proteínas nsP2FL e Pro38, em célula High Five¿ infectada com baculovírus recombinantes para os genes que codificam as respectivas proteínas, com cauda de histidina na porção N-terminal. / The arbovirus Mayaro (MAYV), found in regions close to forests and rural areas of South America, is a member of the family Togaviridae, genus Alphavirus. This genus is distributed widely, in two main groups, according to the region in which they were originally isolated: the Old World (Chikungunya, Sindbis, O'nyong-Nyong, Ross River, Semliki Forest) and the New World Alphavirus (Venezuelan Equine Encephalitis, Western Equine Encephalitis). The mosquito Haemagogus spp. is the main vector of MAYV which has also been isolated from mosquitoes of the genus Aedes spp. Considering the similarity of MAYV with Chikungunya virus, recently introduced in Brazil, and transmitted by Ae. aegypti, there is risk of MAYV urban transmission. Indeed, in Brazil, co-circulation of MAYV during dengue outbreaks have been related. Symptoms of MAYV fever are similar to other febrile diseases, such as dengue fever, Chikungunya fever, and malaria, making an accurate diagnosis, difficult. MAYV 11.7 kb genome is divided in two regions: non-structural domain (5'- RNA) containing the genes encoding the nonstructural proteins (nsP1-4); and structural domain containing genes encoding structural proteins. The Alphavirus nonstructural proteins are required for processing of the polyprotein and for viral RNA synthesis. Among the non-structural proteins, viral proteases may be immunogenic besides being excellent therapeutic targets. Genome comparative studies of Alphavirus indicates that the MAYV nsP2 protein has diverse enzymatic activities including a cysteine protease activity in its C-terminal region. Thus, with the objective to obtain a specific diagnostic method for MAYV, using a recombinant expression system in insect cells, a construction of three MAYV nsP2 recombinant baculoviruses to obtain the complete protein (nsP2FL), the C-terminal cysteine protease domain (Pro38), and the N-terminal (NT51) domain as a proteolysis activity negative control. The expression of each nsP2 construction was performed on Sf-9 and High Five¿ insect cells and the results were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (SDS-PAGE) and Western blotting. Only the nsP2 NT51 construction was detected in the cellular fraction of Sf-9 and High Five¿ cultures by Western blotting. RNA analysis of Sf-9 cells infected with nsP2FL and Pro38 recombinant baculoviruses revealed the presence of transcripts, suggesting that the absence of the corresponding protein products occurred due the proteolysis of the C-terminal portion of the protein, resulting in histidine tail elimination. This hypothesis was confirmed by expression of nsP2FL e Pro38, proteins in Sf-9 and High Five¿ cells infected with recombinant baculoviruses for the genes encoding the respective proteins with histidine tail at the N-terminal portion.

O cDNA da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) foi clonado em vetores plasmidiais (indutíveis) contendo ou não o cDNA do sinal de secreção BiP e da resistência ao antibiótico higromicina B. Esses vetores foram transfectados em células S2 e foram obtidas populações e subpopulações. A população S2MTGPV-H apresentou níveis 5x maiores na expressão da GPV em análise por FACS (~ 50% das células) e por ELISA (~ 0,65 µg/107 células). A seleção de subpopulações permitiu um aumento de aproximadamente 10x na expressão da GPV, especialmente na população S2MTGPV*-H. O tratamento com NaBu resultou em uma redução de aproximadamente 20% no crescimento celular e um aumento de 50% na GPV expressa pela população S2MTGPV*-H (~ 8,3 µg/107 células). O meio de cultura SF900 II permitiu um maior crescimento das células S2MTGPV*-H e uma maior síntese de GPV comparado com outros meios de cultura. Nossos dados mostram que a expressão da GPV pôde ser otimizada através da construção de vetores de expressão/seleção, subpopulações, da exposição da cromatina e do meio de cultura utilizado. / The cDNA encoding the entire rabies virus glycoprotein (RVGP) gene was cloned in plasmids (inductive) with or without a cDNA coding for the secretion signal and coding for the selection hygromicin antibiotic. These vectors were transfected into S2 cells and we had obtain cells populations and subpopulations S2MTRVGP-H cell population were shown to express 5 times higher of RVGP as evaluated by FACS (~ 50 %) and ELISA (~ 0.65 mg/107 cells at day 7). Sub-population selection allowed a higher RVGP expression, especially for the S2MTRVGP*-H. NaBu treatment leading to lower cell growth and higher RVGP expression allowed an even higher RVGP synthesis by S2MTRVGP*-H (~ 8.3 mg/107 cells at day 7 after induction). SF900II medium leading to a higher S2MTRVGP*-H cell growth allowed a higher final RVGP synthesis in this cell culture. The data show that RVGP synthesis may be optimized by the expression/selection vectors design, cell sub-populations selection, chromatine exposure and culture medium employed.

O interesse em células de inseto para a produção de proteínas complexas se deve a sua maior facilidade de cultivo e ao padrão equivalente de glicosilação quando comparado aos sistemas com células de mamíferos. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores que limitam ou inibem a produção da glicoproteína do vírus rábico (GPV) expressa na membrana citoplasmática de células de Drosophila melanogaster transfectadas, quando cultivadas em biorreator de bancada agitado e bubble-free, operado em modo descontínuo. Avaliaram-se as influências de oxigênio dissolvido (5 < pO2 <80%), da glicose (1 < GLC0 < 15g/L) e da glutamina (0.6 < GLN0 < 7g/L). Essas variáveis afetaram de forma diferenciada o crescimento celular (produção de células e velocidades específicas-µX), o metabolismo celular (fatores de conversão - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN, YALA/GLN), assim como a expressão da proteína recombinante (concentração, teor celular e produtividade). O aumento do pO2 reduziu em 9 vezes o crescimento celular mas aumentou o teor celular de GPV em 1,4 vezes. Baixos valores de GLC0 e GLN0, claramente, limitaram o crescimento, de modo que incrementos na concentração desses substratos, até valores intermediários, aumentaram µX,MAX em 3 vezes e 2,5 vezes, respectivamente, e a produção de células em 11 vezes e 3 vezes, respectivamente. O teor celular de GPV máximo não foi afetado pela GLC, mas aumentou em 100% para valores de GLN0 igual ou superiores a 3,5 g/L. As concentrações de lactato produzidas foram consideradas baixas (inferiores a 0,8 g/L) para exercer qualquer efeito de inibição sobre o crescimento ou a expressão da proteína. Por sua vez, as concentrações de amônio parecem inibir tanto a produção de GPV (NH4+~50mg/L) quanto o crescimento celular (NH4+~80mg/L). A condição de cultivo com de 30% de pO2, 10 g/L de GLC0 e 3,5 g/L de GLN0 resultou nos maiores valores de produtividade (9,1 µg/L.h) e de concentração de GPV (1,2 mg/L). O metabolismo de GLC e GLN apresentou grande interdependência, com alterações em GLC0 afetando o metabolismo de GLN e vice-versa. Assim, em condições de excesso de GLC0, as células apresentaram um metabolismo mais ineficiente com reduções nos fatores YX/GLC (2,3 vezes) e YX/GLN (4,6 vezes) e maior geração de subprodutos, caracterizada por incrementos nos valores de YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) e YNH4/GLN (15%). O metabolismo da GLN apresentou resposta característica de substrato em excesso para toda a faixa de valores ensaiada, com redução de 25 vezes no valor de YX/GLN e inesperadamente também uma redução na geração de subprodutos de 7 vezes para YNH4/GLN e 12 vezes para YALA/GLN. O efeito sobre o metabolismo da GLC foi mais acentuado para valores mais elevados de GLN0, com redução de 3,6 vezes para YX/GLC e incrementos de 70% para YALA/GLC e para YLAC/GLC. Os resultados sugerem ainda que a célula utiliza duas vias para metabolizar a glutamina: glutaminólise, em condição de limitação em GLC; ou glutamato sintase - NADH-GOGAT, em condição de excesso em GLC. A célula demonstrou também capacidade de sintetizar GLN, a partir de amônio ou outros aminoácidos, quando atingiu concentrações abaixo de 50 mg/L. / The interest in using insect cells to produce complex proteins is due to its ease of cultivation and its glycosylation pattern equivalent to that of mammalian cells systems. The objective of this work was to identify the limiting or inhibiting factors for the production of a rabies virus glycoprotein (RVGP), expressed in the cytoplasmatic membrane of a transfected Drosophila melanogaster S2 cells, when cultivated in a bench stirred bubble-free bioreactor, in batch mode. The influence of dissolved oxygen (5 < pO2 < 80%), of initial glucose concentration (1 < GLC0 < 15 g/L) and of initial glutamine concentration (0.6 < GLN0 < 7 g/L) was evaluated. These variables affected in a different way cell growth (cell production and specific growth rate - µX), cell metabolism (yield factors - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN and YALA/GLN), as well as the recombinant protein expression (RVGP concentration, RVGP cell content and RVGP productivity). pO2 increase reduced 9 times cell growth, but increased 1.4 times RVGP cell content. Low initial glucose and glutamine concentrations clearly limited the cell growth, in such a way that raising these substrates concentrations up to intermediate values, increased µX,MAX 3 times and 2.5 times, respectively, and increased cell production 11 times and 3 times, respectively. The maximum RVGP cell content was not affected by GLC0, but improved 100% when GLN0 was 3.5 g/L or higher. The concentrations of produced lactate were considered low (below 0.8 g/L) to cause any inhibition effect on growth or protein expression. On the other hand, ammonium concentrations seem to inhibit RVGP production (NH4+~50 mg/L), as well as cell growth (NH4+~80 mg/L). Maximum productivity values (9.1 µg/L.h) and RVGP concentration (1.2 mg/L) were attained for 30% pO2, 10 g/L of GLC0 and 3.5 g/L of GLN0 run. The metabolism of GLC and GLN showed a great interdependence, with GLC0 changes affecting the GLN metabolism, and viceversa. Thus, in glucose excess condition, cell metabolism was less efficient. This implied in reduction of yield factors - YX/GLC (2.3 times) e YX/GLN (4.6 times) - and in higher by-products generation, characterized by augmentation in YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) and YNH4/GLN (15%). The glutamine metabolism showed a substrate excess response pattern to the whole range of concentration studied, with reduction of YX/GLN (25 times) and, unexpectedly, a reduction of by-products liberation - YNH4/GLN (7 times) and YALA/GLN (12 times). The effect on glucose metabolism was more intense when the glutamine concentration was higher, showing a 3.6 times diminution YX/GLC and a 70% augmentation for YALA/GLC and YLAC/GLC. The results suggest that cells metabolize glutamine through two different pathways glutaminolysis, under glucose limitation, or glutamate synthase - NADH-GOGAT, under glucose excess. The cell, proved also to be able to synthesize glutamine from ammonium or other amino acids, when it reached concentrations below 50 mg/L.

O cDNA da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) foi clonado em vetores plasmidiais (indutíveis) contendo ou não o cDNA do sinal de secreção BiP e da resistência ao antibiótico higromicina B. Esses vetores foram transfectados em células S2 e foram obtidas populações e subpopulações. A população S2MTGPV-H apresentou níveis 5x maiores na expressão da GPV em análise por FACS (~ 50% das células) e por ELISA (~ 0,65 µg/107 células). A seleção de subpopulações permitiu um aumento de aproximadamente 10x na expressão da GPV, especialmente na população S2MTGPV*-H. O tratamento com NaBu resultou em uma redução de aproximadamente 20% no crescimento celular e um aumento de 50% na GPV expressa pela população S2MTGPV*-H (~ 8,3 µg/107 células). O meio de cultura SF900 II permitiu um maior crescimento das células S2MTGPV*-H e uma maior síntese de GPV comparado com outros meios de cultura. Nossos dados mostram que a expressão da GPV pôde ser otimizada através da construção de vetores de expressão/seleção, subpopulações, da exposição da cromatina e do meio de cultura utilizado. / The cDNA encoding the entire rabies virus glycoprotein (RVGP) gene was cloned in plasmids (inductive) with or without a cDNA coding for the secretion signal and coding for the selection hygromicin antibiotic. These vectors were transfected into S2 cells and we had obtain cells populations and subpopulations S2MTRVGP-H cell population were shown to express 5 times higher of RVGP as evaluated by FACS (~ 50 %) and ELISA (~ 0.65 mg/107 cells at day 7). Sub-population selection allowed a higher RVGP expression, especially for the S2MTRVGP*-H. NaBu treatment leading to lower cell growth and higher RVGP expression allowed an even higher RVGP synthesis by S2MTRVGP*-H (~ 8.3 mg/107 cells at day 7 after induction). SF900II medium leading to a higher S2MTRVGP*-H cell growth allowed a higher final RVGP synthesis in this cell culture. The data show that RVGP synthesis may be optimized by the expression/selection vectors design, cell sub-populations selection, chromatine exposure and culture medium employed.

O interesse em células de inseto para a produção de proteínas complexas se deve a sua maior facilidade de cultivo e ao padrão equivalente de glicosilação quando comparado aos sistemas com células de mamíferos. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores que limitam ou inibem a produção da glicoproteína do vírus rábico (GPV) expressa na membrana citoplasmática de células de Drosophila melanogaster transfectadas, quando cultivadas em biorreator de bancada agitado e bubble-free, operado em modo descontínuo. Avaliaram-se as influências de oxigênio dissolvido (5 < pO2 <80%), da glicose (1 < GLC0 < 15g/L) e da glutamina (0.6 < GLN0 < 7g/L). Essas variáveis afetaram de forma diferenciada o crescimento celular (produção de células e velocidades específicas-µX), o metabolismo celular (fatores de conversão - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN, YALA/GLN), assim como a expressão da proteína recombinante (concentração, teor celular e produtividade). O aumento do pO2 reduziu em 9 vezes o crescimento celular mas aumentou o teor celular de GPV em 1,4 vezes. Baixos valores de GLC0 e GLN0, claramente, limitaram o crescimento, de modo que incrementos na concentração desses substratos, até valores intermediários, aumentaram µX,MAX em 3 vezes e 2,5 vezes, respectivamente, e a produção de células em 11 vezes e 3 vezes, respectivamente. O teor celular de GPV máximo não foi afetado pela GLC, mas aumentou em 100% para valores de GLN0 igual ou superiores a 3,5 g/L. As concentrações de lactato produzidas foram consideradas baixas (inferiores a 0,8 g/L) para exercer qualquer efeito de inibição sobre o crescimento ou a expressão da proteína. Por sua vez, as concentrações de amônio parecem inibir tanto a produção de GPV (NH4+~50mg/L) quanto o crescimento celular (NH4+~80mg/L). A condição de cultivo com de 30% de pO2, 10 g/L de GLC0 e 3,5 g/L de GLN0 resultou nos maiores valores de produtividade (9,1 µg/L.h) e de concentração de GPV (1,2 mg/L). O metabolismo de GLC e GLN apresentou grande interdependência, com alterações em GLC0 afetando o metabolismo de GLN e vice-versa. Assim, em condições de excesso de GLC0, as células apresentaram um metabolismo mais ineficiente com reduções nos fatores YX/GLC (2,3 vezes) e YX/GLN (4,6 vezes) e maior geração de subprodutos, caracterizada por incrementos nos valores de YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) e YNH4/GLN (15%). O metabolismo da GLN apresentou resposta característica de substrato em excesso para toda a faixa de valores ensaiada, com redução de 25 vezes no valor de YX/GLN e inesperadamente também uma redução na geração de subprodutos de 7 vezes para YNH4/GLN e 12 vezes para YALA/GLN. O efeito sobre o metabolismo da GLC foi mais acentuado para valores mais elevados de GLN0, com redução de 3,6 vezes para YX/GLC e incrementos de 70% para YALA/GLC e para YLAC/GLC. Os resultados sugerem ainda que a célula utiliza duas vias para metabolizar a glutamina: glutaminólise, em condição de limitação em GLC; ou glutamato sintase - NADH-GOGAT, em condição de excesso em GLC. A célula demonstrou também capacidade de sintetizar GLN, a partir de amônio ou outros aminoácidos, quando atingiu concentrações abaixo de 50 mg/L. / The interest in using insect cells to produce complex proteins is due to its ease of cultivation and its glycosylation pattern equivalent to that of mammalian cells systems. The objective of this work was to identify the limiting or inhibiting factors for the production of a rabies virus glycoprotein (RVGP), expressed in the cytoplasmatic membrane of a transfected Drosophila melanogaster S2 cells, when cultivated in a bench stirred bubble-free bioreactor, in batch mode. The influence of dissolved oxygen (5 < pO2 < 80%), of initial glucose concentration (1 < GLC0 < 15 g/L) and of initial glutamine concentration (0.6 < GLN0 < 7 g/L) was evaluated. These variables affected in a different way cell growth (cell production and specific growth rate - µX), cell metabolism (yield factors - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN and YALA/GLN), as well as the recombinant protein expression (RVGP concentration, RVGP cell content and RVGP productivity). pO2 increase reduced 9 times cell growth, but increased 1.4 times RVGP cell content. Low initial glucose and glutamine concentrations clearly limited the cell growth, in such a way that raising these substrates concentrations up to intermediate values, increased µX,MAX 3 times and 2.5 times, respectively, and increased cell production 11 times and 3 times, respectively. The maximum RVGP cell content was not affected by GLC0, but improved 100% when GLN0 was 3.5 g/L or higher. The concentrations of produced lactate were considered low (below 0.8 g/L) to cause any inhibition effect on growth or protein expression. On the other hand, ammonium concentrations seem to inhibit RVGP production (NH4+~50 mg/L), as well as cell growth (NH4+~80 mg/L). Maximum productivity values (9.1 µg/L.h) and RVGP concentration (1.2 mg/L) were attained for 30% pO2, 10 g/L of GLC0 and 3.5 g/L of GLN0 run. The metabolism of GLC and GLN showed a great interdependence, with GLC0 changes affecting the GLN metabolism, and viceversa. Thus, in glucose excess condition, cell metabolism was less efficient. This implied in reduction of yield factors - YX/GLC (2.3 times) e YX/GLN (4.6 times) - and in higher by-products generation, characterized by augmentation in YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) and YNH4/GLN (15%). The glutamine metabolism showed a substrate excess response pattern to the whole range of concentration studied, with reduction of YX/GLN (25 times) and, unexpectedly, a reduction of by-products liberation - YNH4/GLN (7 times) and YALA/GLN (12 times). The effect on glucose metabolism was more intense when the glutamine concentration was higher, showing a 3.6 times diminution YX/GLC and a 70% augmentation for YALA/GLC and YLAC/GLC. The results suggest that cells metabolize glutamine through two different pathways glutaminolysis, under glucose limitation, or glutamate synthase - NADH-GOGAT, under glucose excess. The cell, proved also to be able to synthesize glutamine from ammonium or other amino acids, when it reached concentrations below 50 mg/L.