O processo de reparo ósseo depende de uma resposta inflamatória inicial e transitória, a qual envolve a participação de diversos leucócitos, como células da linhagem monócito/macrófago. O receptor CCR2 é importante para o recrutamento de macrófagos durante as respostas imunes, além de ter um papel na regulação da osteoclastogênese. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar papel de células CCR2+ no processo de reparo ósseo alveolar pós-exodontia em camundongos, por meio de análises microscópicas (MicroCT, histomorfometria, análise de birrefringência e imuno-histoquímica) e moleculares (PCRArray) comparativas entre as linhagens C57Bl/6 (WT) e CCR2KO, ao longo dos períodos de 0 hora, 7, 14 e 21 dias pós-exodontia do incisivo superior direito. Como resultado geral das análises microscópicas, constatamos que a ausência de células CCR2+ não afetou o resultado final do reparo ósseo alveolar em camundongos CCR2KO, mas levou a alterações transitórias e estatisticamente significantes (p<0,05) para quantificação de infiltrado inflamatório, vasos sanguíneos, fibroblastos, fibras colágenas, osteoblastos e osteoclastos. Além disso, a ausência de células CCR2+ resultou em diminuição (p<0,05) de células F4/80+ e CCR5+ no infiltrado inflamatório ao longo do processo de reparo ósseo alveolar de camundongos CCR2KO, demonstrando o papel do receptor CCR2 no recrutamento de macrófagos (células F4/80+), bem como sugerindo que as células F4/80+ apresentam dupla positividade para os receptores CCR2 e CCR5. Neste contexto, o receptor CCR5 seria o responsável pela migração remanescente, ainda que reduzida, de células F4/80+ nos animais CCR2KO. Considerando os resultados moleculares, a ausência de CCR2 resultou na alteração da expressão de diferentes marcadores em camundongos CCR2KO, tais como: o fator de crescimento TGF1, marcadores de matriz COL1, MMP1a, MMP2 e MMP9, marcadores ósseos RUNX2, DMP1, RANKL, RANK e CTSK, e marcadores de MSCs CD106, COT-4, NANOG, CD146 e CD105, bem como de marcadores imunológicos como as citocinas IL-6 e TNF-a, receptores de quimiocinas CCR1, CCR5 e CXCR1,e as quimiocinas CCL12, CCL20, CCL25 e CXCL12. Em conclusão, estes resultados indicam que células CCR2+ desempenham diferentes funções no reparo ósseo alveolar em camundongos, influenciando tanto a resposta inflamatória, como os eventos teciduais observados ao longo deste processo. / The bone repair process depends of an initial and transitory inflammatory response, which involves the participation of various leukocytes subsets, as of the monocyte/macrophage lineage. The CCR2 receptor is important to macrophage recruitment during immune responses, and play an active role in the regulation of osteoclastogenesis. Thereby, the purpose of this study was to investigate the role of CCR2+ cells in the alveolar bone repair process in mice, by means of microscopic (MicroCT, histomorphometry, birefringence analysis and immunohistochemistry) and molecular (PCRArray) comparative analysis between C57BL / 6 (WT) and CCR2KO mice during periods of 0 hour, 7, 14 and 21 days post-extraction of the right upper incisor. As a result of the microscopic analysis, we noted that the absence of CCR2+ cells did not affect in the overall outcome of alveolar bone repair in CCR2KO mice, but resulted in transient and statistically significant (p<0.05) alterations of inflammatory infiltrate, blood vessels, fibroblasts, collagen fibers, osteoblasts and osteoclasts counts. Furthermore, the absence of CCR2+cells resulted in a decrease (p<0.05) of CCR5+ and F4/80+ cells in the inflammatory infiltrate along the alveolar bone repair process in CCR2KO mice, demonstrating the role of CCR2 receptor in macrophages migration (F4/80+ cells), as well as suggesting that the F4/80+ cells are double positive for CCR2 and CCR5. In this context, CCR5 receptor could be responsible for the remaining (but reduced) migration, of the F4/80 + cells in CCR2KO mice. According to molecular results, the absence of CCR2 resulted in an altered expression of different markers in CCR2KO mice, such as: growth factor TGF1, the matrix markers COL1, MMP1a, MMP2 and MMP9, the bone markers RUNX2, DMP1 RANKL, RANK and CTSK, and MSCs markers CD106, OCT-4, NANOG, CD146 and CD105, as well as immunological markers as IL-6 and TNF-, chemokine receptors CCR1, CXCR1 and CCR5, and the chemokines CCL12, CCL20, CCL25 and CXCL12. In conclusion, these results indicate that CCR2+ cells have different functions in alveolar bone repair in mice, influencing the inflammatory response and also tissue events observed throughout the process events.

O processo de reparo ósseo depende de uma resposta inflamatória inicial e transitória, a qual envolve a participação de diversos leucócitos, como células da linhagem monócito/macrófago. O receptor CCR2 é importante para o recrutamento de macrófagos durante as respostas imunes, além de ter um papel na regulação da osteoclastogênese. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar papel de células CCR2+ no processo de reparo ósseo alveolar pós-exodontia em camundongos, por meio de análises microscópicas (MicroCT, histomorfometria, análise de birrefringência e imuno-histoquímica) e moleculares (PCRArray) comparativas entre as linhagens C57Bl/6 (WT) e CCR2KO, ao longo dos períodos de 0 hora, 7, 14 e 21 dias pós-exodontia do incisivo superior direito. Como resultado geral das análises microscópicas, constatamos que a ausência de células CCR2+ não afetou o resultado final do reparo ósseo alveolar em camundongos CCR2KO, mas levou a alterações transitórias e estatisticamente significantes (p<0,05) para quantificação de infiltrado inflamatório, vasos sanguíneos, fibroblastos, fibras colágenas, osteoblastos e osteoclastos. Além disso, a ausência de células CCR2+ resultou em diminuição (p<0,05) de células F4/80+ e CCR5+ no infiltrado inflamatório ao longo do processo de reparo ósseo alveolar de camundongos CCR2KO, demonstrando o papel do receptor CCR2 no recrutamento de macrófagos (células F4/80+), bem como sugerindo que as células F4/80+ apresentam dupla positividade para os receptores CCR2 e CCR5. Neste contexto, o receptor CCR5 seria o responsável pela migração remanescente, ainda que reduzida, de células F4/80+ nos animais CCR2KO. Considerando os resultados moleculares, a ausência de CCR2 resultou na alteração da expressão de diferentes marcadores em camundongos CCR2KO, tais como: o fator de crescimento TGF1, marcadores de matriz COL1, MMP1a, MMP2 e MMP9, marcadores ósseos RUNX2, DMP1, RANKL, RANK e CTSK, e marcadores de MSCs CD106, COT-4, NANOG, CD146 e CD105, bem como de marcadores imunológicos como as citocinas IL-6 e TNF-a, receptores de quimiocinas CCR1, CCR5 e CXCR1,e as quimiocinas CCL12, CCL20, CCL25 e CXCL12. Em conclusão, estes resultados indicam que células CCR2+ desempenham diferentes funções no reparo ósseo alveolar em camundongos, influenciando tanto a resposta inflamatória, como os eventos teciduais observados ao longo deste processo. / The bone repair process depends of an initial and transitory inflammatory response, which involves the participation of various leukocytes subsets, as of the monocyte/macrophage lineage. The CCR2 receptor is important to macrophage recruitment during immune responses, and play an active role in the regulation of osteoclastogenesis. Thereby, the purpose of this study was to investigate the role of CCR2+ cells in the alveolar bone repair process in mice, by means of microscopic (MicroCT, histomorphometry, birefringence analysis and immunohistochemistry) and molecular (PCRArray) comparative analysis between C57BL / 6 (WT) and CCR2KO mice during periods of 0 hour, 7, 14 and 21 days post-extraction of the right upper incisor. As a result of the microscopic analysis, we noted that the absence of CCR2+ cells did not affect in the overall outcome of alveolar bone repair in CCR2KO mice, but resulted in transient and statistically significant (p<0.05) alterations of inflammatory infiltrate, blood vessels, fibroblasts, collagen fibers, osteoblasts and osteoclasts counts. Furthermore, the absence of CCR2+cells resulted in a decrease (p<0.05) of CCR5+ and F4/80+ cells in the inflammatory infiltrate along the alveolar bone repair process in CCR2KO mice, demonstrating the role of CCR2 receptor in macrophages migration (F4/80+ cells), as well as suggesting that the F4/80+ cells are double positive for CCR2 and CCR5. In this context, CCR5 receptor could be responsible for the remaining (but reduced) migration, of the F4/80 + cells in CCR2KO mice. According to molecular results, the absence of CCR2 resulted in an altered expression of different markers in CCR2KO mice, such as: growth factor TGF1, the matrix markers COL1, MMP1a, MMP2 and MMP9, the bone markers RUNX2, DMP1 RANKL, RANK and CTSK, and MSCs markers CD106, OCT-4, NANOG, CD146 and CD105, as well as immunological markers as IL-6 and TNF-, chemokine receptors CCR1, CXCR1 and CCR5, and the chemokines CCL12, CCL20, CCL25 and CXCL12. In conclusion, these results indicate that CCR2+ cells have different functions in alveolar bone repair in mice, influencing the inflammatory response and also tissue events observed throughout the process events.

A dor neuropática é uma condição debilitante causada por danos no sistema nervoso somatossensorial, como lesões dos nervos periféricos. As células do sistema imune, em particular os monócitos/macrófagos, desempenham um papel fundamental no desenvolvimento deste processo. Embora diversos estudos sugiram o envolvimento dessas células na medula espinal e gânglio da raiz dorsal (GRD) após a indução da neuropatia, a caracterização funcional e fenotípica, bem como a origem dessas células nesses órgãos, ainda não está esclarecida. Na medula espinal, estudos recentes têm demonstrado que apesar da massiva ativação e proliferação da micróglia residente, não há recrutamento de células mielóides para esse tecido após a indução da neuropatia, divergindo dos dados anteriormente descritos na literatura. Diante desses estudos controversos, iniciamos nosso trabalho demonstrando que possivelmente as células mielóides não são capazes de ultrapassar a barreira hematoencefálica e infiltrar na medula espinal após a indução da neuropatia periférica pelo modelo de SNI e assim, a ativação microglial ocorre de maneira independente do infiltrado dessas células neste tecido. No que se refere aos GRDs, trabalhos anteriores demonstram que há um aumento dos marcadores de ativação de macrófagos nesse tecido após a lesão periférica. Com isso, nós caracterizamos as subpopulações de monócitos/macrófagos presentes no GRD e identificamos, células CX3CR1+ e células CCR2+. De maneira interessante, ao isolarmos as células CX3CR1+ observamos que esse subtipo celular possa ser as principais células responsáveis pela produção dos mediadores inflamatórios no GRD após indução de SNI, enquanto as células CCR2+ parecem contribuir apenas de maneira parcial para a produção de IL-1? e TNF-? neste tecido, uma vez que a expressão desses mediadores não foi totalmente suprimida na ausência desse subtipo celular. Por fim, investigamos a origem desses subtipos de monócitos presentes no GRD. Por meio da parabiose entre animais wild type e GFP+, observamos que embora haja um pequeno aumento de células GFP+ no GRD de animais lesionados, essas células não são macrófagos. Corroborando com esses dados, ao realizarmos a parabiose de animais wild type com animais CX3CR1GFP/+CCR2RFP/+ não observamos presença de células CX3CR1 ou CCR2 no GRD após SNI. Em conjunto, nossos dados demonstram que existem duas subpopulações de monócitos no GRD, sendo uma delas residente e contribuindo de maneira efetiva para a produção dos mediadores inflamatórios locais e outra população de células CCR2+ que podem ter um papel mais relevante no sítio da lesão e assim, a exacerbação da inflamação local pode interferir indiretamente, na ativação das células presentes nos GRDs, bem como na produção dos mediadores inflamatórios no tecido, que vão contribuir para o desenvolvimento da dor neuropática. / Neuropathic pain is a debilitating disease due to severe damage to the nervous system, induced by peripheral nerve injury. The cells of the immune system, especially monocytes/macrophages, played a critical role in these process. Several projects have been suggested the role of these cells in the spinal cord and dorsal root ganglia (DRG) after neuropathic pain induction, but the functional and phenotypic characterization, as well as the source of cells, is still unclear. In the spinal cord, recent studies have shown that although massive activation and proliferation of the microglial occurred, there is no recruitment of myeloid cells to this tissue after the neuropathic pain induction, but this is contrary to previous findings in the literature. Based on this controversial studies, we first showed that myeloid cells are not able to overcome the blood-brain barrier and infiltrate in the spinal cord after the peripheral nerve injury by SNI model and thus, the microglial activation occurs independent of the infiltration of these cells in this tissue. With regard to DRGs, previous work has shown that there is an increase in the activation markers of macrophages after peripheral nerve injury.Thus, we characterized the subpopulations of monocytes/macrophages in the DRG and we identified CX3CR1+ and CCR2+ cells. Interestingly, when isolating the CX3CR1+ cells, we observed that this cell subtype may be the main cells responsible for the production of inflammatory mediators in the DRG after SNI induction, whereas CCR2+ cells appear to contribute only partially to the production of IL-1? and TNF-? in this tissue, since the expression of these mediators was not completely suppressed in the absence of this cellular subtype. Finally, we investigated the origin of these monocyte subtypes present in the DRG. Through parabiosis between wild type and GFP+ animals, we observed that although there is a small increase of GFP+ cells in the DRG of injured animals, these cells are not macrophages. Corroborating with these data, when performing the wild type parabiosis with CX3CR1GFP /+ CCR2RFP/+ animals, we did not observe the presence of CX3CR1 or CCR2 cells in the GRD after SNI. Finally, our data demonstrate that there are two subpopulations of monocytes in the DRG, one of them residing and contributing effectively to the production of local inflammatory mediators and another population of CCR2 cells that may have a more relevant role at the lesion site and thus, the exacerbation of local inflammation may indirectly interfere, in the activation of the cells present in the DRGs, as well as in the production of inflammatory mediators in the tissue, which will contribute to the development of neuropathic pain.

A dor neuropática é uma condição debilitante causada por danos no sistema nervoso somatossensorial, como lesões dos nervos periféricos. As células do sistema imune, em particular os monócitos/macrófagos, desempenham um papel fundamental no desenvolvimento deste processo. Embora diversos estudos sugiram o envolvimento dessas células na medula espinal e gânglio da raiz dorsal (GRD) após a indução da neuropatia, a caracterização funcional e fenotípica, bem como a origem dessas células nesses órgãos, ainda não está esclarecida. Na medula espinal, estudos recentes têm demonstrado que apesar da massiva ativação e proliferação da micróglia residente, não há recrutamento de células mielóides para esse tecido após a indução da neuropatia, divergindo dos dados anteriormente descritos na literatura. Diante desses estudos controversos, iniciamos nosso trabalho demonstrando que possivelmente as células mielóides não são capazes de ultrapassar a barreira hematoencefálica e infiltrar na medula espinal após a indução da neuropatia periférica pelo modelo de SNI e assim, a ativação microglial ocorre de maneira independente do infiltrado dessas células neste tecido. No que se refere aos GRDs, trabalhos anteriores demonstram que há um aumento dos marcadores de ativação de macrófagos nesse tecido após a lesão periférica. Com isso, nós caracterizamos as subpopulações de monócitos/macrófagos presentes no GRD e identificamos, células CX3CR1+ e células CCR2+. De maneira interessante, ao isolarmos as células CX3CR1+ observamos que esse subtipo celular possa ser as principais células responsáveis pela produção dos mediadores inflamatórios no GRD após indução de SNI, enquanto as células CCR2+ parecem contribuir apenas de maneira parcial para a produção de IL-1? e TNF-? neste tecido, uma vez que a expressão desses mediadores não foi totalmente suprimida na ausência desse subtipo celular. Por fim, investigamos a origem desses subtipos de monócitos presentes no GRD. Por meio da parabiose entre animais wild type e GFP+, observamos que embora haja um pequeno aumento de células GFP+ no GRD de animais lesionados, essas células não são macrófagos. Corroborando com esses dados, ao realizarmos a parabiose de animais wild type com animais CX3CR1GFP/+CCR2RFP/+ não observamos presença de células CX3CR1 ou CCR2 no GRD após SNI. Em conjunto, nossos dados demonstram que existem duas subpopulações de monócitos no GRD, sendo uma delas residente e contribuindo de maneira efetiva para a produção dos mediadores inflamatórios locais e outra população de células CCR2+ que podem ter um papel mais relevante no sítio da lesão e assim, a exacerbação da inflamação local pode interferir indiretamente, na ativação das células presentes nos GRDs, bem como na produção dos mediadores inflamatórios no tecido, que vão contribuir para o desenvolvimento da dor neuropática. / Neuropathic pain is a debilitating disease due to severe damage to the nervous system, induced by peripheral nerve injury. The cells of the immune system, especially monocytes/macrophages, played a critical role in these process. Several projects have been suggested the role of these cells in the spinal cord and dorsal root ganglia (DRG) after neuropathic pain induction, but the functional and phenotypic characterization, as well as the source of cells, is still unclear. In the spinal cord, recent studies have shown that although massive activation and proliferation of the microglial occurred, there is no recruitment of myeloid cells to this tissue after the neuropathic pain induction, but this is contrary to previous findings in the literature. Based on this controversial studies, we first showed that myeloid cells are not able to overcome the blood-brain barrier and infiltrate in the spinal cord after the peripheral nerve injury by SNI model and thus, the microglial activation occurs independent of the infiltration of these cells in this tissue. With regard to DRGs, previous work has shown that there is an increase in the activation markers of macrophages after peripheral nerve injury.Thus, we characterized the subpopulations of monocytes/macrophages in the DRG and we identified CX3CR1+ and CCR2+ cells. Interestingly, when isolating the CX3CR1+ cells, we observed that this cell subtype may be the main cells responsible for the production of inflammatory mediators in the DRG after SNI induction, whereas CCR2+ cells appear to contribute only partially to the production of IL-1? and TNF-? in this tissue, since the expression of these mediators was not completely suppressed in the absence of this cellular subtype. Finally, we investigated the origin of these monocyte subtypes present in the DRG. Through parabiosis between wild type and GFP+ animals, we observed that although there is a small increase of GFP+ cells in the DRG of injured animals, these cells are not macrophages. Corroborating with these data, when performing the wild type parabiosis with CX3CR1GFP /+ CCR2RFP/+ animals, we did not observe the presence of CX3CR1 or CCR2 cells in the GRD after SNI. Finally, our data demonstrate that there are two subpopulations of monocytes in the DRG, one of them residing and contributing effectively to the production of local inflammatory mediators and another population of CCR2 cells that may have a more relevant role at the lesion site and thus, the exacerbation of local inflammation may indirectly interfere, in the activation of the cells present in the DRGs, as well as in the production of inflammatory mediators in the tissue, which will contribute to the development of neuropathic pain.