O câncer de mama representa problema mundial de saúde pública e a causa mais frequente de morte por câncer entre as mulheres. A identificação de agentes moduladores de marcas epigenéticas, tais como metilação global do DNA e modificações pós-tradução em histonas, compreende alternativa promissora para estabelecimento de estratégias de controle da carcinogênese mamária. Dentre os nutrientes, o elemento traço essencial selênio (Se) pode ser destacado como agente dietético com potencial anti-câncer de mama e que poderia atuar modulando processos epigenéticos. Entretanto seus mecanismos de ação são pouco elucidados. Este estudo objetivou, assim, identificar efeitos do tratamento com selênio no crescimento e marcas epigenéticas de células de adenocarcinoma mamário humano MCF-7. Células MCF-7, positivas para o receptor de estrógeno, foram tratadas com ácido metilselenínico (MSA) ou selenito de sódio (ST) por diferentes tempos e em diferentes concentrações. Foram avaliados: padrão de proliferação (ensaio cristal violeta) e viabilidade celular (método de exclusão azul de tripan); integridade de membrana plasmática (citometria de fluxo); níveis de fragmentação do DNA (citometria de fluxo), distribuição das fases do ciclo celular (citometria de fluxo); apoptose (citometria de fluxo/ marcação dupla com Anexina V - Iodeto de propídio); níveis de lisina 9 acetilada (H3K9ac) e trimetilada (H3K9me3) em histona H3; níveis de lisina 16 acetilada (H4K16ac) em histona H4 (Western blot); padrão de metilação global do DNA (HPLC-DAD); expressão de gene supressor de tumor (RASSF1a; qPCR) e padrão de metilação da região promotora (RASSF1a e RAR&#946;; MS-PCR); expressão da enzima DNA metilstransferase 1 (DNMT1) (Western Blotting). Comparado ao grupo controle de células não tratadas (GC), ambos os tratamentos com MSA ou ST inibiram a proliferação e viabilidade de células MCF-7 de forma dose e tempo dependente. Ambas as formas químicas de Se induziram a parada do ciclo celular, aumentando (p< 0,05) a proporção de células na fase G2/M e reduzindo (p< 0,05) a proporção daquelas nas fases G0/G1 e S. Os tratamentos com MSA favoreceram a morte celular por apoptose, que foi associada com nível de fragmentação de DNA aumentado (p< 0,05), e reduzida ruptura da membrana plasmática associada com a exposição aumentada (p< 0,05) de fostadilserina. Por outro lado, o ST aumentou (p< 0,05) a fragmentação do DNA e (p< 0,05) a positividade ao iodeto de propídio associado à indução de necrose (p< 0,05). Dentre os mecanismos epigenéticos investigados, 1,6&#181;M e 2&#181;M reduziram a acetilação de H3K9ac (72h; p< 0,05) e aumentaram a de H4K16ac (96h; p< 0,05). O tratamento por 96h com 2&#181;M de MSA reduziu (p< 0,05) a metilação de H3K9me3. Ambos MSA e ST não alteraram o padrão de metilação global do DNA, mas reduziram a expressão de DNMT1, após 96h com 2&#181;M de MSA (p< 0,001; 88%) e após 120h com 10&#181;M de ST (p< 0,001; 96%). ST, mas não o MSA, aumentou (p< 0,05; 45%) a expressão do gene RASSF1a. Em ambos os grupos tratados com MSA ou ST, bem como no GC, a região promotora dos genes RASSF1a e RAR estavam predominantemente metiladas. Estes resultados fornecem evidências de que as ações anti-câncer de mama de compostos do selênio dependem de sua forma química. Além disso, a modulação de processos epigenéticos parecem ser relevantes para as ações inibitórias do MSA em células de câncer de mama. / Breast cancer is a global public health problem and the most frequent cause of cancer death among women. The identification of agents able to modulate epigenetic marks, such as global DNA methylation and histone post-translational modifications, comprises promising alternative for establishing control strategies on mammary carcinogenesis. Among the nutrients, the essential trace element selenium (Se) can be highlighted as a dietary agent with potential anti-breast cancer and could act by modulating epigenetic processes. However its mechanisms of action are poorly understood. This study aimed, therefore, to identify the effects of selenium treatment on growth and epigenetic marks of MCF-7 human breast adenocarcinoma cells. MCF-7 cells, positive for estrogen receptor, were treated with methylseleninic acid (MSA) or sodium selenite (ST) for different times and in different concentrations. Evaluated parameters included: cell proliferation (crystal violet assay) and cell viability (trypan blue exclusion assay); plasma membrane integrity (flow cytometry); levels of DNA fragmentation (flow cytometry), apoptosis (flow cytometry - double labeling with Annexin V - propidium iodide); distribution of cell cycle phases (flow cytometry); acetylated (H3K9ac) and trimethylated (H3K9me3) lysine 9 levels on histone H3; acetylated (H4K16ac) lysine 16 level on histone H4 (Western blot); global DNA methylation (HPLC-DAD); tumor suppressor gene expression (RASSF1a; qPCR) and promoter methylation (RASSF1a, RAR&#946;; MS-PCR); DNA methyltransferase 1 (DNMT1) expression (Western blot). Compared to untreated cells (controls), both MSA and ST inhibited (p< 0.05) MCF-7 cell proliferation and viability in a dose- and time-dependent manner. Treatments with MSA favored cell death by apoptosis, that was associated with increased (p< 0.05) DNA fragmentation level, reduced plasma membrane rupture associated with high (p< 0.05) phosphatidylserine exposure. On the other hand, ST increased (p< 0.05) DNA fragmentation, enhanced (p< 0.05) propidium iodide positivity associated to necrosis induction (p< 0,05). Both chemical forms of Se induced nduced cell cycle arrest, increasing (p< 0.05) the proportion of cells in G2/M phase and reducing (p< 0.05) the proportion of those in G0/G1 and S phases. Among the epigenetic mechanisms investigated, 1.6&#181;M and 2&#181;M of MSA reduced acetylation of H3K9ac (72h, p< 0.05) and increased the H4K16ac (96h, p< 0.05). The treatment for 96h with 2&#181;M of MSA reduced (p< 0.05) the H3K9me3 methylation. Neither MSA nor ST altered (p> 0.05) global DNA methylation, while both compounds reduced (p< 0.05) DNMT1 protein expression, after 96h with 2&#181;M of MSA (p< 0.001; 88%) and after 120h with 10&#181;m of ST (p< 0.001; 94%). ST, but not MSA, increased (p< 0.05; 45%) RASSF1a gene expression. In control and Se-treated cells promoter regions of RASSF1a and RAR&#946; were predominantly methylated. These results provide evidence that the anti-breast cancer actions of selenium compounds depend on its chemical form. Additionally, modulation of epigenetic processes seems to represent a relevant feature of MSA inhibitory effects in breast cancer cells.

O câncer de mama representa problema mundial de saúde pública e a causa mais frequente de morte por câncer entre as mulheres. A identificação de agentes moduladores de marcas epigenéticas, tais como metilação global do DNA e modificações pós-tradução em histonas, compreende alternativa promissora para estabelecimento de estratégias de controle da carcinogênese mamária. Dentre os nutrientes, o elemento traço essencial selênio (Se) pode ser destacado como agente dietético com potencial anti-câncer de mama e que poderia atuar modulando processos epigenéticos. Entretanto seus mecanismos de ação são pouco elucidados. Este estudo objetivou, assim, identificar efeitos do tratamento com selênio no crescimento e marcas epigenéticas de células de adenocarcinoma mamário humano MCF-7. Células MCF-7, positivas para o receptor de estrógeno, foram tratadas com ácido metilselenínico (MSA) ou selenito de sódio (ST) por diferentes tempos e em diferentes concentrações. Foram avaliados: padrão de proliferação (ensaio cristal violeta) e viabilidade celular (método de exclusão azul de tripan); integridade de membrana plasmática (citometria de fluxo); níveis de fragmentação do DNA (citometria de fluxo), distribuição das fases do ciclo celular (citometria de fluxo); apoptose (citometria de fluxo/ marcação dupla com Anexina V - Iodeto de propídio); níveis de lisina 9 acetilada (H3K9ac) e trimetilada (H3K9me3) em histona H3; níveis de lisina 16 acetilada (H4K16ac) em histona H4 (Western blot); padrão de metilação global do DNA (HPLC-DAD); expressão de gene supressor de tumor (RASSF1a; qPCR) e padrão de metilação da região promotora (RASSF1a e RAR&#946;; MS-PCR); expressão da enzima DNA metilstransferase 1 (DNMT1) (Western Blotting). Comparado ao grupo controle de células não tratadas (GC), ambos os tratamentos com MSA ou ST inibiram a proliferação e viabilidade de células MCF-7 de forma dose e tempo dependente. Ambas as formas químicas de Se induziram a parada do ciclo celular, aumentando (p< 0,05) a proporção de células na fase G2/M e reduzindo (p< 0,05) a proporção daquelas nas fases G0/G1 e S. Os tratamentos com MSA favoreceram a morte celular por apoptose, que foi associada com nível de fragmentação de DNA aumentado (p< 0,05), e reduzida ruptura da membrana plasmática associada com a exposição aumentada (p< 0,05) de fostadilserina. Por outro lado, o ST aumentou (p< 0,05) a fragmentação do DNA e (p< 0,05) a positividade ao iodeto de propídio associado à indução de necrose (p< 0,05). Dentre os mecanismos epigenéticos investigados, 1,6&#181;M e 2&#181;M reduziram a acetilação de H3K9ac (72h; p< 0,05) e aumentaram a de H4K16ac (96h; p< 0,05). O tratamento por 96h com 2&#181;M de MSA reduziu (p< 0,05) a metilação de H3K9me3. Ambos MSA e ST não alteraram o padrão de metilação global do DNA, mas reduziram a expressão de DNMT1, após 96h com 2&#181;M de MSA (p< 0,001; 88%) e após 120h com 10&#181;M de ST (p< 0,001; 96%). ST, mas não o MSA, aumentou (p< 0,05; 45%) a expressão do gene RASSF1a. Em ambos os grupos tratados com MSA ou ST, bem como no GC, a região promotora dos genes RASSF1a e RAR estavam predominantemente metiladas. Estes resultados fornecem evidências de que as ações anti-câncer de mama de compostos do selênio dependem de sua forma química. Além disso, a modulação de processos epigenéticos parecem ser relevantes para as ações inibitórias do MSA em células de câncer de mama. / Breast cancer is a global public health problem and the most frequent cause of cancer death among women. The identification of agents able to modulate epigenetic marks, such as global DNA methylation and histone post-translational modifications, comprises promising alternative for establishing control strategies on mammary carcinogenesis. Among the nutrients, the essential trace element selenium (Se) can be highlighted as a dietary agent with potential anti-breast cancer and could act by modulating epigenetic processes. However its mechanisms of action are poorly understood. This study aimed, therefore, to identify the effects of selenium treatment on growth and epigenetic marks of MCF-7 human breast adenocarcinoma cells. MCF-7 cells, positive for estrogen receptor, were treated with methylseleninic acid (MSA) or sodium selenite (ST) for different times and in different concentrations. Evaluated parameters included: cell proliferation (crystal violet assay) and cell viability (trypan blue exclusion assay); plasma membrane integrity (flow cytometry); levels of DNA fragmentation (flow cytometry), apoptosis (flow cytometry - double labeling with Annexin V - propidium iodide); distribution of cell cycle phases (flow cytometry); acetylated (H3K9ac) and trimethylated (H3K9me3) lysine 9 levels on histone H3; acetylated (H4K16ac) lysine 16 level on histone H4 (Western blot); global DNA methylation (HPLC-DAD); tumor suppressor gene expression (RASSF1a; qPCR) and promoter methylation (RASSF1a, RAR&#946;; MS-PCR); DNA methyltransferase 1 (DNMT1) expression (Western blot). Compared to untreated cells (controls), both MSA and ST inhibited (p< 0.05) MCF-7 cell proliferation and viability in a dose- and time-dependent manner. Treatments with MSA favored cell death by apoptosis, that was associated with increased (p< 0.05) DNA fragmentation level, reduced plasma membrane rupture associated with high (p< 0.05) phosphatidylserine exposure. On the other hand, ST increased (p< 0.05) DNA fragmentation, enhanced (p< 0.05) propidium iodide positivity associated to necrosis induction (p< 0,05). Both chemical forms of Se induced nduced cell cycle arrest, increasing (p< 0.05) the proportion of cells in G2/M phase and reducing (p< 0.05) the proportion of those in G0/G1 and S phases. Among the epigenetic mechanisms investigated, 1.6&#181;M and 2&#181;M of MSA reduced acetylation of H3K9ac (72h, p< 0.05) and increased the H4K16ac (96h, p< 0.05). The treatment for 96h with 2&#181;M of MSA reduced (p< 0.05) the H3K9me3 methylation. Neither MSA nor ST altered (p> 0.05) global DNA methylation, while both compounds reduced (p< 0.05) DNMT1 protein expression, after 96h with 2&#181;M of MSA (p< 0.001; 88%) and after 120h with 10&#181;m of ST (p< 0.001; 94%). ST, but not MSA, increased (p< 0.05; 45%) RASSF1a gene expression. In control and Se-treated cells promoter regions of RASSF1a and RAR&#946; were predominantly methylated. These results provide evidence that the anti-breast cancer actions of selenium compounds depend on its chemical form. Additionally, modulation of epigenetic processes seems to represent a relevant feature of MSA inhibitory effects in breast cancer cells.

Esse trabalho apresenta resultados de modificações estruturais, caracterizações e aplicações de derivados de quitosana como carreadores de fármacos. Derivados anfifílicos de quitosana, contendo grupos hidrofílicos e grupos hidrofóbicos, foram caracterizados por técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN1H), espectroscopia na região do infravermelho (IV), espectroscopia na região do UV-Vis, técnicas termoanalíticas (termogravimetria (TGA), termogravimetria derivada (DTG), análise térmica diferencial (DTA) e calorimetria exploratória diferencial (DSC)), fluorescência no estado estacionário, espalhamento dinâmico de luz (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os resultados de caracterização mostraram que as sínteses propostas foram realizadas com sucesso. A determinação da concentração de agregação crítica (CAC) e os estudos de DLS e MET confirmam que os derivados se auto-organizam em solução aquosa formando agregados com diâmetros variando entre 230 a 500 nm. Esses valores, associados aos potenciais zeta obtidos (+14,1 mV a +44,8 mV), demonstram que os agregados são estáveis em solução, característica fundamental para aplicação no transporte de fármacos. A capacidade de encapsulamento do fármaco quercetina por esses derivados foi avaliada por estudos de incorporação utilizando a espectroscopia UV-Vis. Os resultados obtidos demonstraram que o comportamento dos derivados depende de parâmetros como o grau de hidrofilicidade e grupo hidrofílico, grau de hidrofobicidade e pH do meio de encapsulamento, possibilitando controlar a quantidade de fármaco contida nos carreadores. A atividade biológica dos agregados formados pelos derivados de quitosana foi testada em células de adenocarcinoma de mama (MCF-7) e os resultados indicaram baixa toxicidade dos carreadores, além de potencialização do efeito terapêutico do fármaco. Estudos de microscopia confocal de varredura a laser evidenciaram que agregados marcados com proteína verde fluorescente com afinidade por quitosana (CAP-sfGFP) foram internalizados pelas células MCF-7. Resultados de hemocompatibilidade indicaram que os polímeros apresentam baixa destruição de glóbulos vermelhos do sangue e liberação de hemoglobina. Portanto, esses derivados possuem características adequadas para aplicação no transporte e liberação controlada de fármacos. / This thesis presents results of structural modifications, characterizations and applications of chitosan derivatives as drug carriers. Amphiphilic derivatives of chitosan containing hydrophilic and hydrophobic groups were characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy (RMN1H), infrared spectroscopy (IV), uv-vis spectroscopy, thermoanalytical techniques (thermogravimetry (TGA), derivative thermogravimetry (DTG), differential thermal analysis (DTA) and differential exploratory calorimetry (DSC)), fluorescence, dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (MET). The characterization results showed that the proposed syntheses were successfully performed. The critical aggregation concentration (CAC), DLS and MET studies confirmed that the derivatives self-assembled in aqueous solution forming aggregates with diameters ranging from 230 to 500 nm. These values, associated with zeta potentials (+14.1 mV to +44.8 mV), demonstrate that the aggregates were stable in solution. The ability to encapsulate quercetin by these derivatives was assessed by incorporation studies using UV-Vis spectroscopy. The results showed that the behavior of the derivatives depends on parameters such as the degree of hydrophilicity and hydrophilic groups, degree of hydrophobicity and pH of the encapsulation medium. The biological activity of the aggregates formed by the chitosan derivatives was tested in breast cancer cells (MCF-7) and the results indicated low toxicity of the carriers, in addition to improving the therapeutic effect of the drug. Confocal laser scanning microscopy studies showed that aggregates stained with chitosan-affinity protein (CAP-sfGFP) were internalized by MCF-7 cells. Hemolysis assays showed good hemocompatibility of chitosan derivatives. Therefore, the derivatives have suitable characteristics for application as drug delivery systems.

Esse trabalho apresenta resultados de modificações estruturais, caracterizações e aplicações de derivados de quitosana como carreadores de fármacos. Derivados anfifílicos de quitosana, contendo grupos hidrofílicos e grupos hidrofóbicos, foram caracterizados por técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN1H), espectroscopia na região do infravermelho (IV), espectroscopia na região do UV-Vis, técnicas termoanalíticas (termogravimetria (TGA), termogravimetria derivada (DTG), análise térmica diferencial (DTA) e calorimetria exploratória diferencial (DSC)), fluorescência no estado estacionário, espalhamento dinâmico de luz (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os resultados de caracterização mostraram que as sínteses propostas foram realizadas com sucesso. A determinação da concentração de agregação crítica (CAC) e os estudos de DLS e MET confirmam que os derivados se auto-organizam em solução aquosa formando agregados com diâmetros variando entre 230 a 500 nm. Esses valores, associados aos potenciais zeta obtidos (+14,1 mV a +44,8 mV), demonstram que os agregados são estáveis em solução, característica fundamental para aplicação no transporte de fármacos. A capacidade de encapsulamento do fármaco quercetina por esses derivados foi avaliada por estudos de incorporação utilizando a espectroscopia UV-Vis. Os resultados obtidos demonstraram que o comportamento dos derivados depende de parâmetros como o grau de hidrofilicidade e grupo hidrofílico, grau de hidrofobicidade e pH do meio de encapsulamento, possibilitando controlar a quantidade de fármaco contida nos carreadores. A atividade biológica dos agregados formados pelos derivados de quitosana foi testada em células de adenocarcinoma de mama (MCF-7) e os resultados indicaram baixa toxicidade dos carreadores, além de potencialização do efeito terapêutico do fármaco. Estudos de microscopia confocal de varredura a laser evidenciaram que agregados marcados com proteína verde fluorescente com afinidade por quitosana (CAP-sfGFP) foram internalizados pelas células MCF-7. Resultados de hemocompatibilidade indicaram que os polímeros apresentam baixa destruição de glóbulos vermelhos do sangue e liberação de hemoglobina. Portanto, esses derivados possuem características adequadas para aplicação no transporte e liberação controlada de fármacos. / This thesis presents results of structural modifications, characterizations and applications of chitosan derivatives as drug carriers. Amphiphilic derivatives of chitosan containing hydrophilic and hydrophobic groups were characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy (RMN1H), infrared spectroscopy (IV), uv-vis spectroscopy, thermoanalytical techniques (thermogravimetry (TGA), derivative thermogravimetry (DTG), differential thermal analysis (DTA) and differential exploratory calorimetry (DSC)), fluorescence, dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (MET). The characterization results showed that the proposed syntheses were successfully performed. The critical aggregation concentration (CAC), DLS and MET studies confirmed that the derivatives self-assembled in aqueous solution forming aggregates with diameters ranging from 230 to 500 nm. These values, associated with zeta potentials (+14.1 mV to +44.8 mV), demonstrate that the aggregates were stable in solution. The ability to encapsulate quercetin by these derivatives was assessed by incorporation studies using UV-Vis spectroscopy. The results showed that the behavior of the derivatives depends on parameters such as the degree of hydrophilicity and hydrophilic groups, degree of hydrophobicity and pH of the encapsulation medium. The biological activity of the aggregates formed by the chitosan derivatives was tested in breast cancer cells (MCF-7) and the results indicated low toxicity of the carriers, in addition to improving the therapeutic effect of the drug. Confocal laser scanning microscopy studies showed that aggregates stained with chitosan-affinity protein (CAP-sfGFP) were internalized by MCF-7 cells. Hemolysis assays showed good hemocompatibility of chitosan derivatives. Therefore, the derivatives have suitable characteristics for application as drug delivery systems.